إعداد وتوصيف Nanoliposomes لفخ البروتينات الكروية المائية النشطة بيولوجيا
Summary
تصف هذه الدراسة الترطيب الكلاسيكي باستخدام طريقة فيلم الدهون الرقيقة لإعداد nanoliposome متبوعاً بتوصيف الجسيمات النانوية. يتم تغليف بروتين 47 كيلودا-هيدروفيليك وكروي، تارين، بنجاح كاستراتيجية لتحسين الاستقرار، وتجنب التطهير السريع، وتعزيز الإفراج الخاضع للرقابة. ويمكن تكييف هذه الطريقة مع تغليف الجزيئات الكارهة للماء.
Abstract
وقد تم تطبيق كبسولات نانوية Liposome لأغراض عديدة في الصناعات الصيدلانية ومستحضرات التجميل والصناعات الغذائية. وتشمل سمات liposomes توافقها البيولوجي، والتحلل البيولوجي، وعدم المناعة، وعدم السمية، والقدرة على فخ كل من المركبات المائية والكارهة للماء. يتم تطبيق الترطيب الكلاسيكي للأغشية الدهنية رقيقة في المذيبات العضوية هنا كتقنية لتغليف التارين، اللكتين النبات، في nanoliposomes. يتم وصف حجم Nanoliposome، والاستقرار، وكفاءة الفخ، والتوصيف المورفولوجي بالتفصيل. يتم إعداد nanoliposomes باستخدام 1,2-ديوليل-سن-الجلسرين-3-فوسفوتيلونامين (DOPE)، 1،2-ديستيويل-سن-غليسيرو-3-فوسفويلولامين-N-[أمينو(البولي ايثيلين غليكول)-2000] (ملح الأمونيوم. DSPE-MPEG 2000)، وcholesterylhemisuccinate (CHEMS) كمكونات رئيسية. يتم حل الدهون لأول مرة في الكلوروفورم للحصول على فيلم الدهون رقيقة التي يتم إعادة ترطيبها في وقت لاحق في محلول كبريتات الأمونيوم التي تحتوي على البروتين أن تكون محاصرة وحضانة بين عشية وضحاها. ثم، يتم تطبيق تقنيات sonication والنتوء لتوليد الحويصلات unilamellar نانوية الحجم. يتم تحديد حجم ومؤشر التشتت المتعدد للnanovesicles عن طريق تشتت الضوء الديناميكي، في حين يتم تقييم مورفولوجيا النانوفيكل عن طريق المسح المجهري الإلكتروني. يتم تحديد كفاءة الفخ من خلال نسبة كمية البروتين غير المغلف إلى الكمية الأصلية من البروتين المحملة في البداية. يتم الحصول على liposomes متجانسة مع متوسط حجم 155 نانومتر وقيمة مؤشر تعدد التشتت من 0.168. يتم تحقيق كفاءة عالية في الفخ من 83٪.
Introduction
وقد ارتفع في السنوات الأخيرة عدد الدراسات التي تحقق في كفاءة نظم إيصال المخدرات. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة إلى تجاوز قيود مثل التطهير السريع، وسوء التوزيع البيولوجي، والذوبان في درجة الحموضة الفسيولوجية وعدم كفاية الكمية الخلوية. وقد برز استخدام النظم النانوية مع التقدم المحرز مؤخرا في علاج السرطان، المطبق لزيادة التركيز داخل الخلايا من الأدوية داخل الخلايا السرطانية مع تقليل السمية في الخلايا السليمة. وعلاوة على ذلك، يجري حالياً تطبيق الجسيمات النانوية التي يتم الحصول عليها من مجموعة مختلفة من المواد (أي البوليمرات، والدندريمرات، والدهون، والفيروسات، والأنابيب النانوية الكربونية، والمعادن مثل أكسيد الحديد والذهب) لتعزيز آثار مكافحة السرطان والحد من النظم سمية1. وقد تم تطبيق كبسولات نانوية Liposome على وجه الخصوص لأغراض عديدة في الصناعات الصيدلانية ومستحضرات التجميل والصناعات الغذائية. في السنوات الأخيرة ، تم صياغة مختلف المنتجات المغذيات مثل الفيتامينات والانزيمات والمستخلصات العشبية باستخدام تكنولوجيا liposome2.
Liposomes هي حويصلات كروية تتكون من واحد أو أكثر من ثنائيات الدهون متحدة المركز التي شكلت تلقائيا من خلال تشتت الدهون الفوسفاتية في وسائل الإعلام المائية3،4. وتقع الرؤوس القطبية للفوسفوليبيدات على الأسطح الخارجية والداخلية للأغشية، في اتصال مع البيئة المائية. وعلى النقيض من ذلك، تشكل سلاسل الأحماض الدهنية النواة الكارهة للماء من الأغشية ومحمية من الماء5. بعض الصفات من liposomes التي تجعلها نظم تسليم المخدرات جذابة وتشمل التوافق البيولوجي، والتحلل البيولوجي، وعدم المناعة، وعدم السمية، والقدرة على فخ كل من المركبات المائية والكارهة للماء6.
يمكن إعداد Liposomes باستخدام خطوات عمليات مختلفة مثل التحريض، سونيكيشن، البثق، التحلل، التجميد، والذوبان. وتشمل الطرق الكلاسيكية التبخر في المرحلة العكسية، وحقن المذيبات، وغسيل الكلى المنظفات. الطريقة الأكثر تطبيقًا هي ترطيب الدهون الرقيقة، والمعروفة أيضًا باسم طريقة Bangham، والتي تستخدم للحصول على أشكال الدهون الحويصلية7و8و9و10و11. Lamellarity (عدد ثنائيات الدهون الفوسفاتية) وحجم الجسيمات هي المعلمات الكلاسيكية المستخدمة لوصف liposomes إما 1) حويصلات unilamellar (ULVs)، التي شكلتها ثنائية الدهون الفوسفاتية فريدة من نوعها ومتفاوتة في الحجم على النحو التالي: ‘1) unilamellar الصغيرة الحويصلات (سيارات الدفع الرباعي، ~ 0.02-0.20 ميكرومتر)، 2) حويصلات unilamellar كبيرة (LUVs، ~ 0.2-1.0 ميكرومتر)، و 3) الحويصلات يونيلاميلار العملاقة (GUVs، > 1 ميكرومتر)؛ أو 2) الحويصلات multilamellar (MLVs، >0.1 م) 3،12. حجم الحويصلة هو معلمة هامة عند النظر في الاستخدام العلاجي، كما هو الحال في علاج السرطان، حيث أحجام <200 نانومتر مثالية للسماحnanovesicles لعبور الحاجز البطانية والوصول إلى الأنسجة الورمية 4.
هنا، تم وصف إجراء التغليف بعد الترطيب الكلاسيكي لتقنية فيلم الدهون رقيقة7 باستخدام التارين، وهو نبات اللكتين يتميز بالبروتين الكروي المائي13،14،15 . يتم إنتاج الحويصلات نانوية الحجم من خلال بما في ذلك خطوات sonication والنتوء في التقنية الرئيسية، مما أدى إلى nanovesicless s liposomal مستقرة مع كفاءة عالية الفخ16.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم اختبار البروتوكول الموضح هنا من قبل Correa et al.16 لتغليف التارين، وهو مناعي ومضاد للورم تنقية من كولواسيا ايسكولنتا22. وأسفرت المنهجية عن نتائج ناجحة، مما سمح بإنتاج نانوليبوسومات مستقرة ذات حجم مناسب للتطبيقات العلاجية. صياغة يعرض الإفراج عن تسيطر عليها في مستويات درجة الحموضة المختلفة في ظل الظروف الفسيولوجية. كما أنه يقوي الخصائص الدوائية التارين، مثل تثبيط الورم الأرومي الدبقي البشري U-87 MG وسرطان الثدي MDA-MB-231 خطوط الخلايا وتحفيز خلايا نخاع العظام الفئران. لم يظهر الإعداد اللبوسومال أي آثار سامة في خلايا الفئران صحية16.
الطريقة الكلاسيكية، التي وصفها لأولمرة Bangham وآخرون 7، يسمح لإنتاج الحويصلات الشحمية متعددة اللاملار كبيرة، غير متجانسة في الحجم والشكل. يتم تطبيق تعديلات هذه الطريقة، كما ورد في هذه الدراسة، بنجاح من خلال إدراج خطوات إضافية مثل سونيكيشن والنتوء من خلال غشاء البولي 0.2 م. وهذا يسمح بإنتاج تشتت أكثر تجانسا فيما يتعلق بالحجم في نطاق نانومتر16،23،24. ولذلك، لضمان تحقيق نتائج ناجحة، ينبغي اتباع بروتوكول التغليف والتركيبة الدهنية الموصوفة هنا بدقة.
تم اختيار تكوين nanoliposome بعناية من أجل ضمان تشكيل غشاء ثنائي الطبقة مع DOPE، MPEG 2000-DSPE، وCHEMS كمكونات رئيسية. هذه هي المكونات غشاء الحيوان الطبيعي ثنائي الطبقة وهذه الأخيرة يمكن أن تضفي سيولة للهندسة النانوية، وضمان تطبيق واسع النطاق لتسليم مركب نشط بيولوجيا في البشر.
الأننيوليبوسوم pegylation ضروري لضمان استقرار هيكل liposome. يؤدي غياب PEG إلى توسيع الحجم، ومؤشر تعدد التشتت العالي، وانخفاض كفاءة الفخ. يمكن الحصول على النتائج المثلى مع DOPE كعنصر liposome الرئيسي. ومع ذلك، هذا هو فوسفوليبيد عالية التكلفة. ويمكن تحقيق التكاليف المالية لإنتاج nanoliposome عن طريق استبدال DOPE مع الدهون المماثلة الأخرى مثل DOPC (1,2-ديوليل-سن-غليسيرو-3-فوسفوليو). CHEMS هو جزيء الكولسترول الموجود بشكل طبيعي في أغشية الخلايا الحيوانية، والتي لا ينبغي استبعادها من الصياغة، حيث أنه من المهم ضمان سيولة الدهون ثنائية الطبقة وليونة16.
ويمكن أيضا تكييف جوانب أخرى من بروتوكول التغليف. ويمكن بسهولة استبدال الكلوروفورم المستخدم في حل المكونات الدهنية بالميثانول مع عدم وجود آثار على متوسط الحجم، والتجانس، وكفاءة الفخ. ومع ذلك، يمكن أن يحدث بعض تسرب البروتين في التخزين تحت 4 °C16. خطوة الحضانة بين عشية وضحاها مع محلول كبريتات الأمونيوم التي تحتوي على التارين ليست إلزامية. ومع ذلك، للراحة يمكن أن يؤديها مع عدم وجود ضرر للخصائص البيوفيزيائية nanoliposomal، تغليف، أو خسائر كفاءة الاستقرار، كما هو مبين من قبل كوريا وآخرون16. يتم تنفيذ خطوة البثق في درجة حرارة الغرفة، والتي يمكن أن تقلل من معدل التدفق بين المحاقن إذا تم استخدام غشاء حجم المسام 0.1 م.
للتغلب على هذه المشكلة، ينبغي النظر في استخدام غشاء حجم المسام 0.2 م أو تسخين حامل الطارد فوق درجة حرارة انتقال الدهون. يجب على المحلل أن يكون حريصا على عدم الإضرار بالدهون أو البروتين الذي يمكن تعطيله وفقدان النشاط البيولوجي. بدلاً من ذلك، يمكن أن يكون إعداد liposomal dialyzed ضد HBS بدلاً من ultracentrifugation، وذلك باستخدام غشاء قطع وفقا ً للوزن الجزيئي البروتيني. إن اختيار الطبيعة الكيميائية للحاجز الذي يتم فيه تعليق النانوليبوسومبعد التموجات الفائقة يرتبط مباشرة بتطبيقه اللاحق. وبما أن وجهات نظر هذه الدراسة تشمل في الاختبارات الحية والمختبرية، فإن التعليق في محلول ملحي مُسحَرِّف من HEPES كان كافياً لضمان عدم وجود آثار سامة للخلايا ومجموعة من الأس الهيدروجيني قريبة من الظروف الفسيولوجية.
يجب أن تعامل liposomes بدقة، على غرار الخلايا الحية، للحصول على صور SEM أعلى جودة. إجراءات التثبيت والتجفيف مهمة لضمان التصور من الحويصلات سليمة أصغر التي تدعم القيم أعلى من 20 كيلو فولت في ظل ظروف فراغ. الشكل 2 A، B يعرض الحويصلات نانوية متوافقة مع إجراء البثق. التصور من الحويصلات تتراوح بين 51-396 نانومتر ممكن إذا تم تنفيذ إعداد عينة كافية بعد هذا الإجراء. وتشمل الخطوات التثبيت، والتجفيف عن طريق زيادة تركيزات الإيثانول، والجفاف الكيميائي لتجنب تشكيل المجاميع والحويصلات الممزقة الناجمة عن الفراغ وشعاع الإلكترون. من ناحية أخرى، يظهر الشكل 2C،D الحويصلات الدهنية المجففة تحت درجة حرارة الغرفة ولا تخضع لأي علاجات الموصوفة هنا، مما يعني أنها كانت مستعدة بشكل غير كاف. نتيجة لعدم كفاية الإجراء ، يتم تشكيل الحويصلات العملاقة ، حتى بعد البثق من خلال غشاء حجم المسام 0.2 ميكرومتر. كما لوحظ تمزق الحويصلات في كلتا اللوحتين نتيجة للفراغ وتلف شعاع الإلكترون.
وقد تم استكشاف الحويصلات Nanoliposome كتغليف ونظام التسليم للجزيئات الكارهة للماء، بما في ذلك ريسفيراترول (3،5،4′-تريهيدروكسيستيلبين)، وهو مركب نشط بيولوجيا ضد خلايا سرطان القولون والمستقيم. يمكن إجراء التغليف التغلب على الذوبان الفقراء من المركبات الدهنية بالإضافة إلى توفير التوافق البيولوجي، والتحلل البيولوجي، وعدم المناعة، والخصائص غير السمية المتأصلة في كبسولات نانوية liposome25. ويجب أن تؤخذ في الاعتبار تعديلات البروتوكولات تبعاً لمسار الإدارة والغرض منها، مثل وضع تركيبات جديدة للإدارة عن طريق الفم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون مرافق مختبر توصيف المواد المتعددة المستخدمين التابعة لـ COPPE/UFRJ، ومختبر الفحص المجهري الإلكتروني، ومختبر توصيف المواد المتعددة المستخدمين؛ إلى الدكتور أدالبرتو فييرا، والدكتورة جنيفر لوي، ورافائيل ليندوسو، أساتذة في جامعة ريو دي جانيرو الاتحادية، الاتحاد من أجل الجمهورية، البرازيل، لاستخدام جهاز الطرد المركزي الفائق؛ إلى الدكتور ألكسندر غويديس توريس ودانيال بيروني، أستاذان في الجامعة الاتحادية في ريو دي جانيرو، الاتحاد من أجل الجمهورية، البرازيل، لاستخدام المبخر الدوار؛ إلى البروفيسور رولاند بودماير والدكتور أندري داشيفسكي من جامعة فراي في برلين، اللذين ساعدا في توفير الموارد، وزودا منهجيات جديدة، وأشرفا على ACNTF خلال زمالة Erasmus+ لمدة 6 أشهر في ألمانيا؛ إلى الدكتورة روسانا ثيري وألين فرنانديز، أستاذة وفنية في الجامعة الاتحادية في ريو دي جانيرو، الاتحاد من أجل الديمقراطية والملكية الأردنية، البرازيل، لاستخدام زيتازير مالفيرن؛ إلى بلوما غينثر وتايسا رودريغيز، أستاذ وفني في الجامعة الاتحادية دو ريو دي جانيرو، الاتحاد من أجل العدالة والتنمية، البرازيل، لاستخدام SEM؛ إلى الدكتورة راشيل آن هاوزر ديفيس، الباحثة في مؤسسة أوزوالدو كروز، للرواية. تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, Brasil (CAPES) – Finance Code 001 (grant No. 1627392; 1811605); بواسطة Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (grant No. E-26/202.815/2018؛ E-26/202.815/2018؛ E-26/203.039/2015 و E-26/202.860/2016)؛ مقدم من المجلس الوطني للدراسات العلمية (CNPq) (منحة رقم 406601/2018-6)، وFinanciadora de Estudos e Projetos (FINEP).
Materials
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich Co | A4418 | |
| Analitycal Ballance Mettler H10Tw | Mettler Inc. | 417870 | |
| Beckman DU-640 Spectrophotometer | Beckman Coulter | 8043-30-1090 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Co | 5470 | |
| BUCHI Rotavapor R-300 Rotary Evaporator with Controller and V-300 Pump | Thermo Fischer Scientific | 05-001-022PM | |
| CHEMS (cholesterylhemisuccinate) | Sigma-Aldrich Co | C6512 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich Co | 48520-U | CAUTION |
| Copper (II) Sulfate (Pentahydrate) | Sigma-Aldrich Co | 209198 | |
| Coverslips (13mm diameter) | Thermo Scientific Nunc | EW-01839-00 | |
| DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) | Lipoid GMBH | 565600.1 | |
| Ethanol Absolute | Sigma-Aldrich Co | 32205 | |
| Folin -Ciocalteu phenol reagent | Sigma-Aldrich Co | F9252 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich Co | G5882 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3375 | |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich Co | 440191 | CAUTION |
| JEOL JSM-6460 LV Sacnning Electron Microscope | JEOL LTD | ||
| Mini Extruder 7 | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| MPEG 2000-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) | Lipoid GMBH | 588200.1 | |
| Optima L-90k Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| Phosphate Buffer | Sigma-Aldrich Co | P3619 | |
| Poli-L-lysine | Sigma-Aldrich Co | P8920 | |
| Potassium L-tartrate monobasic | Sigma-Aldrich Co | 243531 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich Co | S7795 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co | S7653 | |
| Sodium Deoxycholate (DOC) | Sigma-Aldrich Co | D6750 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich Co | L3771 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich Co | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich Co | RES20908-A7 | |
| TESCAN VEGA 3 Scanning Electron Microscope | Tescan | #657874 | |
| Trichloroacetic Acid (TCA) | Sigma-Aldrich Co | 91230 | |
| Zetasizer Nano ZSP | Malvern Panalytical LTD | ||
| Ultrasonic cleaning bath model 2510 | Branson |
References
- Wang, X., Wang, Y., Chen, Z. G., Shin, D. M. Advances of cancer therapy by nanotechnology. Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 41 (1), 1 (2009).
- Keller, B. C. Liposomes in nutrition. Trends in Food Science & Technology. 12 (1), 25-31 (2001).
- Frézard, F., Schettini, D. A., Rocha, O. G., Demicheli, C. Lipossomas: propriedades físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de antimônio. Quimica Nova. 28 (3), 511-518 (2005).
- Ferreira, D. d. S., Lopes, S. C. d. A., Franco, M. S., Oliveira, M. C. pH-sensitive liposomes for drug delivery in cancer treatment. Therapeutic Delivery. 4 (9), 1099-1123 (2013).
- Papachristos, A., Pippa, N., Ioannidis, K., Sivolapenko, G., Demetzos, C. Liposomal forms of anticancer agents beyond anthracyclines: present and future perspectives. Journal of Liposome Research. 25 (2), 166-173 (2015).
- Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Research Letters. 8 (1), 102 (2013).
- Bangham, A., Standish, M. M., Watkins, J. C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. Journal of Molecular Biology. 13 (1), 238-252 (1965).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4194-4198 (1978).
- Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 298 (4), 1015-1019 (1973).
- Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid/detergent mixed micelles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 640 (1), 252-262 (1981).
- Szebeni, J., et al. Oxidation and denaturation of hemoglobin encapsulated in liposomes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 798 (1), 60-67 (1984).
- Coelho, J. F., et al. Drug delivery systems: Advanced technologies potentially applicable in personalized treatments. EPMA Journal. 1 (1), 164-209 (2010).
- Pereira, P. R., et al. Purification and characterization of the lectin from taro (Colocasia esculenta) and its effect on mouse splenocyte proliferation in vitro and in vivo. The Protein Journal. 33 (1), 92-99 (2014).
- Pereira, P. R., et al. Structural analysis and binding properties of isoforms of tarin, the GNA-related lectin from Colocasia esculenta. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1854 (1), 20-30 (2015).
- Pereira, P. R., et al. High-resolution crystal structures of Colocasia esculenta tarin lectin. Glycobiology. 27 (1), 50-56 (2016).
- Correa, A., Vericimo, M. A., Dashevskiy, A., Pereira, P. R., Paschoalin, V. M. F. Liposomal Taro Lectin Nanocapsules Control Human Glioblastoma and Mammary Adenocarcinoma Cell Proliferation. Molecules. 24 (3), 471 (2019).
- Peterson, G. L., et al. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Analytical Biochemistry. 83 (2), 346-356 (1977).
- Merida, L. A., et al. Tarin stimulates granulocyte growth in bone marrow cell cultures and minimizes immunosuppression by cyclo-phosphamide in mice. PLoS ONE. 13 (11), e0206240 (2018).
- Murtey, M. D., Ramasamy, P., Janecek, M., Kral, R. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy – Life Sciences. Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , (2016).
- Andrade, C. A., Correia, M. T., Coelho, L. C., Nascimento, S. C., Santos-Magalhães, N. S. Antitumor activity of Cratylia mollis lectin encapsulated into liposomes. International Journal of Pharmaceutics. 278 (2), 435-445 (2004).
- dos Santos Ferreira, D., et al. Development of a bone-targeted pH-sensitive liposomal formulation containing doxorubicin: physicochemical characterization, cytotoxicity, and biodistribution evaluation in a mouse model of bone metastasis. International Journal of Nanomedicine. 11, 3737 (2016).
- Pereira, P. R., Corrêa, A. C. N. T. F., Vericimo, M. A., Paschoalin, V. M. F. Tarin, a Potential Immunomodulator and COX-Inhibitor Lectin Found in Taro (Colocasia esculenta). Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 17 (4), 878-891 (2018).
- Olson, F., Hunt, C., Szoka, F., Vail, W., Papahadjopoulos, D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 557 (1), 9-23 (1979).
- Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods in Enzymology. 367, 3 (2003).
- Soo, E., et al. Enhancing delivery and cytotoxicity of resveratrol through a dual nanoencapsulation approach. Journal of Colloid and Interface Science. 462, 368-374 (2016).
