Een Luciferase-fluorescerende reporter influenza virus voor Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie
Summary
Influenza A virussen (IAVs) zijn besmettelijke respiratoire pathogenen die jaarlijkse epidemieën en occasionele pandemie veroorzaken. Hier beschrijven we een protocol voor het opsporen van virale infecties in vivo met behulp van een roman recombinant plaats en fluorescentie-uitdrukken van bi-reporter iav (birflu). Deze aanpak biedt onderzoekers een uitstekend hulpmiddel om IAV in vivo te bestuderen.
Abstract
Influenza A virussen (IAVs) veroorzaken menselijke respiratoire aandoeningen die gepaard gaat met aanzienlijke gezondheids-en economische gevolgen. Net als bij andere virussen, het bestuderen van IAV vereist het gebruik van moeizame secundaire benaderingen voor het opsporen van de aanwezigheid van het virus in geïnfecteerde cellen en/of in diermodellen van infectie. Deze beperking is onlangs omzeild met de generatie van recombinant IAVs uitdrukken gemakkelijk traceerbaar fluorescerende of bioluminescente (Luciferase) reporter eiwitten. Echter, onderzoekers zijn gedwongen te selecteren fluorescentie of plaats reporter genen als gevolg van de beperkte capaciteit van de iav genoom voor het opnemen van buitenlandse sequenties. Om deze beperking te overwinnen, hebben we een recombinant replicatie-competente bi-reporter iav (birflu) die stabiel zowel een fluorescerende als een plaats reporter gen uitdrukken om iav-infecties in vitro en in vivo gemakkelijk bij te houden. Hiertoe werden de virale niet-structurele (NS) en hemagglutininen (ha) virale segmenten van influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) aangepast om respectievelijk de fluorescerende Venus en de bioluminescente nanoluc plaats eiwitten te coderen. Hier beschrijven we het gebruik van BIRFLU in een muismodel van IAV-infectie en de detectie van beide reporter genen met behulp van een in vivo imaging System. Met name hebben we een goede correlatie waargenomen tussen de uitingen van zowel verslaggevers als virale replicatie. De combinatie van geavanceerde technieken in de moleculaire biologie, dierlijke onderzoeks-en beeldvormings technologieën, biedt onderzoekers de unieke kans om deze tool te gebruiken voor influenza onderzoek, waaronder de studie van interacties met virus-host en dynamiek van virale infecties. Belangrijk is dat de haalbaarheid om het virale genoom genetisch te veranderen om twee vreemde genen uit verschillende virale segmenten uit te drukken, mogelijkheden biedt om deze aanpak te gebruiken voor: (i) de ontwikkeling van nieuwe IAV-vaccins, (II) de generatie van recombinante IAVs die kan worden gebruikt als vaccin vectoren voor de behandeling van andere humane pathogenen infecties.
Introduction
Influenza A virus (IAV) is een gehuld enkelvoudig, negatief-zintuig gesegmenteerd RNA-virus van de orthomyxoviridae familie1,2,3. De World Health Organization (WHO) schat 3-5 miljoen jaarlijkse influenza cases en meer dan 250.000 sterfgevallen van influenza wereldwijd4,5,6. Groepen die bijzonder kwetsbaar zijn voor influenza zijn ouderen, immuungecompromitteerde individuen en kinderen7,8,9,10,11. Hoewel vaccins beschikbaar zijn en de meest voorkomende en effectieve interventie tegen virale infectie vormen, kan iav zich snel ontwikkelen en ontsnappen aan de bestaande immuniteit3,12,13, 14 , 15. de heropkomst van een pandemie H1N1-stam in 2009 en de opkomst van pathogene iav herhaalt de voortdurende bedreiging voor de volksgezondheid van de mens wereldwijd4,16.
Tijdens een epidemie of pandemie is het van cruciaal belang om snel de pathogeniteit en overdraagbaarheid van nieuw geïsoleerde virussen te bepalen. Momenteel beschikbare technieken om het virus te detecteren zijn tijdrovend en vereisen soms het gebruik van moeizame benaderingen, die de voltooiing van deze analyses kunnen vertragen17,18,19,20. Bovendien zijn aanwezige virale testen moeilijk op te schalen, wat nodig kan zijn tijdens een uitbraak. Ten slotte wordt het gebruik van gevalideerde diermodellen van infectie, zoals muizen, cavia’s en fretten routinematig gebruikt en zijn ze van vitaal belang voor het bestuderen van influenza-infecties, immuunresponsen en de werkzaamheid van nieuwe vaccins en/of antivirale middelen. Echter, deze modellen zijn beperkend als gevolg van het onvermogen om te observeren virale dynamiek in real time; Dit beperkt de studies tot statische beeldvorming van virale infecties21,22,23,24,25. Dieren die in deze assays worden gebruikt, worden ook geëchaniseerd om de virale last te bepalen, waardoor het aantal dieren dat nodig is om deze studies af te ronden26toeneemt. Om al deze beperkingen te omzeilen, vertrouwen veel onderzoekers op het gebruik van recombinant replicatie-competent, reporter-uitdrukken van IAVs, die in staat zijn om virologische assays te versnellen en virale belasting en verspreiding in vivo in real-time te detecteren26 ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Belangrijk is dat deze verslaggevende iavs op dezelfde manier kan repliceren naar wild-type (WT) iavs in celcultuur en in diermodellen van infectie33,42.
Fluorescerende en bioluminescente eiwitten zijn twee reporter systemen die vaak worden gebruikt door onderzoekers vanwege hun gevoeligheid, stabiliteit en gebruiksgemak. Daarnaast is er enorme ondersteuning en vooruitgang in fluorescerende en bioluminescente proteïne detectietechnologieën43,44,45,46,47,48 . Fluorescerende eiwitten en plaats hebben verschillende eigenschappen die hen in staat stellen om te gloeien, specifiek verschillend in hoe opgewonden toestanden worden gegenereerd en hoe licht wordt gedetecteerd43,44,45, 46,47,48. Fluorescerende eiwitten worden eerst opgewekt door het absorberen van energie, die vervolgens wordt vrijgegeven als licht op een andere golflengte als de moleculen dalen tot een lagere energietoestand43. Aan de andere kant, bioluminescentie is afgeleid van een chemische exotherme reactie waarbij een substraat, zuurstof, en soms ATP met het oog op de productie van licht45. Als gevolg van de verschillende eigenschappen van deze twee soorten reporter eiwitten, een misschien voordeliger dan de andere afhankelijk van de studie van belang. Terwijl fluorescerende eiwitten op grote schaal worden gebruikt om cellulaire lokalisatie te observeren28,41, hun in vivo signalen hebben onvoldoende intensiteit en zijn vaak verduisterd door autofluorescentie in levende weefsels49. Daarom vertrouwen onderzoekers op luciferasen om de virale dynamiek in levende organismen te evalueren, hoewel fluorescerende eiwitten de voorkeur kunnen krijgen voor ex-vivo-studies50,51,52,53. In tegenstelling tot fluorescerende eiwitten, luciferases zijn handiger voor in vivo studies en meer toepasbaar in niet-invasieve benaderingen26,27,28,29,30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. uiteindelijk, op basis van het type studie, moeten onderzoekers kiezen tussen het gebruik van een fluorescerende of een plaats reporter-eiwit als hun uitlezen, die hun studie onderwerpt aan een trade-off van functionaliteiten en gevoeligheden, en ernstig het nut van de recombinant reporter virussen beperkt. Bovendien is er bezorgdheid over de correlatie tussen de uitdrukking van verschillende reporter genen met behulp van fluorescentie-of plaats-systemen en virale replicatie of verspreiding, die de interpretatie van de verkregen gegevens met Reporter-het uitdrukken van IAVs.
We hebben deze beperking overwonnen door het genereren van een recombinant replicatie-competente bi-reporter iav (birflu) die codeert voor zowel een fluorescerende als een plaats eiwit in hetzelfde virale genoom55 (Figuur 1). Hier werd nanoluc plaats (nluc), een klein en helder bioluminescente eiwit48, stroomopwaarts geplaatst van de hemagglutinine (ha) sequentie in het virale ha segment van influenza a/Puerto Rico/08/1934 H1N1 (PR8)24,33, 40,55,56,57. Daarnaast werd Venus, een veelgebruikt monomere fluorescerende proteïne, ingebracht in het niet-structurele (NS) virale segment32,33,36,41,55. Aangezien birflu codeert voor zowel fluorescerende als plaats-reporter genen, kan ofwel reporter proteïne signaal worden gebruikt als uitlezen om virale replicatie en verspreiding in vitro of in vivo55te bepalen. Meer informatie over het genereren en in vitro of in vivo karakterisering van BIRFLU vindt u in onze recente publicatie55. BIRFLU kan worden gebruikt om de effectiviteit van antivirale geneesmiddelen te testen of om antilichamen te neutraliseren via een nieuwe fluorescentie-en bioluminescente gebaseerde microneutralisatie test55. Bovendien kan BIRFLU ook gebruikt worden om de virale dynamiek te evalueren in een muismodel van infectie55. In dit manuscript beschrijven we de procedures voor het karakteriseren van BIRFLU55 in vitro en het bestuderen van birflu infectie bij muizen met behulp van in vivo luminescentie beeldvormingssystemen voor de detectie van nluc in vivo of van Venus ex vivo.
De combinatie van geavanceerde technieken in de moleculaire biologie, dierlijke onderzoeks-en beeldvormings technologieën, brengt onderzoekers de unieke kans om BIRFLU te gebruiken voor IAV-onderzoek, inclusief de studie van interacties met virus-host, dynamiek van virale infectie; de ontwikkeling van nieuwe vaccin benaderingen voor de therapeutische behandeling van IAV-infecties of het mogelijke gebruik van IAV als vaccin vector voor de behandeling van andere pathogenen infecties.
Protocol
Alle protocollen met betrekking tot muizen zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) en het institutioneel Comité voor bioveiligheid (IBC) aan de Universiteit van Rochester, school voor geneeskunde en tandheelkunde. Alle experimenten uitgevoerd bij dieren volgen de aanbevelingen in de gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren van de nationale Onderzoeksraad58. Het Vivarium en de divisie van laboratorium dierengeneeskunde faciliteiten aan de school voor geneeskunde en tandheelkunde aan de Universiteit van Rochester is geaccrediteerd door de vereniging voor de beoordeling en accreditatie van laboratorium Animal Care (AALAC) International en voldoen aan federale en staatswetten en National Institutes of Health (NIH) beleid. Bij het werken met muizen is een goede persoonlijke beschermingsuitrusting (PBM) vereist. Vergelijkbare beleidsregels en vereisten moeten worden geïmplementeerd bij het uitvoeren van experimenten die worden beschreven in dit manuscript bij elke instelling. 1. gebruik van kleine gewervelde dieren Koop vijf tot zeven weken oude vrouwelijke BALB/c muizen en onderhoud ze in de dierenverzorgings faciliteit onder specifieke pathogeen-vrije condities. Bij muizen aankomst tot de vastberaden faciliteiten, laat periode van rust gedurende 4 – 5 dagen toe om dieren te laten acclimeren aan hun nieuwe omgeving. Plaats maximaal 5 muizen per kooi volgens de IACUC-protocollen.Opmerking: Bij experiment conclusie, om ervoor te zorgen dat het dier is dood, muizen werden geëerd met behulp van twee goedgekeurde procedures, rekening houdend met het dat de tweede een fysieke methode moet zijn. In deze studie, na muizen infectie met BIRFLU en in vivo beeldvorming, worden dieren geëuseerd met een dodelijke dosis van 2, 2, 2-tribromoethanol (TBE), en door het snijden van de hepatische ader als de fysieke secundaire methode zoals we eerder hebben aangetoond23. 2. bioveiligheid Opmerking: In dit manuscript werd birflu opgewekt in de ruggengraat van influenza A/Puerto Rico/08/34 H1N1 (PR8), een gemeenschappelijk door muizen aangepast laboratorium iav-stam23,32,33,56. Het virus werd gegenereerd met behulp van eerder beschreven plasmide gebaseerde omgekeerde genetica benaderingen en een volledige beschrijving van de generatie, en in vitro en in vivo karakterisering van BIRFLU kan worden gevonden in onze recente publicatie55. Alle procedures met betrekking tot IAV-infecties (in vitro of in vivo) werden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast onder bioveiligheidsniveau (BSL)-2 condities. Let op: Een passend bioveiligheidsniveau moet worden bepaald in overeenstemming met een risicobeoordeling van bioveiligheid. Bij de instelling waar de experimenten zullen worden uitgevoerd, moet aanvullende informatie worden geraadpleegd over het uitvoeren van risicobeoordelingen voor bioveiligheid en de totstandbrenging van een doeltreffende bioveiligheidscontainment. Reinig de bioveiligheidskasten met 70% ethanol of chloordioxide-ontsmettingsmiddel voor en na het uitvoeren van alle experimentele procedures. Voor muizen werk, steriliseren alle dissectie materiaal (schaar, ontleden Tang, enz.) en de dounce homogenisator voor en na het gebruik ervan. Gooi alle biologisch materiaal dat is geproduceerd tijdens de procedures onder de juiste IBC-en IACUC-richtlijnen weg. 3. in vitro karakterisatie van de VOGELGRIEP (figuur 2) Opmerking: Raadpleeg tabel 1 voor alle samenstellingen van buffer en media. Analyseer de eiwit expressie door fluorescentie (Figuur 2a) en indirecte immunofluorescentie (Figuur 2b) Een dag voor de infectie, zaad 24-put platen met Madin-Darby Canine nier (MDCK) epitheelcellen (1 x 105 cellen/goed, triplicates) in weefselcultuur media en onderhouden van de platen in een incubator 37 ° c met 5% Co2. Bereid voldoende putjes om alle gekozen antilichamen in zowel met een mock geïnfecteerde als met BIRFLU geïnfecteerde cellen te evalueren.Opmerking: We raden aan de cellen onder een lichte Microscoop te visualiseren om een monolaag te bevestigen voordat de virale infectie wordt gestart. Een 90% confluentie monolaag van MDCK cellen op het moment van infectie wordt aanbevolen. Bereid verdunningen van WT of BIRFLU IAVs in infectie media en besmetten de geseede MDCK-cellen met een veelheid van infectie (MOI) van 0,1 plaquevormende eenheden (PFU) per cel in een eindvolume van 0,25 mL/goed van infectie media. Verwijder het weefselkweek medium uit stap 3.1.1 en was de MDCK-cellen tweemaal met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg de virus verdunningen van 3.1.2 toe aan de MDCK-cellen en plaats de platen op een schommel platform voor 1 uur bij kamertemperatuur om virale adsorptie toe te staan.Opmerking: Mock-geïnfecteerde cellen worden geïnfiltreerd alleen met infectie media in de afwezigheid van virus. Na virale adsorptie (stap 3.1.3), verwijder het virale entmateriaal door aspiratie en voeg 1 ml post-infectie media toe met 1 μg/ml tpck-behandelde trypsine aan elk goed. Incuberen de cellen voor 18 uur in een 5% CO2 bevoficeerde incubator bij 33 °c. Na 18 uur van de infectie, verwijder de weefselkweek supernatant van de 24-put platen (3.1.4). Fixeer en permeabiliseer de cellen met 0,25 mL/put van fixatie/permeabilization oplossing voor 20 min bij kamertemperatuur.Opmerking: Bereid de fixatie/permeabilization oplossing in een rook afzuigkap om blootstelling aan formaldehyde te voorkomen. Verwijder de fixatie/permeabilization-oplossing uit stap 3.1.5, was de cellen tweemaal met 1x PBS en inbroed de cellen met 0,25 mL/put van blokkerende oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur.Opmerking: Ga naar de volgende stap of bewaarcellen in de blokkerende oplossing bij 4 °C ‘s nachts. Verwijder de blokkerende oplossing (stap 3.1.6) en Voeg 0,25 mL/goed (1 μg/mL) van een monoklonaal antilichaam van de muis (MAb) toe tegen het IAV-nucleoproteïne, NP (HB-65) of een 1:1000-verdunning van een konijnen polyklonale antilichaam (pAb) tegen NLuc (Zie de tabel met materialen) beide verdund in antilichaamverdunnings oplossing (1x PBS, 2,5% BSA) en inbroed de cellen gedurende 1 uur bij 37 °C. Verwijder het primaire antilichaam uit stap 3.1.7, spoel de cellen driemaal met 1x PBS en inbroed ze met 0,25 mL/put van een Texas Red-geconjugeerde anti-muis of anti-konijn secundaire antilichamen (Zie de tabel met materialen) verdund 1:200 in antilichaam verdunnings oplossing.Opmerking: Celkernen kunnen tegelijkertijd worden gekleurd door 0,5 μg/mL 4 ‘, 6 ‘-diamidino-2-fenylindole (DAPI) toe te voegen aan dezelfde secundaire antilichaam oplossing. Inincuberen de cellen gedurende 1 uur bij 37 °C in het donker. Andere secundaire antilichamen geconjugeerd met andere fluor Foren kunnen worden gebruikt. Verwijder het secundaire antilichaam en de DAPI uit stap 3.1.8, was de cellen drie keer met 1x PBS. Na het wassen, laat de cellen in 0,25 mL/goed van 1x PBS. Plaats de plaat op het podium van een fluorescentiemicroscoop om de expressie van Venus en Nluc Reporter te detecteren, en NP uit geïnfecteerde cellen met behulp van de juiste fluorescerende filters. Leg beelden vast met behulp van een fluorescentiemicroscoop (vergroting van 20x) en voeg ze samen met een beeldbewerkingssoftware (Figuur 2a, B). Analyseer de activiteit Nluc (figuur 2c) en virale replicatie (figuur 2D). Een dag voor de infectie, zaad 12-well platen met MDCK cellen (2 x 105cellen/Nou, triplicaten) met behulp van weefselcultuur media in een 37 ° c incubator met 5% Co2 te bereiken ongeveer 90% confluentie op het moment van infectie.Opmerking: Controleer vóór de infectie de cellen onder een microscoop om een monolaag van MDCK-cellen te controleren. De dag van infectie bereidt verdunningen van de WT-en BIRFLU virussen in infectie media om de MDCK-cellen te infecteren (stap 3.2.1.) in drievand met een MOI van 0,001 PFU in 0,5 mL/goed. Verwijder het weefselkweek medium en was de MDCK-cellen tweemaal met 1x PBS. Voeg de virus verdunningen toe aan de monolagen van MDCK en laat 1 uur virale adsorptie bij kamertemperatuur op een schommel platform. Na virale adsorptie, verwijder het virus entmateriaal en voeg toe 1,5 mL post-infectie media met 1 μg/mL TPCK-behandelde trypsine, aan elk goed. Geïncubeerd geïnfecteerde cellen in een 5% Co2 bevoficeerde incubator bij 33 °c en verzamel supernatanten op de aangegeven tijdstippen aangegeven in stap 3.2.4. Bij 24, 48, 72 en 96 h post infectie (p.i.) Verzamel 150 μL weefselkweek supernatant van elk goed en bewaar de monsters in een micro centrifugebuis bij-80 °C om de Nluc assays en virale titraties uit te voeren. Volg de aanwijzingen van de fabrikant om de Nluc-activiteitstest uit te voeren. Ontdooi eerst de weefselkweek supernatant opgeslagen bij-80 °C (stap 3.2.4) op ijs.Opmerking: Raadpleeg de aanbevelingen van de fabrikant en Optimaliseer de assay indien nodig. Bereid de plaats-testoplossing (Zie de tabel met materialen) door het nluc-substraat 1:50 met de verdunningsbuffer te verdunnen. Meng in een witte vlakke bodem 96-well micro Plate voor plaats-assays 25 μL plaats-assay oplossing met 10 tot 25 μl van de verzamelde weefselkweek supernatant monsters. Inbroed de mix gedurende 2 – 3 minuten voor het meten van de luminescentie met behulp van een luminometer (figuur 2c).Opmerking: Aanwezigheid van infectieuze virale deeltjes in de weefselkweek supernatanten wordt bepaald door fluorescentie-immuunfocus assay (Venus) of indirecte immunofluorescentie (virusantigeen kleuring) zoals eerder beschreven23,32, 33,56. Een dag voor virale titraties, zaad MDCK cellen in een 96-well plate (2 x 104 cellen/Nou, triplicates) met weefselkweek media en toestaan cellen te bereiken 90% samenvloeiing door de tijd van infectie in een incubator ingesteld op 37 ° c met 5% Co2. Gebruik de weefselkweek supernatant monsters die op ijs ontdooid waren (stap 3.2.4.). Voeg 90 μL infectie media toe aan elk van de putjes in een nieuwe 96-putplaat en voeg vervolgens 10 μL van de ontdooide weefselkweek supernatant (stap 3.2.4) toe aan de eerste put (rij A). Gebruik een pipet met meerdere kanalen om 10 μL te mengen en over te brengen van rij A naar rij B. Verander de uiteinden tussen verdunningen en meng goed.Opmerking: Deze procedure moet worden herhaald tot de laatste rij (H). We raden aan om virale titraties in triplicaten uit te voeren voor een nauwkeurige meting van virale titers. Verwijder het weefselkweek medium uit de MDCK-cellen in de 96-put-platen (stap 3.2.7) en was tweemaal met 1x PBS. Voeg 50 μL van de supernatant verdunningen van de replica 96-goed plaat met de virus verdunningen (stap 3.2.8) toe aan elk goed in de 96-goed plaat die MDCK-cellen bevat. Inbroed de 96-put plaat op een schommel platform voor 1 uur bij kamertemperatuur om virale adsorptie toe te staan. Na virale adsorptie, verwijder het entmateriaal en voeg 100 μL/goed toe van post-infectie media met 1 μg/mL TPCK-behandelde trypsine. Incuberen geïnfecteerde cellen gedurende 12 uur in een incubator van 33 °C met 5% CO2. Aangezien BIRFLU Venus uitdrukt, kan het aantal geïnfecteerde cellen direct worden geteld met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Als alternatief kunnen virale Antilichaamtiters worden bepaald door indirecte immunofluorescentie zoals eerder beschreven met behulp van een antilichaam tegen een virale proteïne23,56,57,59. Voor deze laatste, doorgaan met het fixeren/permeabiliseren van de cellen en vlek met behulp van de anti-NP mAb HB-65 zoals beschreven in paragraaf 4,4. Bepaal de virale Antilichaamtiters door het aantal TL-vormende eenheden (FFU)/mL te tellen met behulp van de formule: ((aantal FFU) x 20 x 1/verdunning (figuur 2D). 4. in vivo karakterisering van de VOGELGRIEP (Figuur 3 en Figuur 4) Muis infectieOpmerking: intranasale infectie van muizen werd gedaan zoals eerder beschreven23. Voor een meer gedetailleerd protocol van IAV-infectie in vivo met behulp van het muismodel van infectie, raden we aan de video te bekijken die is gekoppeld aan de vorige publicatie23. Deze sectie bevat alleen een overzicht van de stappen die nodig zijn voor muis infectie met BIRFLU. Inspecteer de muizen om hun gezondheid en het algehele fysieke uiterlijk te evalueren. Bereid de verdunning van de BIRFLU in 1x PBS om muizen te beënten met 1 x 106 Pfu van de birflu in een totaal volume van 30 μL/muis. Houd het virus op ijs totdat de muis inoculatie.Opmerking: Mock-geïnfecteerde (1x PBS) muizen zullen nodig zijn als interne controle voorbeeld vorming. Plaats mock-geïnfecteerde muizen in een andere kooi dan met BIRFLU besmette dieren. Anesthetize vijf-tot-zeven-week-oude vrouwelijke Balb/c muizen intraperitoneaal met 240 – 250 mg/kg tribromoethanol (TBE) door het inbrengen van de naald in de caudal 2/3 van de rechterkant van de buik. Vervolgens keert u de muis terug naar de kooi en wacht u ongeveer 5 minuten. Controleer of de muis verdokt is voordat de virus inoculatie wordt door afwezigheid van de teen-pinch reflex.Opmerking: Injecteerbare sedativa worden aanbevolen over geïnhaleerde sedativa voor influenza infecties in vivo, als de laatste kan het gedrag en de opname van het virus te wijzigen door de luchtweg epitheel. Bovendien kunnen ze ook invloed hebben op de lokale immuunresponsen van de longen en interfereren met de in vivo beeldvorming van geïnfecteerde muizen. Tot slot hebben geïnhaleerde sedativa een verminderde duur van het effect, wat een probleem zou zijn voor in vivo beeldvorming van de geïnfecteerde dieren. De muizen intranasaal met de 30 μL van de bereide BIRFLU verdunning inoculeren. Controleer of de muizen goed ademen voordat ze naar de kooi terugkeren. Bioluminescentie bewaking van muizen geïnfecteerd met BIRFLU (figuur 4a)Opmerking: in dit manuscript wordt de expressie van Nluc of Venus en virale replicatie in de longen van met BIRFLU geïnfecteerde muizen vastgesteld op 3 dagen na de infectie. De aard van bioluminescentie beeldvorming maakt herhaalde monitoring van de Nluc-expressie in individuele met BIRFLU besmette dieren mogelijk, zonder dat ze voor elk experimenteel tijdpunt moeten worden geëeuthanreerd. Een in vivo imaging systeem met een Isofluraan anesthesie spruitstuk is nodig om de beschreven experimentele procedures uit te voeren. Zie de tabel met materiaal voor meer informatie over het beeldvormings instrument en de beeld software die wordt gebruikt voor de beeld verwerving en gegevensanalyse. Scheer de muizen borst om het bioluminescentie signaal te verbeteren. Open de imaging software en druk op initialiseren. Stel vervolgens de parameters in die worden gebruikt, inclusief het instellen van de beeldvormings modus op Bioluminescentie, automatisch opslaan, belichtingstijd naar auto, open filter, enz. Zodra de machine volledig is geïnitialiseerd, zet het Isofluraan anesthesie systeem aan. Plaats dieren in de anesthesie kamer. Muizen zijn tegelijkertijd en licht verdoofd met een mengsel van zuurstofgas en verdampt 1 – 2% isoflurane. Zodra muizen verdoeseerd zijn, dien je het Nluc substraat (Zie de tafel van de materialen) verdund 1:10 in 1x PBS (eindvolume 100 μL/muis) via de retro-orbitale route met behulp van een injectiespuit met een naald van 22 G. Onmiddellijk na nluc reagens administratie, plaats de dieren in het beeldvormings instrument met hun kisten naar boven gericht en snuit in de variëteit kegel om dieren verdoofd tijdens beeldvorming te houden. Direct na het sluiten van de imager deur, klikt u op verwerven in het softwareprogramma (Afbeelding 4a, top). Na de beeldvorming worden de muizen naar hun kooien teruggehaald totdat ze volledig zijn hersteld en de Isofluraan vaporizer uitzetten. Ga vervolgens verder met de ex vivo imaging van muizen longen om de genexpressie van Venus Reporter te evalueren (paragraaf 4,3). Gebruik de imaging software tools om de verkregen bioluminescentie gegevens te analyseren. Gebruik de ROI van het gereedschap (regio van belang) om het specifieke signaal aan te duiden en flux metingen uit te voeren in het gebied van belang (meestal rond de borst) (Afbeelding 4a, onder). Hoewel de ROI-vorm irrelevant is, hebben grotere ROIs over het algemeen de voorkeur om het hele signaal diffusie gebied vast te leggen. Klik op meten. Evalueer de bioluminescentie in fotonen , omdat het een absolute fotomon-emissiemeting biedt die vergelijkbaar is met output metingen die door verschillende parameters of beeldvormings instrumenten worden geleverd. Fluorescentie analyse bij muizen die besmet zijn met BIRFLU (Figuur 3 en figuur 4b) Verzamel de muis longen na in vivo beeldvorming, zoals eerder beschreven23. Kort, euthaniseer muizen met een dodelijke dosis van TBE (500 mg/kg). Desinfecteer de incisieplaats met 70% ethanol. Met een scalpel, maak een incisie van het borstbeen naar de basis van de buik en snijd vervolgens van de onderkant van de incisie aan de zijkanten met een schaar. Snijd vervolgens de hepatische ader (tweede fysische euthanasie methode) om het dier te ontluchten.Opmerking: Om een hoog achtergrond signaal tijdens de beeldvorming te voorkomen, is het belangrijk om de hoeveelheid bloed in de longen te minimaliseren (zie hieronder). Plaats de muis in dorsale recumbency en gebruik de schaar om het borstvlies te snijden en de ribbenkast te openen. Verwijder vervolgens de longen door het uiteinde van de luchtpijp met een schaar te snippen terwijl u de longen zachtjes met een tang vasthoudt. Plaats de longen in een 6-put-plaat met 2 mL 1x PBS en was de longen drie keer met 1x PBS.Opmerking: Reinig en Desinfecteer de ontsnij gereedschappen tussen elk dier om verontreiniging tussen de monsters te voorkomen. Start de software voor het verzamelen van afbeeldingen door op initialiseren te klikken en de parameters voor imaging in te stellen, inclusief het instellen van de beeldvormings modus op fluorescentie, automatisch opslaan, belichtingstijd tot auto, excitatie (500 nm) en emissie (540 nm) filters. Wanneer de machine is geïnitialiseerd, plaats de longen in een zwarte achtergrond lade, zorg ervoor dat de weefsels van elkaar worden gescheiden, Introduceer de lade in de imager en klik op verwerven op het beeldvormings systeem programma na het sluiten van de imager deur ( Afbeelding 4B, boven). Verwijder na het beeld de weefsels onmiddellijk en bewaar ze op ijs (4 °C) als de monsters op dezelfde dag worden verwerkt; of op een buis en droogijs om ze snel te bevriezen, voordat ze worden opgeslagen bij-80 °C, als de monsters later op een andere dag zullen worden verwerkt. Voorbeeld verwerking selecteert u het gereedschap ROI en tekent u Rois rond elk van de afzonderlijke longen. Klik op meten. Trek vervolgens met behulp van de resulterende gemiddelde stralings efficiëntie metingen de waarden af van de met mock geïnfecteerde muizen (figuur 4b, onder).Opmerking: bij BIRFLU is er een goede correlatie tussen het niveau van Nluc en Venus expressie en signaal verdeling. Daarom is het belangrijk om de uitdrukking Nluc (hele muis) en Venus (excised longen) van hetzelfde dier te analyseren en dezelfde oriëntatie te behouden. Evaluatie van de BIRFLU replicatie in muizen longen (Figuur 3 en figuur 4c) Homogeniseren muizen longen voor virale titratie met plaque assay zoals eerder beschreven23. Plaats de longen in een Dounce homogenisator met 1 mL gekoelde infectie media. Homogeniseer de longen met de stamper gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur totdat deze volledig is uiteenvallen en bewaar de monsters in een steriele buis bij 4 °C. Centrifugeer de monsters bij 300 x g gedurende 10 minuten en verzamel het supernatant in een steriele buis. Bewaar de monsters op ijs als ze op dezelfde dag zullen worden gebruikt of Vries op-80 °C om virale Antilichaamtiters op een later tijdstip te evalueren.Opmerking: Voor elk Long monster moet een nieuwe Dounce-homogenisator worden gebruikt. Voor het uitvoeren van de plaque Assay, de dag voorafgaand aan het uitvoeren van virale titratie, zaad zes-well platen met MDCK cellen (5 x 105 cellen/goed) in weefselcultuur media. Inincuberen de cellen ‘s nachts op 37 ° c met 5% CO2 te bereiken 90% samenvloeiing volgende dag. Controleer vóór de infectie of de cellen een monolaag vormen onder een lichte Microscoop. Maak 1:10 seriële verdunningen van het supernatant van de gehomogeniseerde monsters (stap 4.4.1) in infectie media. Bereid microcentrifuge buisjes met 540 μL infectie media, voeg 60 μL van het gehomogeniseerde longen monster toe aan de eerste buis, Meng door pipetteren op en neer, en gebruik vervolgens een nieuwe tip, breng 60 μL over naar de volgende buis. Herhaal dit seriële verdunnings proces tot de laatste verdunning.Opmerking: In onze ervaring zijn 7 verdunningen voldoende om virale Antilichaamtiters te bepalen door plaque assay uit de longen van geïnfecteerde muizen. Was de MDCK-cellen (stap 4.4.3) tweemaal met 1x PBS en breng 500 μL van de op serie verdunde monsters naar elke put in de zes-well-plaat. Plaats de platen op een schommel platform en laat de virale absorptie voor 1 uur bij kamertemperatuur optreden. Na 1 uur virale absorptie, verwijder het virale inoculum, voeg 2 mL/put van het overlay-medium met 1 μg/mL TPCK-behandelde trypsine, en inincuberen de cellen bij 33 ° c onder 5% CO2 voor 3 dagen. Fix geïnfecteerde cellen (stap 4.4.6) met 1 mL/goed van 4% formaldehyde verdund in 1x PBS bij kamertemperatuur voor 2 uur, verwijder dan voorzichtig het overlaymedium en voeg 1 mL 1x PBS toe aan elke put. Voor visualisatie van Venus, beeld de zes-well platen met een imaging systeem voor de detectie van fluorescentie.Opmerking: Virale plaques kunnen worden gekleurd met behulp van een beeldbewerkingssoftware (Zie de tabel met materialen). Visualiseer virale plaques door immunokleuring met een anti-Nluc pAb om de Nluc-uitdrukking te evalueren. Verwijder hiervoor de 1x PBS, permeabilize cellen met 0,5 mL/put van permeabilization oplossing voor 15 min bij kamertemperatuur. Verwijder de permeabilization-oplossing, was de cellen drie keer met 1x PBS en blok met 0,5 mL/put van blokkerende oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkerende oplossing uit stap 4.4.9 en inbroed de cellen met 0,5 mL/put van het pAb anti-Nluc verdund 1:1000 in verdunnings oplossing voor 1 uur bij 37 °C. Gebruik ABC alkaline fosfatase Kit en DAB peroxidase substraat Kit volgens de aanbeveling van de fabrikant voor visualisatie van Nluc-uitdrukken plaques. Spoel cellen uit 4.4.10 driemaal met 1x PBS en infiltreer ze met 0,5 ml/goed van biotinyleerd anti-Rabbit secundair antilichaam voor 1 uur bij 37 °c. Verwijder het secundaire antilichaam, was de cellen drie keer met 1x PBS en inincuberen met de ABC-oplossing voor 1 uur bij 37 °C. Was de cellen drie keer met 1x PBS en visualiseer de virale plaques met de DAB HRP substraat Kit. Scan de immuunbevlekte plaques met een conventionele scanner.Opmerking: Andere soortgelijke Kits voor immunokleuring kunnen worden gebruikt. Beits de virale plaques met een Kristalvioletoplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur. Gooi het kristalviolet weg, was de platen drie keer met water, laat de platen drogen en scan de platen opnieuw. Om te bepalen virale titers, tellen de plaques onthuld na kristalviolet kleuring. Scan de plaques met een conventionele scanner. Bereken de virus titer als plaquevormende eenheden (PFU) per mL (PFU/mL). Om de BIRFLU stabiliteit in vivo te beoordelen, berekent u het percentage van de reporter-het uitdrukken van virussen door het tellen van het aantal kristalviolet-gekleurd plaques (aantal infectieuze virussen, stap 4.4.12) en te vergelijken met het aantal Venus-en Nluc-uitdrukken van plaques ( stap 4.4.7 respectievelijk stap 4.4.11).
Representative Results
Aanmaak en karakterisering van de BIRFLU in vitro (figuur 1 en figuur 2) Een recombinant replicatie-competente IAV die twee verschillende reporter genen (BIRFLU) uitdrukt, werd geconstrueerd met behulp van State of the art moleculaire biologie en op plasmide gebaseerde technieken voor reverse genetica (Figuur 1). Hier hebben we ervoor gekozen om nluc te gebruiken vanwege verschillende voordelen ten opzichte van andere luciferases, waaronder zijn kleine formaat, ATP-onafhankelijkheid, grotere intensiteit en geoptimaliseerde ondergrond48,60. Nluc werd gekloond in het ha-segment van de iav PR8 gevolgd door de varkens teschovirus (PTV) 2a decolleté plaats (2a) voor het open Lees frame (ORF) van ha (Figuur 1). De ORF van HA omvatte stille mutaties om de oorspronkelijke verpakkings signalen te verwijderen en elke mogelijke recombinatie te vermijden. Het volledige HA-verpakkings signaal werd voor Nluc toegevoegd om de juiste opname van het gemodificeerde HA-segment in de virion-en Nluc-en HA-expressie uit hetzelfde virale RNA-segment (Figuur 1) mogelijk te maken. Daarnaast werd de fluorescerende proteïne Venus gekloond in een gemodificeerd iav PR8 NS-segment dat de twee virale eiwitten ns1 en nep codeert uit één transcript32,36,41,54, 57. Daartoe werd Venus gefuseerd tot de C-terminal van NS1 en de gehele NEP ORF werd stroomafwaarts gekloond van de PTV 2A decolleté site die werd geplaatst tussen de NS1-Venus en de NEP sequenties (Figuur 1). Uiteindelijk werden deze twee gemodificeerde ha en NS virale plasmide constructies gebruikt in combinatie met de rest van de iav PR8 reverse genetics plasmiden om birflu te genereren (Figuur 1). De in vitro en in vivo karakterisering van BIRFLU is eerder beschreven55. In Figuur 2hebben we in vitro birflu gekarakteriseerd door de expressieniveaus van Venus, NLUC en NP te bepalen met behulp van fluorescentie en indirecte immunofluorescentie benaderingen (Figuur 2a, B). De confluente monolagen van MDCK-cellen waren ofwel mock-geïnfecteerd of geïnfecteerd (MOI 0,1) met WT-of birflu PR8 virussen en bij 18 uur na de infectie werd de Venus expressie direct geëvalueerd met behulp van fluorescentiemicroscopie (Figuur 2a, B). Nluc (Figuur 2a) en NP (Figuur 2b) expressie werden gevisualiseerd door middel van indirecte immunofluorescentie met antilichamen die specifiek waren voor elk eiwit. Zoals verwacht, Venus en Nluc uitdrukking werden gedetecteerd alleen in cellen geïnfecteerd door BIRFLU en niet in cellen geïnfecteerd door WT PR8 virus. Bovendien, indirecte immunofluorescentie microscopie onthuld NP expressie in zowel WT en BIRFLU PR8-geïnfecteerde cellen. Geen expressie van Venus, Nluc of NP werden gedetecteerd, zoals verwacht, in mock-geïnfecteerde cellen (figuur A, B). Om de nluc-uitdrukkings niveaus in vitro te evalueren, werden MDCK-cellen geïnfecteerd (MOI 0,001) met WT-of birflu PR8 virussen en nluc-activiteit in weefselkweek supernatanten werd beoordeeld op 24, 48, 72 en 96 h post-infectie (figuur 2c). Alleen nluc activiteit werd ontdekt in weefselkweek supernatanten van MDCK cellen geïnfecteerd met birflu (figuur 2c). Activiteit van nluc in de weefselkweek supernatanten werd gedetecteerd al 24 h na infectie met hogere expressieniveaus bij 96 h na infectie, hoogstwaarschijnlijk omdat het cytopathische effect (CPE) geïnduceerd tijdens virale infectie het nluc-eiwit behouden in de cel. Om de geschiktheid van de birflu in gekweekte cellen te evalueren, werden groei kinetiek van WT en birflu PR8 virussen ook geëvalueerd (figuur 2D) en de aanwezigheid van infectieuze virus in weefselkweek supernatanten werd bepaald door immuunfocus assay (figuur 2D ). Met name, BIRFLU replicatie kinetiek waren vergelijkbaar met die van WT PR8 virus, hoewel BIRFLU replicatie was enigszins vertraagd en niet bereiken dezelfde virale Antilichaamtiters als WT PR8. BIRFLU was echter in staat om Antilichaamtiters van 5 x 107 Pfu/ml (figuur 2D) te bereiken, wat aangeeft dat de uitdrukking van twee reporter genen in het virale genoom niet significant INTERFEREERT met de BIRFLU replicatie in MDCK-cellen. Het volgen van de BIRFLU infectie bij muizen (Figuur 3 en Figuur 4) Figuur 3 is een schematisch stroomdiagram voor de beoordeling van de birflu dynamiek in een muismodel van iav-infectie. Vijf-tot-zeven weken oude vrouwelijke BALB/C muizen waren ofwel mock-geïnfecteerde met 1x PBS of geïnfecteerd met 1 x 106 Pfu van birflu intra-tranasaal. Op 3 dagen na de infectie werden muizen verdouseerd met Isofluraan en vervolgens geïnjecteerd met Nluc-substraat retro-orbitaal. Alle muizen werden onmiddellijk in het IVIS-instrument geplaatst en het Nluc-signaal werd in vivo beoordeeld met behulp van het IVIS. Vervolgens werden muizen geëerd en longen geoogst. De uitblinkte longen werden vervolgens ex vivo geanalyseerd met behulp van de in vivo Imager om de intensiteit van de fluorescentie via Venus expressie te bepalen. Ten slotte werden muizen longen gehomogeniseerd en werden virale Antilichaamtiters en stabiliteit bepaald door plaque assay. Plaques werden beoordeeld door de directe fluorescentie van Venus, door immunokleuring met antilichamen specifiek voor Nluc en door kristalviolet kleuring. Eerder beschreven replicatie-bevoegde reporter-uitdrukken van IAVs Express een single reporter gen, meestal ofwel een fluorescerende of een bioluminescente eiwit, als surrogaat voor virale infectie en replicatie. Echter, BIRFLU, is in staat om beide soorten reporter genen uit te drukken op virale infectie. Om de correlatie tussen bioluminescentie (in vivo imaging) en fluorescentie (ex vivo imaging) na de BIRFLU infectie te beoordelen, waren vijf tot zeven weken durende vrouwelijke BALB/c-muizen met een mock-besmetting met 1x PBS of geënt met BIRFLU (106 Pfu) intranasaal . Nluc activiteit (figuur 4a) werd geëvalueerd door toediening van nluc substraat geïnjecteerd retro-orbitaal op 3 dagen na infectie met behulp van een in vivo beeld instrument. We kozen ervoor om te evalueren bioluminescentie op dag 3 omdat eerdere studies aangegeven dat iav-replicatie, met inbegrip van PR8, pieken tussen de dagen 2 en 4 post-infectie24,54. Bioluminescentie werd gemonitord (Fig. 4a, boven) en gebruikt om de gemiddelde totale flux (flux (Log10 p/s) (Fig.4a, onder) te berekenen. Zoals voorspeld, geënt muizen met BIRFLU weergegeven hoge bioluminescentie activiteit, maar geen signaal werd gedetecteerd in mock-geïnfecteerde muizen. Daarna werden de longen van geïnfecteerde muizen geoogst en werd de Venus expressie beoordeeld met ex vivo imaging (figuur 4b, boven). Bovendien werd de gemiddelde stralings efficiëntie van de fluorescentie berekend (figuur 4b, onder). De uitblinkte muizen longen werden ook gehomogeniseerd om de virale Antilichaamtiters en de genetische stabiliteit van de BIRFLU in vivo te bepalen (figuur 4c, D). De genetische stabiliteit van de VOGELGRIEP werd geanalyseerd via plaque assay met behulp van de virussen geïsoleerd uit muizen longen en fluorescerende microscopie (Venus, top), immunokleuring (Nluc, Middle) en Crystal Violet kleuring (onder). BIRFLU herstelde van muizen longen kon plaques vormen en drukt stabiel beide reporter genen uit (figuur 4c). Met name observeerden we een goede correlatie tussen bioluminescentie en fluorescentie signalen met virale replicatie. Figuur 1: schematische weergave van IAV PR8 WT en BIRFLU virion structuur en genoom segmenten. IAV worden omgeven door een lipide-dubbellaag met de twee belangrijkste virale glycoproteïnen hemagglutinine (HA; zwart) en neuraminidase (NA; blauw). IAV bevatten acht enkel-streng, negatief-Sense, RNA segmenten (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, en NS). Elk virale segment bevat niet-coderende regio’s (NCR) aan de uiteinden 3 ‘ en 5 ‘ (zwarte dozen). Ook op het 3 ‘ en 5 ‘ uiteinde van de virale (v) Rna’s zijn de verpakkings signalen, verantwoordelijk voor de efficiënte encapsidatie van Vrna’s in ontluikende virionen (witte dozen). IAV PR8 HA en NS virale segmenten en producten zijn in het zwart aangegeven. Sequenties van Nluc, Venus en PTV 2A zijn respectievelijk aangegeven in de vakken rood, groen en gestreept. Ook de schematische weergave van de gewijzigde HA-en NS-segmenten die respectievelijk Nluc en Venus uitdrukken in BIRFLU, is geïndiceerd. Dit cijfer is aangepast van Nogales et al.55. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: in vitro karakteriseren van de vogelgriep. (a, B) Analyse van eiwit expressie door directe fluorescentie en immunofluorescentie. MDCK-cellen waren mock-geïnfecteerd of geïnfecteerd (MOI 0,1) met PR8 WT of BIRFLU virussen. Geïnfecteerde cellen werden vastgesteld op 18 h na infectie om de Venus uitdrukking direct te visualiseren door directe fluorescerende microscopie en om Nluc (A) en virale NP (B) expressie te visualiseren met behulp van specifieke antilichamen en indirecte immunofluorescentie. Nuclei waren bevlekt met DAPI. Representatieve afbeeldingen (vergroting van 20x) worden weergegeven. Schaal staven = 100 μm. (C, D) Groei kinetiek van PR8 WT en BIRFLU. Activiteit van nluc (C) en virale Antilichaamtiters (D) in weefselkweek supernatanten van MDCK cellen geïnfecteerd (MOI 0,001) met WT en birflu PR8 virussen werden beoordeeld op de aangegeven tijdstippen na infectie. Gegevens vertegenwoordigen het middel ± SD van triplicaten. Virale Antilichaamtiters werden bepaald door immuunfocus assay (FFU/mL). Gestippelde lijn staat voor de aantoonbaarheidsgrens (200 FFU/ml). Dit cijfer is aangepast van Nogales et al.55. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: schematische weergave van de studie van de vogelgriep bij muizen. Uitdrukking van Nluc en Venus reporter genen werd geëvalueerd bij muizen geïnfecteerd met 1 x 106 Pfu van birflu met behulp van in vivo of ex vivo beeldvorming. Kort, op dag 1, 5 tot 7 week-oude vrouwelijke BALB/c muizen waren mock-geïnfecteerde (1x PBS) of geënt met 1 x 106 Pfu van birflu intranasally. Op dag 3 na infectie werden muizen mild verdouseerd met behulp van Isofluraan en Nluc substraat werd retro-orbitaal geïnjecteerd. Het nluc-signaal werd direct beoordeeld met behulp van in vivo beeldvorming. Onmiddellijk na de beeldvorming werden muizen geëveniseerd en werd de uitdrukking van Venus in de gehele, uitblinkte longen geanalyseerd met ex vivo beeldvorming. Herstelde muizen longen werden gehomogeniseerd om virale replicatie en stabiliteit te evalueren door plaque test. Pijlen geven correlatie aan tussen fluorescentie (Venus), immunokleuring (Nluc) en kristalviolet kleuring. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: in vivo bioluminescentie en fluorescentie expressie. Vrouwelijke vijf-tot-zeven weken durende BALB/c muizen waren met een mock-geïnfecteerde (1x PBS) of geënt met 1 x 106 Pfu van de birflu intranasally. Na infectie van dag 3 werd de Nluc-activiteit (a) in de hele muis bepaald. Representatieve afbeeldingen van één muis met een stralende schaal (p/sec/cm2/SR). De stralingswaarden van bioluminescentie werden gekwantificeerd en de gemiddelde totale flux wordt weergegeven (flux (Log10 p/s). Na Nluc Imaging werden longen geoogst voor ex vivo imaging (B). Representatieve Foto’s uit hele longen worden weergegeven. Om Venus uitdrukking te kwantificeren, werden de gemiddelde waarden van de interessegebieden (ROIs) genormaliseerd naar Long auto-fluorescentie van mock-geïnfecteerde muizen en vouwen veranderingen werden berekend. Om de genetische stabiliteit van de BIRFLU in vivo te analyseren, werden bij muizen longen herstelde virussen geanalyseerd door plaque assay met behulp van fluorescerende microscopie (Venus, top), immunokleuring (Nluc, Middle) en Crystal Violet kleuring (onder) (C). Representatieve afbeeldingen van één muis worden weergegeven. Om de virusreplicatie te evalueren, werden hele longen gehomogeniseerd na beeldvorming en gebruikt om MDCK-cellen te infecteren en virale Antilichaamtiters te bepalen met plaque assay (PFU/mL) (D). Pijlen geven correlatie aan tussen fluorescentie (Venus), immunokleuring (Nluc) en kristalviolet kleuring. Staven vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van Long virus titers. Dit cijfer is aangepast van Logales et al.55. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Media en oplossingen voor weefselkweek Samenstelling Opslag Gebruiken Weefselkweek media: Dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS), 1% Penicillaire-streptomycine-L-glutamine (PSG) (DMEM 10% FBS 1% PSG). 445 ml DMEM, 50 mL FBS en 5 mL 100x PSG. 4 °C Onderhoud van MDCK-cellen Post-infectie media: dmem 0,3% Runderalbumine (BA), 1% PSG (DMEM 0,3% Ba 1% PSG). 491 ml DMEM, 4,2 ml 35% BA en 5 ml 100x PSG 4 °C Onderhoud van MDCK-cellen na virale infectie 10 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g van na2HPO4. 7h2O, 2 g van KH2po4. Voeg ddH2O toe tot 1 L. Pas de pH aan 7,3 Kamertemperatuur 1x PBS voorbereiden 1x PBS Verdun 10x PBS met ddH2O Kamertemperatuur Wash cellen Infectie media: 1x PBS, 0,3% BA, 1% penicilline-streptomycine (PS) (PBS/ba/PS). 487 mL 1x PBS steriel, 4,2 mL 35% BA en 5 ml 100x 1% PS (100 U/mL) 4 °C Virale infecties Fixatie/permeabilization oplossing: 4% formaldehyde, 0,5% Triton X-100 verdund in 1x PBS. 400 mL neutraal gebufferde formaline 10%, 5 ml Triton X-100 en 595 mL 1x PBS Kamertemperatuur Fix en permeabilization van MDCK cellen. Blokkerende oplossing: 2,5% boviene serum albumine (BSA) in 1x PBS. 2,5 g BSA in 97,5 mL 1x PBS 4 °C Blokkerende oplossing voor immunofluorescentie en plaque-assays. Antilichaam verdunnings oplossing (1% BSA in 1x PBS) 1 g BSA in 99 mL 1x PBS 4 °C Verdunning van primaire en secundaire antilichamen. 0,1% Kristalvioletoplossing 1 g kristalviolet in 400 mL methanol. Voeg 600 ml ddH2O toe Kamertemperatuur Kleuring van MDCK-cellen in plaque-assays. Tosylsulfonyl-fenylalanyl-chlooromethylketone (TPCK)-behandelde trypsine Bereid een 1, 000x stockoplossing bij 1 mg/mL in ddH2O -20 °C Voor virale infecties. Tabel 1: weefselkweek media en oplossingen.
Discussion
Onderzoekers hebben vertrouwd op recombinant reporter-het uitdrukken van virussen als vitale moleculaire instrumenten te begrijpen en uit te breiden op het huidige begrip van virale replicatie en pathogenese26,27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. de meest begunstigd reporter genen zijn luciferasen en fluorescerende eiwitten, voornamelijk als gevolg van de technologische vooruitgang in hun identificatie, ontwikkeling van verbeterde varianten en detectie door imaging Technologies43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48. recombinant reporter virussen worden vaak gebruikt om virologische testen te versnellen, de dynamiek van virussen in vitro en in vivo te bestuderen en de effectiviteit van momenteel goedgekeurde of nieuwe vaccin-en therapeutische benaderingen te testen26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Helaas, in het geval van iav, waren eerdere studies beperkt tot de uitdrukking van één reporter-gen, wat het type studie dat zou kunnen worden uitgevoerd, belemmert dat 26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 54. om deze beperking te vermijden, hebben we een replicatie-competente bi-reporter iav gegenereerd die een nluc plaats en een Venus TL-eiwit (birflu) uitdrukt.
In dit rapport beschrijven we de in vitro karakterisatie van BIRFLU en de experimentele benaderingen om BIRFLU te gebruiken om virale infectie in vivo te volgen met behulp van een muismodel van IAV-infectie. BIRFLU Nluc en Venus expressie correleerde met virale titers. Bovendien bleef de BIRFLU stabiel en bleef hij beide reporter genen uitdrukken na te zijn hersteld uit de longen van geïnfecteerde muizen. Deze aanpak biedt onderzoekers een uitstekende gelegenheid om IAV te bestuderen in gekweekte cellen en in diermodellen, met inbegrip van de identificatie en ontwikkeling van nieuwe therapeutische alternatieven voor de behandeling van IAV-infecties.
Hoewel birflu is gegenereerd met behulp van de ruggengraat van PR8, kan andere recombinant iav met behulp van verschillende type, subtype of virale stam wervels worden gegenereerd met behulp van dezelfde experimentele benadering. Evenzo hebben we in dit verslag de experimentele procedures voor het gebruik van BIRFLU beschreven in een muismodel van IAV. BIRFLU kan echter een waardevolle technologie zijn om de IAV-infectie in andere diermodellen te evalueren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek naar het influenzavirus in LM-S-laboratorium wordt deels gefinancierd door het New York influenza Center of Excellence (NYICE) (NIH 272201400005C), een lid van de NIAID Centers of Excellence for influenza Research and Surveillance (CEIRS) Contractnr. HHSN272201400005C (NYICE) en door het ministerie van defensie (DoD) peer reviewed medisch onderzoeksprogramma (PRMRP) Grant W81XWH-18-1-0460.
Materials
| 12-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 665102 | |
| 24-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Adobe Photoshop CS4 | Adobe | This software is used in 3.1.10 and 4.4.7 | |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4° C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4 °C |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| ChemiDoc MP Imaging System | BioRad | This instrument is used in 4.4.7 | |
| Crystal Violet | Thermo Fisher Scientific | C581-100 | Store at Room temperature |
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20 °C |
| Five- to seven-week-old female BALB/c mice | National Cancer Institute (NCI) | 555 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Store at Room temperature |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | 124262 | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) |
| IX81 Motorized Inverted Microscope | Olympus | Olympus IX81 | |
| Living Image 4.7.2 software | PerkinElmer | This instrument is used for in vivo imaging (4.2 and 4.3) | |
| Lumicount | Packard | This instrument is used for quantifying luciferase activity (3.2.6) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATCC | H16-L10-4R5 | Store at -20 °C |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagent | Promega | N1110 | This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100x | Corning | 30-00-CI | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Store at -20 °C |
| Retiga 20000R Fast1394 Camera | Qimaging | Retiga 2000R | |
| Scanner | HP | ||
| Texas Red-conjugated anti-mouse -rabbit secondary antibodies | Jackson | 715-075-150 | Store at -20 °C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices |
References
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication. Fields Virology. , (2007).
- Martinez-Sobrido, L., Peersen, O., Nogales, A. Temperature Sensitive Mutations in Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complex Responsible for the Attenuation of the Live Attenuated Influenza Vaccine. Viruses. 10 (10), (2018).
- Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Reverse Genetics Approaches for the Development of Influenza Vaccines. International Journal of Molecular Sciences. 18 (1), (2016).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Louie, J. K., et al. A review of adult mortality due to 2009 pandemic (H1N1) influenza A in California. PLoS One. 6 (4), e18221 (2011).
- Barr, I. G., et al. Epidemiological, antigenic and genetic characteristics of seasonal influenza A(H1N1), A(H3N2) and B influenza viruses: basis for the WHO recommendation on the composition of influenza vaccines for use in the 2009-2010 Northern Hemisphere season. Vaccine. 28 (5), 1156-1167 (2010).
- Simonsen, L., et al. Impact of influenza vaccination on seasonal mortality in the US elderly population. A.M.A. archives of internal medicine. 165 (3), 265-272 (2005).
- McLean, H. Q., Peterson, S. H., King, J. P., Meece, J. K., Belongia, E. A. School absenteeism among school-aged children with medically attended acute viral respiratory illness during three influenza seasons, 2012-2013 through 2014-2015. Influenza and Other Respiratory Viruses. 11 (3), 220-229 (2017).
- Principi, N., Esposito, S. Protection of children against influenza: Emerging problems. Human Vaccines and Immunotherapeutics. , 1-8 (2017).
- Falsey, A. R., Treanor, J. J., Tornieporth, N., Capellan, J., Randomized Gorse, G. J. double-blind controlled phase 3 trial comparing the immunogenicity of high-dose and standard-dose influenza vaccine in adults 65 years of age and older. Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 172-180 (2009).
- Fuller, J. D., et al. Influenza vaccination of human immunodeficiency virus (HIV)-infected adults: impact on plasma levels of HIV type 1 RNA and determinants of antibody response. Clinical Infectious Diseases. 28 (3), 541-547 (1999).
- Carrat, F., Flahault, A. Influenza vaccine: the challenge of antigenic drift. Vaccine. 25 (39-40), 6852-6862 (2007).
- Doherty, P. C., Kelso, A. Toward a broadly protective influenza vaccine. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3273-3275 (2008).
- Fiore, A. E., et al. Prevention and control of influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP), 2010. MMWR Recommendations and Reports. 59 (RR-8), 1-62 (2010).
- Pica, N., Palese, P. Toward a universal influenza virus vaccine: prospects and challenges. Annual Review of Medicine. 64, 189-202 (2013).
- To, K. K., Chan, J. F., Chen, H., Li, L., Yuen, K. Y. The emergence of influenza A H7N9 in human beings 16 years after influenza A H5N1: a tale of two cities. Lancet Infectious Diseases. 13 (9), 809-821 (2013).
- Baker, S. F., Nogales, A., Santiago, F. W., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Competitive detection of influenza neutralizing antibodies using a novel bivalent fluorescence-based microneutralization assay (BiFMA). Vaccine. 33 (30), 3562-3570 (2015).
- He, W., Mullarkey, C. E., Miller, M. S. Measuring the neutralization potency of influenza A virus hemagglutinin stalk/stem-binding antibodies in polyclonal preparations by microneutralization assay. Methods. , (2015).
- Kayali, G., et al. Testing human sera for antibodies against avian influenza viruses: horse RBC hemagglutination inhibition vs. microneutralization assays. Journal of Clinical Virology. 43 (1), 73-78 (2008).
- Stephenson, I., et al. Reproducibility of serologic assays for influenza virus A (H5N1). Emerging Infectious Diseases. 15 (8), 1252-1259 (2009).
- Maher, J. A., DeStefano, J. The ferret: an animal model to study influenza virus. Lab Animal (NY). 33 (9), 50-53 (2004).
- Webster, R. G., Cox, N., Stoehr, K. . WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev. 1. , (2002).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Cox, A., Baker, S. F., Nogales, A., Martínez-Sobrido, L., Dewhurst, S. Development of a mouse-adapted live attenuated influenza virus that permits in vivo analysis of enhancements to the safety of live attenuated influenza virus vaccine. Journal of Virology. 89 (6), 3421-3426 (2015).
- Steel, J., Lowen, A. C., Mubareka, S., Palese, P. Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N. PLoS Pathogens. 5 (1), e1000252 (2009).
- Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
- Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nature Communications. 6, 6600 (2015).
- Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (25), 11531-11536 (2010).
- Perez, J. T., Garcia-Sastre, A., Manicassamy, B. Insertion of a GFP reporter gene in influenza virus. Current Protocols in Microbiology. , (2013).
- Reuther, P., et al. Generation of a variety of stable Influenza A reporter viruses by genetic engineering of the NS gene segment. Scientific Reports. 5, 11346 (2015).
- Tran, V., et al. Multi-Modal Imaging with a Toolbox of Influenza A Reporter Viruses. Viruses. 7 (10), 5319-5327 (2015).
- Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Perez, D. R., Martinez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A and B Viruses Expressing a Fluorescent Dynamic Timer Protein for In Vitro and In Vivo Studies. PLoS One. 11 (1), e0147723 (2016).
- Nogales, A., Baker, S. F., Martinez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. , 206-216 (2014).
- Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2015).
- Avilov, S. V., et al. Replication-competent influenza A virus that encodes a split-green fluorescent protein-tagged PB2 polymerase subunit allows live-cell imaging of the virus life cycle. Journal of Virology. 86 (3), 1433-1448 (2012).
- Breen, M., Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-Competent Influenza A Viruses Expressing Reporter Genes. Viruses. 8 (7), (2016).
- Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PLoS One. 9 (5), e97695 (2014).
- Karlsson, E. A., et al. Visualizing real-time influenza virus infection, transmission and protection in ferrets. Nature Communications. 6, 6378 (2015).
- Czako, R., et al. In Vivo Imaging of Influenza Virus Infection in Immunized Mice. MBio. 8 (3), (2017).
- Harding, A. T., Heaton, B. E., Dumm, R. E., Heaton, N. S. Rationally Designed Influenza Virus Vaccines That Are Antigenically Stable during Growth in Eggs. MBio. 8 (3), (2017).
- DiPiazza, A., et al. Pandemic 2009 H1N1 Influenza Venus reporter virus reveals broad diversity of MHC class II-positive antigen-bearing cells following infection in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 10857 (2017).
- Yan, D., et al. Replication-Competent Influenza Virus and Respiratory Syncytial Virus Luciferase Reporter Strains Engineered for Co-Infections Identify Antiviral Compounds in Combination Screens. Biochemistry. 54 (36), 5589-5604 (2015).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (Pt 24), 4247-4260 (2007).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Kelkar, M., De, A. Bioluminescence based in vivo screening technologies. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 592-600 (2012).
- Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
- Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
- Vintersten, K., et al. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Mol Imaging. 12 (7), 1-13 (2013).
- Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14610-14615 (2012).
- Pan, W., et al. Visualizing influenza virus infection in living mice. Nat Commun. 4, 2369 (2013).
- Heaton, N. S., et al. In vivo bioluminescent imaging of influenza a virus infection and characterization of novel cross-protective monoclonal antibodies. J Virol. 87 (15), 8272-8281 (2013).
- Nogales, A., Baker, S. F., Martínez-Sobrido, L. Replication-competent influenza A viruses expressing a red fluorescent protein. Virology. 476, 206-216 (2015).
- Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent Bi-Reporter influenza A virus (BIRFLU) to evaluate viral infections. Journal of Virology. , (2019).
- Nogales, A., et al. Influenza A Virus Attenuation by Codon Deoptimization of the NS Gene for Vaccine Development. Journal of Virology. 88 (18), 10525-10540 (2014).
- Nogales, A., DeDiego, M. L., Topham, D. J., Martinez-Sobrido, L. Rearrangement of Influenza Virus Spliced Segments for the Development of Live-Attenuated Vaccines. Journal of Virology. 90 (14), 6291-6302 (2016).
- National Research Council (U.S.). Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) & National Academies Press (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
- Nogales, A., Martinez-Sobrido, L., Chiem, K., Topham, D. J., DeDiego, M. L. Functional Evolution of the 2009 Pandemic H1N1 Influenza Virus NS1 and PA in Humans. Journal of Virology. 92 (19), (2018).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
Cite This Article
Chiem, K., Rangel-Moreno, J., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection. J. Vis. Exp. (150), e59890, doi:10.3791/59890 (2019).