JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Entegre hücre manipülasyon platformu tek süspansiyon hücrelerinde Ilaçların ve metabolitlerin Kütle Spektrometrisi analizi için tek prob ile birleştiğinde

Published: June 21, 2019
doi:
10.3791/59875
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Oklahoma

Summary

Entegre hücre manipülasyon platformu, ortam koşullarında bireysel süspansiyon hücrelerinin on-line analizi için tek prob Kütle Spektrometrisi kurulumu ile birlikte kullanılmak üzere geliştirilmiştir.

Abstract

Tek hücreli kütle spektrometresi (SCMS), tek hücreli düzeyde hücresel türlerin geniş aralıklarının hassas tespiti ve doğru analizini sağlar. Tek prob, mikro ölçekli örnekleme ve iyonizasyon cihazı, ortam koşullarında hücresel bileşenlerin hızlı SCMS analizi için bir kitle spektrometresi ile birleşebilir. Daha önce, tek prob SCMS tekniği öncelikle bir substrat üzerinde immobilize hücreleri ölçmek için kullanılan, çalışmalar için hücrelerin türlerini sınırlandırmak. Mevcut çalışmada, tek prob SCMS teknolojisi genellikle in vitro fertilizasyon için kullanılan bir hücre manipülasyon sistemi ile entegre edilmiştir. Bu entegre hücre manipülasyon ve analiz platformu tespit bireysel yüzen hücreleri yakalamak ve mikroölçek lizis için tek prob ucu hücreleri aktarmak için bir hücre seçimi prob kullanır, hemen kitle spektrometri Analizi izledi. Bu yakalama ve aktarım işlemi, analiz öncesinde çevreleyen çözümden hücreleri kaldırır, kütle spektrometresi analizinde matris moleküllerinin giriş değerini en aza indirir. Bu entegre kurulum, vücut sıvıları örneklerinde (örn. idrar, kan, tükürük vb.) mevcut hedeflenen hasta yalıtılmış hücrelerin SCMS analizini yapabilir ve SCMS analizinin insan ilacına ve hastalık biyolojisine potansiyel uygulamalarına olanak sağlar.

Introduction

İnsan biyolojisi, özellikle hastalık biyolojisi, bireysel hücrelerin düzeyinde faaliyetlerin sonucu olarak giderek daha anlaşılabilir, ancak sıvı kromatografi kitle spektrometresi (LCMS) gibi geleneksel analitik yöntemler genellikle analiz etmek için kullanılır hücrelerden hazırlanan numuneler, elde edilen moleküler bilgiler bireysel hücre seviyesinde kimyasal süreçleri doğru şekilde temsil edemez. Bu standart, geleneksel yöntemler, hücresel heterojenliğin analitik bir ölçümde etkilerini ayırt edemiyoruz ve lysate hazırlamak için hücreleri yok etme ve karıştırma süreci, cep telefonlarının değiştirilmesine veya kaybına yol açar bileşenler1,2. Geleneksel yöntemlerin bu sınırlamaları, elde edilen numunelerin birçok farklı hücre türünün karmaşık bir karışımını içerebileceği hasta hücrelerinin analizinde özellikle önemlidir. Bu eksikliklerin üstesinden gelmek için, tek hücreli kütle spektrometresi (SCMS) yöntemleri de dahil olmak üzere tek hücreli moleküler analiz yöntemleri, özellikle hücresel metabolitler ve düşük moleküler ağırlıkta, biyolojik analizlere giderek geliştirilmiştir ve uygulanır biyomoleküllerin3,4.

İlk SCMS teknikleri, ortam dışı koşullarda2,5,6,7,8,9, 10,11. Olmayan ortam SCMS teknikleri hücresel lipidler ve metabolitleri analiz yeteneğine sahiptir, ancak yapay koşullarda örnek ön tedavi gerektirir ve bu nedenle gerçek zamanlı analiz için uygun değildir. Ortam dışı analiz için örnek hazırlama işlemi matris bileşenlerinin eklenmesi içerir ve bu hazırlık doğal ortamlarından hücresel bileşenleri değiştirebilir12. Bu nedenle, örnekleme ortamı için bir vakum gerektirmeyen ortam kütlesi spektrometresi (MS) teknikleri, yakın bir yerel ortamda hücreleri analiz etmek için kullanılır. Bir vakum ortamı sahip değil deneysel tasarım çok yönlülük sağlar; kameralar hücresel süreci izlemek için eklenebilir ve daha yumuşak iyonizasyon teknikleri her tek hücreli deney daha iyi bilgi almak için ayrım teknikleri ile kombine edilebilir4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.

Tek prob SCMS yöntemi, canlı, mammalin kanseri hücre çizgilerini yerel bir ortamda analiz eden bir ortam teknikidir21,43,44,45,46. Buna ek olarak, tek prob cihaz diğer kütle spektrometresi uygulamaları için kullanılmıştır, çok hücreli küreleri ve MS görüntüleme dokularda ekstrülüler moleküllerin analizi de dahil olmak üzere,47,48,49 ,50,51,52. Ancak, bu yöntem için substratlar üzerinde hücre immobilizasyonu gerekli olduğundan, süspansiyon hücreleri doğrudan bu tekniği kullanılarak analiz edilemez3,53. Bu nedenle, tek prob SCMS sistemi doğrudan olmayan yapışkanlar tek hücreler, örneğin bir hastanın kanı veya diğer bedensel sıvılar54izole olmayan yapışkanlar hücre hatları veya süspansiyon hücreleri gibi örnek için kullanılmaz. Bu çalışmasında, entegre hücre manipülasyon platformu (ıCMP), canlı, süspansiyon hücrelerini minimum numune hazırlama ile on-line analiz etmek için tek prob SCMS tekniği ile birleştiğinde (Şekil 1)46. ICMP hücre seçimini izlemek için ters bir mikroskop oluşur, bir cam hücre seçimi prob, bireysel yüzen hücreleri yakalamak için bir mikroenjektör, hücresel sıcaklık korumak için ısıtmalı bir plaka, uzamsal kontrol etmek için iki hücre manipülasyon sistemleri hem cam hücre seçimi prob hem de tek prob hareketlerini ve hücre seçimi prob ucunu tek prob ucunu hücre aktarımı gözlemlemek için bir dijital mikroskop. Tek prob imalatı önceki yayınlar ayrıntılı ve burada ele alınacaktır değil21,48. ICMP/Single-Probe sistemi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile birleştir. Bu entegre kurulum, matris moleküllerinden minimal etkilere sahip kompleks biyolojik örneklerden tanımlanan tek hücrelerin örneklemesini sağlar.

Protocol

1. Cam hücre seçimi prob imalatı Tek delikli cam tüpünü keskin bir uç ile konik bir prob haline dönüştürün. Tek delikli cam tüp (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) bir dikey pipet tutucunun kelepçeleri içine yerleştirin, cam ısıtma bobini ile ilgili olarak merkezleme ve boru yerine sabitlemek için sıkın. Isıtma bobini, 18 kalibrelik nikel-krom direnç telinden (~ 60 mm uzunluğunda) oluşan bir metal çubuk (çap = 3,90 mm) 2,5 kez etrafında sarılmış. Cam tüpünü sıcaklık programı 19,5 (üreticinin ünitesi) ile ayarlayın. Bu parametre, belirli bir enstrüman için değiştirilebilir. Solenoid pistonu 4 (üreticinin ünitesi) olarak ayarlayın. Bu parametre, belirli bir enstrüman için değiştirilebilir. Cam tüpünü çekmek için Solenoid tetikleyici. Bu adım, iki problar ucu erimiş oluşturur. Her prob ucunu ~ 1 mm kesmek için cımbız kullanın, prob ucu çapı ~ 10 μm bir orifis oluşturarak. ICMP/Single-Probe SCMS kurulumuna kolay bağlantı için cam sondayı bükün. Mikroforge içine çekilen bir cam prob ayarlayın, ucu ~ 3 mm platin Isıtma teli konumlandırın. Platin Teldeki ısı miktarını maksimum sıcaklığın% 30 ‘ unda çevirin. Sondayı orijinal konumdan ~ 45 ° Bend (Şekil 2). 2. entegre hücre manipülasyon platformu montajı Kütle spektrometresi ile kolay bağlantı için ters mikroskop, mikroenjektör ve iki hücreli manipülasyon sistemlerini motorlu bir masaya yerleştirin. Son bir kol kelepçe ile değiştirerek tek prob sığdırmak için hücre işleme sistemlerinden birini değiştirin. Mikroenjektör mineral yağı ile doldurmak için bir iğne ile plastik bir şırınga kullanın. Bu suctioning etkileyecektir gibi boru kabarcıkları kaçının. Ters mikroskopla sahne eklemesini ısıtmalı plakalı olarak değiştirin. Isıtma plakasını 37 °C ‘ de analiz etmeden önce ayarlayın. Cam hücre seçimi aygıtını ayarlayın. Uzun (bükülmeyen) tarafı kapiller tutucuya yerleştirerek ve sondayı yerine sabitlemek için vidayı sıkıştırarak, Cam hücre seçimi sondasını mikroenjektör metal tutucusunun içine takın. Prob ucunun açısını ısıtmalı plakaya paralel olarak konumlandırın.DIKKAT: cam sondası çok keskin ve kırılgan ve kolayca kırılır. Gözlerinizi koruyun ve mikroenjektör içine prob takarken ekstra dikkatli olun. Mikroenjektör metal tutucusunu hücre manipülasyon sistemine sabitleyin. Prob ucunu ters çevrilmiş mikroskop ışığını ortasına getirin. 3. kütle spektrometresi girişi için uzatılmış iyon transfer tüpü oluşturun Paslanmaz çelik tüpün bir parçasını kesmek için bir metal kesici kullanın (OD: 0,0625 (1/16) in, ID: 0,021 in) ~ 250 mm uzunluğunda. Ölçü 135 mm sonunda ve bir metal Feral böylece ~ 135 mm atmosfere maruz kalacak ve ~ 115 mm kitle Spektrometre içinde olacaktır. Sıkılaştırmak için iki anahtarı kullanarak Feral güvenliğini sağlayın. 4. tek prob kurulum ile ıCMP çift Tek prob içeren cam slaytı hücre manipülasyon sisteminin kol kelepçesi içine sabitleyin.Not: tek problar geçerli çalışmada iki küçük değişiklik ile önceden yayımlanan protokol48 göre üretilmiştir: nano-ESI emiter kitle spektrometresi kolay bağlantı için daha uzun yapılır ve tek problar cam yapıştırılır tarafı, Cam hücre seçimi cihazının uzamsal hareketini engellemesini önlemek için (Şekil 2). Kapiller plastik yüksül (1/16 x .005 in) kolunun içine yerleştirerek ve parmak sıkma Fitting-solvent-iletkenli bir birlik için kılcal sağlayan bağlayın. İletken birliğin diğer tarafını bir kapiller (ID: 40 μm, OD: 150 μm), örnekleme çözücüsü içeren bir şırıngaya bağlı olan, kapiller kol (1/32 x .007) içine yerleştirerek ve montaj sıkma. Bu deneylerde örnekleme çözücüsü olarak% 0,1 formik asit ile Asetonitril kullanın.Not: örnekleme solvent esnek, ancak öncelikle Asetonitril (veya daha iyi iyonizasyon için formik asit ile Asetonitril), hızlı bir mikroölçekli hücre lizis için içermelidir. Şırıngayı kütle spektrometresi üzerindeki şırınga pompasına sabitleyin. İyonizasyon voltajı kablosunu iletken birleşime bağlı bir bakır tel üzerine yerleştirin. Nano-ESI emiter ~ 1 mm uzatılmış iyon transfer tüpü orifis konumlandırın. Tek prob uzamsal hareketlerini kontrol etmek için hücre işleme sistemi kullanın ve genişletilmiş iyon transfer tüpü önünde nano-ESI emiter merkezi konumlandırın. 5. askıya alınan hücre numune hazırlama Analiz önceki gün (~ 18-24 h), bir hücre kültürü Flask (T25) test etmek için hücreler dışarı tohum. K562 insan miyeloid lösemi hücreleri bu çalışmada model olarak kullanılmaktadır. Isı 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) ve Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMı) orta% 10 sentetik fetal Sığır serum (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile 37 °C 30 dakika boyunca desteklenmektedir. Tohum ~ 1 x 106 hücreler sıcak orta ile hücreleri birleştirerek 10 ml toplam hacminde. Genel olarak, bir hücre kültürü Flask içine RPMı orta 8 mL yerleştirmek için 10-mL pipet kullanın. Daha sonra, 2 ml konfluent K562 hücresi ~ 1 x 106 hücre için orta koymak Için iki ml pipet kullanın. Hücreleri 37 °C ‘ de ve% 5 CO2 ‘ de analizine kadar kulbe etme. Hücreleri analiz için hazırlayın. Hücre kültüründen pipet hücreleri 15 mL santrifüjten tüp içine. 400 x g ve 37 °c ‘ de 5 dakika boyunca hücreleri aşağı döndürün ve supernatant ‘i atın. İstenen tedavi konsantrasyonunda ilaç bileşiği içeren RPMI orta 4 mL resuspend hücreler.Not: denetim hücrelerinin analizi için, 4 ml rpmi orta hücreleri yeniden pelletini ve Adım 6′ ya atlayın. 37 °C ve% 5 CO2’ de tedavi süresi boyunca hücreleri kulyur. 5 dakika boyunca 400 x g ve 37 °c ‘ de hücreleri aşağıya döndürün. supernatant aspirate. Hücreler 10 mL PBS ‘de yeniden resuspended ve 400 x g ve 37 °c ‘ de santrifüjler 5 dk. Dönen sonra, supernatant atın. Hücre dışı bileşenlerdeki ilacın algılanmasını en aza indirmek için bu adımı 3 kez tekrarlayın. Analiz için PBS 4 mL hücrelerinde resuspend. 6. ıCMP/tek prob kurulumunu kullanarak SCMS ölçümleri gerçekleştirin Deney için kütle spektrometresi parametrelerini özelleştirin. Enstrüman yazılımının tarama modu başlığının altında tarama tanımla’yı seçin. M/z 400, 1 mikrotarama, 100 ms maksimum enjeksiyon süresi ve otomatik kazanç kontrolü (AGC) üzerinde 60.000 m/∆ m çözünürlük kullanın. Deneyler için 100-1000 bir kütle aralığı (m/z) kullanılmıştır. Parametreler enstrüman modeline göre değiştirilebilir. Şırınga pompasıaltında, 150 nl/dak ‘lik bir akış hızı seçin. akış hızı her deneme için optimize edilmesi gerekir. NSI kaynak seçin ve ~ 4,5 kV voltaj uygulayın. Bu parametrenin her deneme için de optimize edilmesi gerekir. Ters mikroskop (hem üst plaka hem de alt objektif için 40X büyütme seçiliyken) açın ve canlı video akışlarını yakalamak için dizüstü bilgisayarın USB bağlantı noktasına bağlayın. Isıtmalı plakayı açın ve 37 °C ‘ ye ayarlayın. Bilgisayarda, veri edinme sekmesine gidin ve elde etme süresialtında sürekli olarak seçin. Numune analizi için hazırlayın. Pipet 2-3 mL küçük bir petri tabağı (35 mm x 12 mm) kapağına numune. 6.4.2 numuneyi ısıtılan plakanın üstüne ters çevrilmiş mikroskopla ışığın ortasına konumlandırın. Cam hücre seçim sondasını analiz için hazırlayın. Sondayı taşımak için hücre işleme sistemini kullanarak ucu hücrelerle aynı düzlemde ters mikroskop altında odaklanmıştır. Analiz için tek bir hücreyi seçin. Hücre seçimi prob ucu hedeflenen bir hücreye taşımak için hücre düzenleme sistemi kullanın. Bu işlem, ters mikroskop kullanılarak izlenir.Not: hücre seçimi prob ucu hücrelerle aynı düzlemde odaklanmış olamaz, prob bükülmüş parçası uygun açılı değildir mümkündür. Her iki prob ipuçları mikroskop altında hücreler ile birlikte odaklanmış kadar hücre seçimi prob konumunu ayarlayın. Mikroenjektör kolunu hafifçe çevirin ve mineral yağının tüpün içinde konumunu ayarlayın. Mikro enjektör tarafından, hedeflenen hücreyi hücre seçimi prob ucunun güvenliğini sağlamak için nazik bir emme sağlanır.Not: hücre seçimi prob tarafından emiş kuvveti aracılığıyla yakalanamazsa, hücre seçimi sondasını kontrol ederek kapiller tutucusuna tam olarak yerleştirildiğinden emin olun. Buna ek olarak, mikroenjektör ve boru içinde mineral yağ düzeylerini incelemek, ve herhangi bir hava dışarı dışarı. Bu işlemi izlemek için tek prob ucu odaklı bir dijital mikroskop kullanarak, hücre seçimi prob ucunu tek prob ucu için hücreyi taşımak için hücre işleme sistemi kullanın. Dokunmadan, tek prob ucu küçük bir Asetonitril damlacık hücrenin hızlı bir yapışıklıkların indükler, ve sonra hücre lysate hemen on-line MS analizi için iyonize.Not: seçili hücre hassas bir emme aracılığıyla hücre seçimi prob ucu için güvenli olduğundan, bu hücre potansiyel olarak tek prob ucu transfer sırasında ayrılabilir. Bu nedenle, tipik hücresel lipidlerin iyon sinyalleri (aşağıda temsili sonuçlara bakın) 5 sn içinde gözlemlenmez, hücrenin takılı olmaması ve farklı bir hücrenin seçilmesi gereklidir.

Representative Results

İlk, tedavi edilmemiş K562 hücreler deneysel yöntemi kurmak için kullanılır. Tipik bir SCMS denemesinde, hücre içeriğinin saptanması sırasında ve ölçümü bitirdikten sonra (Şekil S1), bir hücreyi aktararak kitle spektrumunda belirgin değişiklikler görülebilir. Üç ortak hücresel lipid doruklarına (Fosfatidilkolin, PC), PC dahil olmak üzere (34:4) (m/z 754,536), PC (36:4) (m/z 782,567), ve PC (38:5) (m/z 808,583), hücre başarıyla transfer ve hücresel sağlamak için izlenir İçindekiler algılandı (Şekil S2)21,43,46,55,56. Eğer lipid zirveleri 5 s içinde görülmediği takdirde, mikroenjektör içindeki mineral yağ seviyesi hücreyi hücre seçimi prob ucunda tutan emiş miktarını azaltmak için değiştirilir; herhangi bir maden yağı hücre seçimi prob dışarı itilir böylece dikkatli alınması gerekir. M/z 750-850 kitle ARALıĞıNDA birçok PC ‘nin kimliği tedavi edilmemiş hücre lysate örneklerinde MS/MS kullanılarak teyit edilir (Şekil 3, Şekil S2, Tablo 1)46. K562 hücreler de yöntemin çok yönlülük genişletmek için çeşitli ilaç bileşikleri ile tedaviye tabi tutulur. K562 hücreler, sırasıyla 4 h ve 2 h için 1 h ve osw-1 (100 Nm, 1 μm) için gemsitabin (1 μm) ve Taxol (1 μm) ile inkübe edilir. Hücreler daha sonra PBS ile yıkanır ve hücre dışı içeriklerden ilaç bileşiklerinin algılanmasını en aza indirir. Matris (örn., hücre kültürü medyası, PBS ve çözücüden gelen iyonlarının) hücresel içeriğin kütle spektrumlarına katkısı, önemli ölçüde farklı iyon sinyalleri nedeniyle veri çıkarma yoluyla ortadan kaldırılabilir (Şekil S3). Her üç ilaç bileşiği, ıCMP/Single-Probe MS kurulumu (Şekil S4)46kullanılarak algılanır. Bu sonuçlar, bu yöntem hücre içi lipidler, ilaçlar ve metabolitleri tek hücreli düzeyde çözümdeki hücrelerden bir yakın yerel ortamda okumak için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir. Şekil 1. Tek süspansiyon HÜCRESI MS deneyler Için deneysel kurulum. (A) entegre hücre işleme platformu (ICMP) bir kütle spektrometresi ile birleştiğinde. (B) askıya alınan hücrelerin analizi için şematik. (C) hücre seçimi prob kullanılarak seçilecek K562 hücrelerin deneysel görünümü. Standke ve al.46’den izin ile yeniden basılmıştır. Copyright 2019 Amerikan Kimya Derneği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 2. Tek süspansiyon hücresi MS deneyler için kullanılan bir modifiye tek prob ve bir hücre seçimi prob fotoğrafları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Şekil 3. (M/z 750-850) temsili türler gösteren tek bir hücreden yakınlaştırılmış-kitle spektrum. Kimyasal yapılar MS/MS analizi kullanılarak teyit edilir (Şekil S1). Standke ve el46’den izin ile yeniden basıldı. Copyright 2019 Amerikan Kimya Derneği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız. Ilaç molekülü* m/z Toplu hata (ppm) [Gemcitabine + H] + 264,076 11,32 [Taxol + na] + 876,318 2,74 [OSW-1 + na] + 895,445 0,89 Hücresel lipidler [PC (34:4) + H] + 754,535 3,71 [PC (34:3) + H] + 756,551 3,44 [PC (34:2) + H] + 758,569 0,66 [PC (36:5) + H] + 780,551 3,07 [PC (36:4) + H] + 782,568 2,17 [PC (36:3) + H] + 784,585 0,64 [PC (38:7) + H] + 804,551 4,1 [PC (38:6) + H] + 806,567 2,48 [PC (38:5) + H] + 808,583 2,72 [PC (38:4) + H] + 810,601 0 [PC (40:7) + H] + 832,583 3,12 Tablo 1. ICMP/Single-Probe kurulumunu kullanarak tespit edilen hücresel bileşenler. Tüm ilaç bileşiklerinin tespiti, MS/MS sonuçlarını standart bileşik ile karşılaştırarak doğrulandı.

Discussion

Entegre hücre manipülasyon ve analiz platformu tek prob MS yönteminin çok yönlülük genişletmek için inşa edilmiştir, on-line için izin, yakın bir doğal ortamda yapışmayan hücrelerin hızlı analiz. Tekniğin büyük bir avantajı, minimal numune hazırlama gereklidir, böylece hücreler standart durumunu taklit koşullarda analiz edilir. Özellikle, bireysel ilgi hücreleri görsel olarak tespit edilebilir ve seçilebilir, MS iyonizasyon verimliliği üzerinde matris etkisinin etkisini en aza indirerek kendi doğal ortamda hücreleri korurken, böylece sonuçları daha temsili hücrelerin yerli (Şekil S3). Bu teknik, gelecekteki çalışmalarda biofluidler içinde askıya alınan hasta hücrelerini incelemek için potansiyel olarak kullanılabilir. Bu tekniğin bir diğer avantajı da örnekleme çözücünün esnek seçimidir. Mikroölçek liziz hızla ortaya çıkabilir, böylece ana örnekleme solvent olarak Asetonitril dahil etmek önemlidir. Potansiyel olarak, iç standartlar (örn., isotopically etiketli ilaç bileşikleri), bireysel hücrelerden ilgi moleküllerinin (örn. ilaç molekülleri) ölçülmesine yönelik örnekleme çözücüye eklenebilir, bu da dahil olmak üzere devrim içinde önemli bir rol oynayabilirler gelecekte54ilaç tedavileri kişiselleştirmek.

Bu entegre sistem kolayca hücrelerin geniş aralıkları analiz etmek için kullanılabilir olsa da, yöntemin bir sınırlama ne tek prob ne de hücre seçimi prob ticari olarak kullanılabilir; Her denemeden önce birçok parametrenin optimizasyonu (örn., akış hızı, voltaj, nano-ESI emiter ve iyon transfer tüpü arasındaki uzunluk vb.) ihtiyacını dikte etme. Buna ek olarak, tek prob ve hücre seçimi sondasının küçüklüğü nedeniyle, çevresel pertürasyon (örn. hava akımı) iki prob arasında bir kavşak kurma zorluklara neden olabilir. Kısa vadeli bir çözüm, bantlama uzunluğunu en aza indirmek için son yakın hücre seçimi prob bükme olduğunu. Gelecekteki çalışma çevresel etkileri en aza indirmek için kurulum kritik bölümlerini kapsayan bir konut gelişimi içerir. Hücresel içerik ve kısa edinme süresi (~ 2-3 s) bir hücreden sınırlı miktarda nedeniyle, MS/MS Analizi sadece nispeten bol türler için yapılabilir. Algılama hassasiyetini etkileyen diğer faktörler arasında, matris girişi nedeniyle hücre ve uzatılmış iyon transfer borusu yoluyla potansiyel iyon kaybı ile birlikte bastırılmış iyonizasyon verimliliği bulunmaktadır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, hem süspansiyon hücreleri ve hücre lysate deneyler için numune hazırlama geliştirme çalışmaları için Naga Rama Kothıdo teşekkür ederiz. Ayrıca, yazarlar NıH (R01GM116116 ve R21CA204706) finansman için teşekkür ederiz.

Materials

Acetontrile Millipore Co. AX0145-1 Sampling solvent
CellTram Vario Eppendorf 6221 ICMP
Copper wire stores.ebay.com/jewelerheaven Dead soft, round, 20 guage, 25 ft Conductive union setup
Digital stereomicroscope Shenzhen D&F Co. Supereyes T004 Analysis
Disposable micropipette, 1-5 µL Rochester Scientific 5065 Cell-selection probe fabrication
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" Friedrich & Dimmock, Inc. MBT-005-020-2Q Single-probe fabrication
Epoxy resin Devcon Part No. 20945 Single-probe fabrication
Eppendorf cell manipulation system Eppendorf Transferman NK517800397-U.R. ICMP
External nut VALCO*CHEMINERT EN1 Ion transfer tube fabrication
Formic acid Sigma-Aldrich 399388-500ML Sampling solvent
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm Polymicro Technologies TSP040105 Single-probe fabrication, conductive union setup
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm Polymicro Technologies 1068150015 Conductive union setup
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) Fischer Sci SH3006603 Cell culture
Inline MicroFilter IDEX Health & Science LLC M-520 Conductive union setup
Laser puller Sutter Instrument Co. Model P-2000 Single-probe fabrication
LED UV lamp Foshan Liang Ya Dental Equipment LY-C240 Single-probe fabrication
LTQ Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL Analysis
Microforge Narishige, Co. MF-9 Cell-selection probe fabrication
Microunion IDEX Health & Science LLC M-539 Conductive union
PEEK tubing, 1/32×0.005x 5ft IDEX Health & Science LLC 1576 Conductive union setup
PEEK tubing, 1/32×0.007x 5ft IDEX Health & Science LLC 1577 Conductive union setup
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies 15140-122 Cell culture
Petri dish, 35×10 mm VWR 25382-334 Sample preparation
Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 0780-50L Cell culture
Platinum wire Narishige, Co. Model PT-A Microforge
Power supply Nikon PSM-2120 ICMP
RPMI, 1X with Corning glutagro Corning 10-104-CV Cell culture
Single-bore tubes Boralex 5065 Cell-selection probe fabrication
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD IDEX Health & Science LLC VHP-200-01x Ion transfer tube fabrication
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm IDEX Health & Science LLC U-1128 Ion transfer tube fabrication
Syringe, 250 µL Hamilton 1725LTN250UL Sampling syringe
T25 flask CellStar 690160 Cell culture
Thermo LTQ XL ion source interface flange New Objective PB5500 Analysis
ThermoPlate TokaiHit 55R30N ICMP
TrypLE Express Gibco 12605-010 Cell culture
Tube cutter, for 1/16" stainless steel SUPELCO 58692-U Ion transfer tube fabrication
USB digital photography microscope dx.com SO2 25~500X Analysis
UV curing resin Prime Dental Item No. 006.030 Single-probe fabrication
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Cell-selection probe fabrication
Voltage housing PicoChip PCH-A00120 ICMP/MS interface
Wire cutter Craftsman 4 1/2 in end nipper Conductive union setup
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mao, S., et al. In Scatheless Cell Detachment Reveals Correlation between Adhesion Strength and Viability at Single-Cell Resolution. Angewandte Chemie International Edition. 57 (1), 236-240 (2017).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  3. Linwen, Z., Akos, V. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2017).
  4. Chen, X., et al. Single-cell analysis at the threshold. Nature Biotechnology. 34, 1111 (2016).
  5. Fu, Q., Tang, J., Cui, M., Xing, J., Liu, Z., Liu, S. Application of porous metal enrichment probe sampling to single cell analysis using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Journal of Mass Spectrometry. 51, (2016).
  6. Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-Cell Lipidomics: Characterizing and Imaging Lipids on the Surface of Individual Aplysia californica Neurons with Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (4), 2231-2238 (2013).
  7. Passarelli, M. K., et al. Single-Cell Analysis: Visualizing Pharmaceutical and Metabolite Uptake in Cells with Label-Free 3D Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 87 (13), 6696-6702 (2015).
  8. Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary Ion MS Imaging To Relatively Quantify Cholesterol in the Membranes of Individual Cells from Differentially Treated Populations. Analytical Chemistry. 79 (10), 3554-3560 (2007).
  9. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  10. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. Journal of Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  11. Ong, T. -. H., Tillmaand, E. G., Makurath, M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry-based characterization of endogenous peptides and metabolites in small volume samples. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 732-740 (2015).
  12. Yang, Y., Huang, Y., Wu, J., Liu, N., Deng, J., Luan, T. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  13. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip. 7 (4), 423-440 (2007).
  14. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  15. Fujii, T., et al. Direct metabolomics for plant cells by live single-cell mass spectrometry. Nature Protocols. 10, 1445 (2015).
  16. Esaki, T., Masujima, T. Fluorescence Probing Live Single-cell Mass Spectrometry for Direct Analysis of Organelle Metabolism. Analytical Sciences. 31 (12), 1211-1213 (2015).
  17. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live Single-Cell Molecular Analysis by Video-Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 24 (5), 559-561 (2008).
  18. Mizuno, N., Harada, T., Masujima, T., T, H. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. , (2008).
  19. Phelps, M., Hamilton, J., Verbeck, G. F. Nanomanipulation-coupled nanospray mass spectrometry as an approach for single cell analysis. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 124101 (2014).
  20. Phelps, M. S., Verbeck, G. F. A lipidomics demonstration of the importance of single cell analysis. Analytical Methods. 7 (9), 3668-3670 (2015).
  21. Pan, N., Rao, W., Kothapalli, N. R., Liu, R., Burgett, A. W. G., Yang, Z. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Gong, X., et al. Single Cell Analysis with Probe ESI-Mass Spectrometry: Detection of Metabolites at Cellular and Subcellular Levels. Analytical Chemistry. 86 (8), 3809-3816 (2014).
  23. Lorenzo Tejedor, M., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. In Situ Molecular Analysis of Plant Tissues by Live Single-Cell Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (12), 5221-5228 (2012).
  24. Shimizu, T., et al. Live Single-Cell Plant Hormone Analysis by Video-Mass Spectrometry. Plant and Cell Physiology. 56 (7), 1287-1296 (2015).
  25. Yamamoto, K., et al. Cell-specific localization of alkaloids in Catharanthus roseus stem tissue measured with Imaging MS and Single-cell MS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (14), 3891 (2016).
  26. Date, S., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Direct Drug Metabolism Monitoring in a Live Single Hepatic Cell by Video Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 28 (3), 201 (2012).
  27. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  28. Masuda, K., Abouleila, Y., Ali, A., Yanagida, T., Masujima, T. Live Single-Cell Mass Spectrometry (LSC-MS) for Plant Metabolomics. BT – Plant Metabolomics: Methods and Protocols. , 269-282 (2018).
  29. Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Single oocyte and single embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 29-33 (2012).
  30. Ferreira, C. R., Pirro, V., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Developmental phases of individual mouse preimplantation embryos characterized by lipid signatures using desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (10), 2915-2926 (2012).
  31. Lee, J. K., Jansson, E. T., Nam, H. G., Zare, R. N. High-Resolution Live-Cell Imaging and Analysis by Laser Desorption/Ionization Droplet Delivery Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (10), 5453-5461 (2016).
  32. Bergman, H. -. M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  33. Yin, L., Zhang, Z., Liu, Y., Gao, Y., Gu, J. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry. Analyst. 144 (3), 824-845 (2019).
  34. González-Serrano, A. F., et al. Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Reveals Lipid Metabolism of Individual Oocytes and Embryos. PLoS ONE. 8 (9), e74981 (2013).
  35. Liu, Y., et al. Study on Variation of Lipids during Different Growth Phases of Living Cyanobacteria Using Easy Ambient Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (14), 7096-7102 (2014).
  36. Shrestha, B., et al. Subcellular Metabolite and Lipid Analysis of Xenopus laevis Eggs by LAESI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 9 (12), e115173 (2014).
  37. Stolee, J. A., Shrestha, B., Mengistu, G., Vertes, A. Observation of Subcellular Metabolite Gradients in Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 51 (41), 10386-10389 (2012).
  38. Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  39. Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and analysis of small cell populations and single cells by consecutive laser pulses. Applied Physics A. 101 (1), 121-126 (2010).
  40. Stolee, J. A., Vertes, A. Toward Single-Cell Analysis by Plume Collimation in Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (7), 3592-3598 (2013).
  41. Zhang, L., Vertes, A. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  42. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), (2015).
  43. Liu, R., Pan, N., Zhu, Y., Yang, Z. T-Probe: An Integrated Microscale Device for Online In Situ Single Cell Analysis and Metabolic Profiling Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90 (18), 11078-11085 (2018).
  44. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using Dicationic Ion-Pairing Compounds To Enhance the Single Cell Mass Spectrometry Analysis Using the Single-Probe: A Microscale Sampling and Ionization Device. Analytical Chemistry. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  45. Sun, M., Tian, X., Yang, Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Analytical Chemistry. 89 (17), 9069-9076 (2017).
  46. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass Spectrometry Measurement of Single Suspended Cells Using a Combined Cell Manipulation System and a Single-Probe Device. Analytical Chemistry. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  47. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 986-993 (2015).
  48. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), 53911 (2016).
  49. Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 124-134 (2016).
  50. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chemical Communications. 55 (5), 616-619 (2019).
  51. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic Studies of Live Single Cancer Stem Cells Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  52. Tian, X., Zhang, G., Shao, Y., Yang, Z. Towards enhanced metabolomic data analysis of mass spectrometry image: Multivariate Curve Resolution and Machine Learning. Analytica Chimica Acta. 1037, 211-219 (2018).
  53. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single Cell Isolation and Analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
  54. Wu, C., Wu, P., Zhao, H., Liu, W., Li, W. Clinical Applications of and Challenges in Single-Cell Analysis of Circulating Tumor Cells. DNA and Cell Biology. 37 (2), 78-89 (2017).
  55. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single Cell Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  56. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews. 22 (5), 332-364 (2003).

Tags

Single Cell AnalysisSingle-probe Mass SpectrometryIntegrated Cell Manipulation PlatformLiquid BiopsyCellular HeterogeneitySample PreparationPatient-derived CellsAmbient AnalysisGlass Probe FabricationMicroinjector Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells. J. Vis. Exp. (148), e59875, doi:10.3791/59875 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image