JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Интегрированная платформа манипулирования ячейками в сочетании с однозондом для анализа масс-спектрометрии наркотиков и метаболитов в односуспевающих клетках

Published: June 21, 2019
doi:
10.3791/59875
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Oklahoma

Summary

Интегрированная платформа манипуляции ячейками разработана для использования в сочетании с установкой масс-спектрометрии одного зонда для он-лайн анализа отдельных подвесных клеток в условиях окружающей среды.

Abstract

Одноклеточная масс-спектрометрия (SCMS) позволяет чувствительно обнаруживать и точно анализовать широкие диапазоны клеточных видов на индивидуальном уровне. Однозонд, микромасштабное устройство выборки и ионизации, может быть соединен с масс-спектрометром для он-лайн, быстрого анализа SCMS клеточных компонентов в условиях окружающей среды. Ранее метод одинзонд SCMS в основном использовался для измерения обездвижений клеток на субстрат, ограничивая типы клеток для исследований. В текущем исследовании, один зонд SCMS технология была интегрирована с системой манипуляции ячейки, как правило, используется для экстракорпорального оплодотворения. Эта интегрированная платформа для манипуляций и анализа клеток использует зонд выбора клеток для захвата идентифицированных отдельных плавающих ячеек и передачи клеток в наконечник одного зонда для микромасштабного лиза, за которым следует немедленный анализ масс-спектрометрии. Этот процесс захвата и передачи удаляет клетки из окружающего раствора до анализа, минимизируя введение матричных молекул в анализ масс-спектрометрии. Эта интегрированная установка способна анализом SCMS целевых изолированных клеток пациента, присутствующих в образцах жидкостей организма (например, моча, кровь, слюна и т.д.), что позволяет потенциальное применение анализа SCMS к человеческой медицине и биологии болезней.

Introduction

Биология человека, особенно биология болезней, все чаще понимается как результат деятельности на уровне отдельных клеток, но традиционные аналитические методы, такие как жидкая хроматография масс-спектрометрии (LCMS), как правило, используются для анализа образцы, подготовленные из популяций клеток, в то время как полученная молекулярная информация не может точно представлять химические процессы на уровне отдельных клеток. Эти стандартные, традиционные методы не способны различить влияние клеточной неоднородности на аналитическое измерение, а процесс разрушения и смешивания клеток для подготовки лисата потенциально приводит к изменению или потере клеточной компоненты1,2. Эти ограничения традиционных методов особенно важны при анализе клеток пациента, в которых полученные образцы могут содержать сложную смесь различных типов клеток. Для устранения этих недостатков все чаще разрабатываются и применяются методы молекулярного анализа одноклеточных клеток, включая одноклеточные методы масс-спектрометрии (SCMS), и применяются к биоанализу, особенно клеточных метаболитов и низкой молекулярной массе биомолекулы3,4.

Первые методы SCMS, разработанные использовали вакуумные методы длявыполнения анализов в неамбиаентных условиях 2,5,6,7,8,9, 10,11. Несвязанные методы SCMS способны анализировать клеточные липиды и метаболиты, но требуют предварительной обработки образцов в искусственных условиях, и поэтому не подходят для анализа в режиме реального времени. Процесс подготовки образца для неамбиентного анализа включает в себя добавление матричных компонентов, и этот препарат может изменять клеточные компоненты из их естественной среды12. Таким образом, методы окружающей среды масс-спектрометрии (MS), которые не требуют вакуума для среды отбора проб, используются для анализа клеток в почти родной среде. Отсутствие вакуумной среды обеспечивает универсальность в экспериментальном дизайне; камеры могут быть добавлены для мониторинга клеточного процесса и мягкие методы ионизации могут быть объединены с методами разделения, чтобы получить лучшую информацию от каждого одноклеточного эксперимента4,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40 ,41,42.

Метод одного зонда SCMS является методом окружающей среды, который анализирует живые, линии раковых клеток млекопитающих в почти родной среде21,43,44,45,46. Кроме того, однозондное устройство использовалось для других приложений масс-спектрометрии, включая анализ внеклеточных молекул в многоклеточных сфероидах и MS-изображение тканей47,48,49 ,50,51,52. Однако, так как иммобилизация клеток на субстратах требуется для этого метода, подвесные клетки не могут быть непосредственно проанализированы с помощью этой техники3,53. Таким образом, система msms одного зонда не могла быть непосредственно использована для отбора проб неприсоединения одноклеточных клеток, таких как неприсоединения клеточных линий или подвесных клеток, выделенных из крови пациента или других жидкостей организма54. В этой работе, интегрированная платформа манипуляции ячейки (ICMP) в сочетании с одним зондом SCMS техники для анализа живых, подвесных клеток на линии с минимальным подготовки образца (Рисунок 1)46. ICMP состоит из перевернутого микроскопа для мониторинга выбора клеток, зонда выбора стеклянных клеток, микроинжектора для захвата отдельных плавающих клеток, нагретой пластины для поддержания клеточной температуры, двух систем манипуляции ячейками для контроля пространственных движения как зонда выбора стеклянных клеток и одного зонда, так и цифрового микроскопа для наблюдения за передачей клеток от наконечника зонда выбора клеток к наконечнику одного зонда. Изготовление одного зонда подробно описано в предыдущих публикациях и не будет рассмотрено здесь21,48. Система ICMP/один зонд соединена с масс-спектротером высокого разрешения. Эта интегрированная установка позволяет выборки выявленных одиночных клеток из сложных биологических образцов с минимальными эффектами от матричных молекул.

Protocol

1. Изготовление зонда сточных клеток Преобразуйте одностворные стеклянные трубки в конические зонды с острым наконечником. Поместите одностворную стеклянную трубку (ID: 0,3 мм, OD: 1,1 мм) в зажимы вертикального держателя пипетки, центрируя стекло по отношению к нагревательной катушке и затягивайте, чтобы закрепить трубку на месте. Отопительная катушка состоит из 18-калиевого никель-хромового сопротивления проволоки (60 мм в длину), сворачивающей вокруг металлического стержня (диаметр омичка 3,90 мм) в 2,5 раза. Установите стеклянные трубки с температурной программой 19.5 (единица производителя). Этот параметр может быть изменен для конкретного инструмента. Установите соленоидный поршень на 4 (единица производителя). Этот параметр может быть изменен для конкретного инструмента. Триггер соленоид, чтобы вытащить стеклянные трубки. Этот шаг создает два зонда, слитых на кончике. Используйте пинцет, чтобы отрезать 1 мм от кончика каждого зонда, создавая обита в диаметре 10 мкм в диаметре на кончике зонда. Согните стеклянный зонд для легкого соединения с ICMP/однозондом SCMS. Установите вытащил стеклянный зонд в микрокузе, позиционирование наконечника на 3 мм выше платиновой отопительной проволоки. Включите тепло на платиновой проволоке до 30% от максимальной температуры. Согните зонд (45) от исходного положения(рисунок 2). 2. Интегрированная сборка платформы манипуляции ячейками Поместите перевернутый микроскоп, микроинжектор и две системы манипуляции ячейками на моторизованном столе для легкого соединения с масс-спектрометром. Измените одну из систем манипуляции ячейками для размещения одного зонда, заменив конец зажимом руки. Используйте пластиковый шприц с иглой, чтобы заполнить микроинжектор с минеральным маслом. Избегайте пузырьков в трубах, так как это повлияет на всасывание. Замените сценическую вставку перевернутого микроскопа на нагреваемую пластину. Установите нагретую пластину на 37 градусов по Цельсию до анализа. Настройка устройства для выбора стеклянных ячеек. Вставьте зонд выбора стеклянных клеток внутри металлического держателя микроинжектора, поместив длинную (не согнутую) сторону в держатель капилляра и затягивая винт, чтобы обеспечить зонд на месте. Расположите угол наконечника зонда параллельно с нагретой пластиной.ВНИМАНИЕ: Стеклянный зонд очень острый и хрупкий, и он легко ломается. Защитите глаза и будьте особенно осторожны при вставке зонда в микроинжектор. Закрепите металлический держатель микроинжектора в систему манипуляций ячейки. Расположите наконечник зонда всередине перевернутого света микроскопа. 3. Создайте расширенную ионную трубку для вхле масс-спектрометра Используйте металлический резак, чтобы вырезать кусок трубки из нержавеющей стали (OD: 0.0625 (1/16) в, ID: 0,021 дюйма) 250 мм в длину. Измерьте 135 мм от конца и поместите металлическую дикую атмосферу, так что 135 мм будут подвергаться воздействию атмосферы, а 115 мм будут находиться внутри масс-спектрометра. Закрепите одичатого с помощью двух гаечных кеги, чтобы затянуть его. 4. Пара ICMP с установкой одного зонда Закрепите стеклянную горку, содержащую один зонд, в зажим руки системы манипуляций ячейки.ПРИМЕЧАНИЕ: Однозонды изготавливаются в соответствии с ранее опубликованным протоколом48 с двумя незначительными изменениями в текущем исследовании: излучатель nano-ESI сделан дольше для легкого соединения с масс-спектротером, а однозонды приклеены к стеклу стороны на правой стороне, чтобы избежать вмешательства в пространственное движение устройства выбора стеклянных клеток(рисунок2). Подключите капилляр, обеспечивающий растворитель, к проводящему союзу, поместив капилляр в рукав (1/16 x .005 в) пластикового феррула и затягивая фитинг. Соедините другую сторону проводящий союз с капилляром (ID: 40 мкм, OD: 150 мкм), который соединен со шприцем, содержащим проектут выборку, поместив капилляр в рукав (1/32 x .007 дюйма) и затягивая примерку. Используйте ацетонитрил с 0,1% для мистовой кислоты в качестве пробного растворителя в этих экспериментах.ПРИМЕЧАНИЕ: Проектор выборки является гибким, но он должен в первую очередь содержать ацетонитрил (или ацетонитрил с formic кислоты для лучшей ионизации) для быстрого микромасштабного лизиса клеток. Закрепите шприц в шприц насос на масс-спектрометре. Поместите ионизацию вольтового шнура на медную проволоку, прикрепленную к проводному союзу. Расположите излучатель nano-ESI на 1 мм в проположение расширенной ионной трубки передачи. Используйте систему манипуляций ячейками для управления пространственными движениями однозонда и расположения излучателя nano-ESI централизованно перед расширенной трубкой переноса иона. 5. Подвесная подготовка образца клеток За день до анализа (18-24 ч), семена из клеток для тестирования в колбе клеточной культуры (T25). K562 человека миелоидных клеток лейкемии используются в качестве моделей в этом исследовании. Тепло 1x фосфат буферных солен (PBS) и Розуэлл Парк Мемориальный институт (RPMI) средний дополнен 10% синтетических фетальных сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина при 37 КК в течение 30 мин. Семя No 1 х 106 клеток в общей объеме 10 мл, сочетая клетки с теплой средой. В общем, используйте 10-мл пипетку, чтобы поместить 8 мл среды RPMI в колбу клеточной культуры. Затем используйте 2 мл пипетку, чтобы положить 2 мл смещаемых клеток K562 среды для 1 х 106 ячеек. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 до анализа. Подготовьте клетки к анализу. Клетки пипетки из колбы клеточной культуры в 15-мл центрифуги трубки. Спин клетки вниз на 400 х г и 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут и отбросить супернатант. Перепристой клетки в 4 мл среды RPMI, содержащей соединение препарата при желаемой концентрации лечения.ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа контрольных клеток, повторного приостановки клеток в 4 мл среды RPMI и перейти к шагу 6. Инкубировать клетки в течение всего времени лечения при 37градусах Цельсия и 5% CO 2. Спин-клетки вниз на 400 х г и 37 кв. c в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант. Клетки переплетываются в 10 мл PBS, а центрифуга на 400 х г и 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин. После вращения, отбросить супернатант. Повторите этот шаг 3 раза, чтобы свести к минимуму обнаружение препарата из внеклеточных компонентов. Resuspend клетки в 4 мл PBS для анализа. 6. Выполняйте измерения SCMS с помощью установки ICMP/одного зонда Настройте параметры для масс-спектрометра для эксперимента. Под заголовком Scan Mode программного обеспечения прибора выберите Define Scan. Используйте разрешение 60 000 м/м при м/з 400, 1 микроскан, 100 мс максимальное время впрыска и автоматический контроль усиления (AGC) на. Для экспериментов использовалась масса (м/з) 100-1000. Параметры могут быть изменены на основе модели прибора. При Syringe Pumpвыберите скорость потока 150 nL/min. Скорость потока должна быть оптимизирована для каждого эксперимента. Выберите источник NSI и примените напряжение в 4,5 кВ. Этот параметр также должен быть оптимизирован для каждого эксперимента. Включите перевернутый микроскоп (с 40-кратным увеличением, выбранным как для верхней пластины, так и для нижнего объектива) и подключите его к USB-порту ноутбука для захвата живых видео-каналов. Включите нагретую пластину и установите ее до 37 градусов по Цельсию. На компьютере перейдите на вкладку Acquire Data и выберите непрерывно под acquire Time. Подготовьте образец для анализа. Пипетка 2-3 мл образца в крышку небольшой чашки Петри (35 мм х 12 мм). 6.4.2 Расположите образец в центре света от перевернутого микроскопа поверх нагретой пластины. Подготовьте зонд для отбора стеклянных клеток для анализа. Используйте систему манипуляций ячейки для перемещения зонда, чтобы его кончик был сосредоточен под перевернутым микроскопом в той же плоскости, что и клетки. Выберите для анализа отдельную ячейку. Используйте систему манипуляций ячейки, чтобы переместить наконечник зонда выбора ячейки в целевую ячейку. Этот процесс контролируется с помощью перевернутого микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: Если кончик зонда выбора ячейки не может быть сфокусирован в той же плоскости, что и клетки, возможно, что изогнутая часть зонда не имеет под углом. Отрегулируйте положение зонда выбора клетки до тех пор пока оба подсказки зонда не сфокусировать вместе с клетками под микроскопом. Аккуратно поверните ручку микроинжектора, чтобы отрегулировать положение минерального масла внутри трубки. Нежный всасывания обеспечивается микроинжектора для обеспечения целевой ячейки ячейки ячейки зонда кончика.ПРИМЕЧАНИЕ: Если ячейка не может быть захвачена зондом выбора ячейки через силу всасывания, проверьте зонд выбора ячейки, чтобы убедиться, что он полностью вставлен в держатель капилляра. Кроме того, проинспектировать уровни минерального масла в микроинжектора и труб, и изгнать воздух, если таковые имеются. Используйте систему манипуляций ячейки для перемещения ячейки на кончике зонда-выбора клеток к наконечнику одного зонда, используя цифровой микроскоп, ориентированный на наконечник одного зонда, чтобы контролировать этот процесс. При прикосновении, небольшая капля ацетонитрила на наконечнике одного зонда индуцирует быстрые лизы клетки, а затем клеточный лизат немедленно ионизируется для он-лайн анализа MS.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку выбранная ячейка закреплена на наконечнике зонда выбора клеток через нежный всасывание, эта ячейка может быть потенциально отделена во время ее передачи в наконечник одного зонда. Поэтому, если ионные сигналы типичных клеточных липидов (см. репрезентативные результаты ниже) не наблюдаются в течение 5 с, возможно, что клетка стала непривязанной, и необходим выбор другой клетки.

Representative Results

Во-первых, для создания экспериментального метода используются необработанные клетки K562. В типичном эксперименте SCMS, очевидные изменения масс-спектра можно наблюдать от передачи клетки, во время обнаружения клеточного содержимого, и после окончания измерения(Рисунок S1). Три общих клеточных липидных пика (фосфатидилхолин, ПК), в том числе ПК (34:4)(м/з 754.536), PC (36:4)(м/z 782.567) и PC (38:5)(м/z 808.583), контролируются для обеспечения успешной передачи клетки и клеточной содержимое обнаружено(рисунок S2)21,43,46,55,56. Если липидные пики не видны в пределах 5 с, уровень минерального масла в микроинжекторе изменяется, чтобы уменьшить всасывание, удерживая клетку на кончике зонда клеточного отбора; осторожность должна быть принята так, что минеральное масло не выталкивается из клеточного селекции зонда. Личность многих ПК в массовом диапазоне м /z 750-850 подтверждена с помощью MS/MS на необработанных образцах клеточного лисата (рисунок3, Рисунок S2, Таблица 1)46. Клетки K562 также подвергаются лечению различными лекарственными соединениями, чтобы расширить универсальность метода. Клетки K562 инкубируются гемцитабином (1 мкм) и таксолом (1 мкм) на 1 ч и OSW-1 (100 нм, 1 ММ) на 4 ч и 2 ч соответственно. Клетки затем промывают pbS, чтобы свести к минимуму обнаружение соединений препарата от внеклеточного содержания. Вклад матрицы (например, ионы от среды клеточной культуры, PBS и растворителя) в масс-спектры клеточного содержимого могут быть устранены с помощью вычитания данных, из-за их значительно различных ионных сигналов(рисунок S3). Все три соединения наркотиков обнаружены с помощью ICMP / однозонд MS установки(Рисунок S4)46. Эти результаты показывают, что этот метод может быть использован для изучения внутриклеточных липидов, препаратов и метаболитов на одноклеточном уровне из клеток в растворе в почти родной среде. Рисунок 1. Экспериментальная установка для экспериментов MS с одной подвесной ячейкой. (A) Интегрированная платформа манипуляции ячейками (ICMP) в сочетании с масс-спектрометром. (B) Схема для анализа взвешенных клеток. (C) Экспериментальный вид клеток K562, которые будут выбраны с помощью зонда выбора клеток. Перепечатано с разрешения Standke et al.46. Авторское право 2019 Американское химическое общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2. Фотографии модифицированного однозонда и зонда выбора клеток, используемых для экспериментов с одной подвесной ячейкой MS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3. Увеличенный масс-спектр из одной клетки, показывающий представительный вид(м/з 750-850). Химические структуры подтверждаются с помощью анализа MS/MS(рисунок S1). Перепечатано с разрешения Standke et al46. Авторское право 2019 Американское химическое общество. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Молекула препарата (англ.) м/з Массовая ошибка (ppm) (Гемцитабин и H) + 264.076 11.32 Для того, чтобы (Таксол и На) + 876.318 2.74 (OSW-1) + 895.445 0,89 Сотовые липиды (PC(34:4) + 754.535 3.71 (PC(34:3) + 756.551 3,44 (PC(34:2) + 758.569 0,66 (PC(36:5) + 780.551 3,07 (PC(36:4) + 782.568 2.17 (PC(36:3) + 784.585 0,64 (PC(38:7) + 804.551 4.1 (PC(38:6) + 806.567 2.48 (PC(38:5) + 808.583 2.72 (PC(38:4) + 810.601 0.00 (PC(40:7) + 832.583 3.12 12.12.2.2. Таблица 1. Идентифицированы клеточные компоненты с помощью установки ICMP/Single-probe. Обнаружение всех лекарственных соединений было подтверждено путем сравнения результатов MS/MS со стандартным соединением.

Discussion

Интегрированная платформа для манипуляций и анализа ячейки построена для расширения универсальности метода MS с одним зондом, что позволяет проводить он-лайн, быстрый анализ неприсоединения клеток в почти родной среде. Основным преимуществом метода является то, что требуется минимальный отбор образцов, поэтому клетки анализируются в условиях, имитирующих их стандартное состояние. В частности, отдельные клетки, представляющие интерес, могут быть визуально идентифицированы и выбраны, сведя к минимуму влияние матричного влияния на эффективность ионизации MS при сохранении клеток в их естественной среде обитания, поэтому результаты являются более репрезентативными клетками родной статус(Рисунок S3). Этот метод может быть потенциально использован для изучения клеток пациента приостановлено в биожидкости в будущих исследованиях. Еще одним преимуществом этого метода является гибкий выборочный растворитель. Важно включить ацетонитрил в качестве основного растворителя выборки, так что микромасштабный лиза может произойти быстро. Потенциально внутренние стандарты (например, изотопно-маркированные лекарственные соединения) могут быть добавлены в проектный состав выборки для количественной оценки молекул, представляющих интерес (например, молекулы лекарств) отдельных клеток, в том числе и те, которые могут играть ключевую роль в революции персонализации лечения наркомании в будущем54.

Хотя эта интегрированная система может быть удобно использована для анализа широких диапазонов клеток, ограничение метода заключается в том, что ни один зонд, ни зонд-выбор ячейки зондней не доступны коммерчески; диктует необходимость оптимизации многих параметров (например, скорость потока, напряжение, длина между излучателем нано-ESI и трубками переноса иона и т.д.) до каждого эксперимента. Кроме того, из-за малости зонда с однозондом и зондом отбора клеток возмущение окружающей среды (например, поток воздуха) может привести к трудностям с созданием соединения между двумя зондами. Краткосрочным решением является изгиб зонда выбора клеток близко к концу, чтобы свести к минимуму длину сужающихся. Будущая работа включает в себя разработку жилья, чтобы огразать важнейшие части установки, чтобы свести к минимуму воздействие на окружающую среду. Из-за ограниченного количества клеточного содержимого и короткого времени приобретения (2-3 с) из клетки, MS / MS анализ может быть проведен только для относительно обильных видов. Другие факторы, влияющие на чувствительность обнаружения включают подавленной эффективности ионизации в связи с введением матрицы вместе с клеткой и потенциальной потерей иона через расширенные трубки передачи ионов.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Нагу Раму Котхапалли за ее работу по разработке подготовки образцов как для подвесных клеток, так и для экспериментов с клеточными лизатными. Кроме того, авторы благодарят NIH (R01GM116116 и R21CA204706) за финансирование.

Materials

Acetontrile Millipore Co. AX0145-1 Sampling solvent
CellTram Vario Eppendorf 6221 ICMP
Copper wire stores.ebay.com/jewelerheaven Dead soft, round, 20 guage, 25 ft Conductive union setup
Digital stereomicroscope Shenzhen D&F Co. Supereyes T004 Analysis
Disposable micropipette, 1-5 µL Rochester Scientific 5065 Cell-selection probe fabrication
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" Friedrich & Dimmock, Inc. MBT-005-020-2Q Single-probe fabrication
Epoxy resin Devcon Part No. 20945 Single-probe fabrication
Eppendorf cell manipulation system Eppendorf Transferman NK517800397-U.R. ICMP
External nut VALCO*CHEMINERT EN1 Ion transfer tube fabrication
Formic acid Sigma-Aldrich 399388-500ML Sampling solvent
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm Polymicro Technologies TSP040105 Single-probe fabrication, conductive union setup
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm Polymicro Technologies 1068150015 Conductive union setup
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) Fischer Sci SH3006603 Cell culture
Inline MicroFilter IDEX Health & Science LLC M-520 Conductive union setup
Laser puller Sutter Instrument Co. Model P-2000 Single-probe fabrication
LED UV lamp Foshan Liang Ya Dental Equipment LY-C240 Single-probe fabrication
LTQ Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL Analysis
Microforge Narishige, Co. MF-9 Cell-selection probe fabrication
Microunion IDEX Health & Science LLC M-539 Conductive union
PEEK tubing, 1/32×0.005x 5ft IDEX Health & Science LLC 1576 Conductive union setup
PEEK tubing, 1/32×0.007x 5ft IDEX Health & Science LLC 1577 Conductive union setup
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies 15140-122 Cell culture
Petri dish, 35×10 mm VWR 25382-334 Sample preparation
Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 0780-50L Cell culture
Platinum wire Narishige, Co. Model PT-A Microforge
Power supply Nikon PSM-2120 ICMP
RPMI, 1X with Corning glutagro Corning 10-104-CV Cell culture
Single-bore tubes Boralex 5065 Cell-selection probe fabrication
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD IDEX Health & Science LLC VHP-200-01x Ion transfer tube fabrication
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm IDEX Health & Science LLC U-1128 Ion transfer tube fabrication
Syringe, 250 µL Hamilton 1725LTN250UL Sampling syringe
T25 flask CellStar 690160 Cell culture
Thermo LTQ XL ion source interface flange New Objective PB5500 Analysis
ThermoPlate TokaiHit 55R30N ICMP
TrypLE Express Gibco 12605-010 Cell culture
Tube cutter, for 1/16" stainless steel SUPELCO 58692-U Ion transfer tube fabrication
USB digital photography microscope dx.com SO2 25~500X Analysis
UV curing resin Prime Dental Item No. 006.030 Single-probe fabrication
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Cell-selection probe fabrication
Voltage housing PicoChip PCH-A00120 ICMP/MS interface
Wire cutter Craftsman 4 1/2 in end nipper Conductive union setup
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mao, S., et al. In Scatheless Cell Detachment Reveals Correlation between Adhesion Strength and Viability at Single-Cell Resolution. Angewandte Chemie International Edition. 57 (1), 236-240 (2017).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  3. Linwen, Z., Akos, V. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2017).
  4. Chen, X., et al. Single-cell analysis at the threshold. Nature Biotechnology. 34, 1111 (2016).
  5. Fu, Q., Tang, J., Cui, M., Xing, J., Liu, Z., Liu, S. Application of porous metal enrichment probe sampling to single cell analysis using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Journal of Mass Spectrometry. 51, (2016).
  6. Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-Cell Lipidomics: Characterizing and Imaging Lipids on the Surface of Individual Aplysia californica Neurons with Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (4), 2231-2238 (2013).
  7. Passarelli, M. K., et al. Single-Cell Analysis: Visualizing Pharmaceutical and Metabolite Uptake in Cells with Label-Free 3D Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 87 (13), 6696-6702 (2015).
  8. Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary Ion MS Imaging To Relatively Quantify Cholesterol in the Membranes of Individual Cells from Differentially Treated Populations. Analytical Chemistry. 79 (10), 3554-3560 (2007).
  9. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  10. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. Journal of Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  11. Ong, T. -. H., Tillmaand, E. G., Makurath, M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry-based characterization of endogenous peptides and metabolites in small volume samples. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 732-740 (2015).
  12. Yang, Y., Huang, Y., Wu, J., Liu, N., Deng, J., Luan, T. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  13. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip. 7 (4), 423-440 (2007).
  14. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  15. Fujii, T., et al. Direct metabolomics for plant cells by live single-cell mass spectrometry. Nature Protocols. 10, 1445 (2015).
  16. Esaki, T., Masujima, T. Fluorescence Probing Live Single-cell Mass Spectrometry for Direct Analysis of Organelle Metabolism. Analytical Sciences. 31 (12), 1211-1213 (2015).
  17. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live Single-Cell Molecular Analysis by Video-Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 24 (5), 559-561 (2008).
  18. Mizuno, N., Harada, T., Masujima, T., T, H. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. , (2008).
  19. Phelps, M., Hamilton, J., Verbeck, G. F. Nanomanipulation-coupled nanospray mass spectrometry as an approach for single cell analysis. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 124101 (2014).
  20. Phelps, M. S., Verbeck, G. F. A lipidomics demonstration of the importance of single cell analysis. Analytical Methods. 7 (9), 3668-3670 (2015).
  21. Pan, N., Rao, W., Kothapalli, N. R., Liu, R., Burgett, A. W. G., Yang, Z. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Gong, X., et al. Single Cell Analysis with Probe ESI-Mass Spectrometry: Detection of Metabolites at Cellular and Subcellular Levels. Analytical Chemistry. 86 (8), 3809-3816 (2014).
  23. Lorenzo Tejedor, M., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. In Situ Molecular Analysis of Plant Tissues by Live Single-Cell Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (12), 5221-5228 (2012).
  24. Shimizu, T., et al. Live Single-Cell Plant Hormone Analysis by Video-Mass Spectrometry. Plant and Cell Physiology. 56 (7), 1287-1296 (2015).
  25. Yamamoto, K., et al. Cell-specific localization of alkaloids in Catharanthus roseus stem tissue measured with Imaging MS and Single-cell MS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (14), 3891 (2016).
  26. Date, S., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Direct Drug Metabolism Monitoring in a Live Single Hepatic Cell by Video Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 28 (3), 201 (2012).
  27. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  28. Masuda, K., Abouleila, Y., Ali, A., Yanagida, T., Masujima, T. Live Single-Cell Mass Spectrometry (LSC-MS) for Plant Metabolomics. BT – Plant Metabolomics: Methods and Protocols. , 269-282 (2018).
  29. Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Single oocyte and single embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 29-33 (2012).
  30. Ferreira, C. R., Pirro, V., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Developmental phases of individual mouse preimplantation embryos characterized by lipid signatures using desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (10), 2915-2926 (2012).
  31. Lee, J. K., Jansson, E. T., Nam, H. G., Zare, R. N. High-Resolution Live-Cell Imaging and Analysis by Laser Desorption/Ionization Droplet Delivery Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (10), 5453-5461 (2016).
  32. Bergman, H. -. M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  33. Yin, L., Zhang, Z., Liu, Y., Gao, Y., Gu, J. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry. Analyst. 144 (3), 824-845 (2019).
  34. González-Serrano, A. F., et al. Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Reveals Lipid Metabolism of Individual Oocytes and Embryos. PLoS ONE. 8 (9), e74981 (2013).
  35. Liu, Y., et al. Study on Variation of Lipids during Different Growth Phases of Living Cyanobacteria Using Easy Ambient Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (14), 7096-7102 (2014).
  36. Shrestha, B., et al. Subcellular Metabolite and Lipid Analysis of Xenopus laevis Eggs by LAESI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 9 (12), e115173 (2014).
  37. Stolee, J. A., Shrestha, B., Mengistu, G., Vertes, A. Observation of Subcellular Metabolite Gradients in Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 51 (41), 10386-10389 (2012).
  38. Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  39. Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and analysis of small cell populations and single cells by consecutive laser pulses. Applied Physics A. 101 (1), 121-126 (2010).
  40. Stolee, J. A., Vertes, A. Toward Single-Cell Analysis by Plume Collimation in Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (7), 3592-3598 (2013).
  41. Zhang, L., Vertes, A. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  42. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), (2015).
  43. Liu, R., Pan, N., Zhu, Y., Yang, Z. T-Probe: An Integrated Microscale Device for Online In Situ Single Cell Analysis and Metabolic Profiling Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90 (18), 11078-11085 (2018).
  44. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using Dicationic Ion-Pairing Compounds To Enhance the Single Cell Mass Spectrometry Analysis Using the Single-Probe: A Microscale Sampling and Ionization Device. Analytical Chemistry. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  45. Sun, M., Tian, X., Yang, Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Analytical Chemistry. 89 (17), 9069-9076 (2017).
  46. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass Spectrometry Measurement of Single Suspended Cells Using a Combined Cell Manipulation System and a Single-Probe Device. Analytical Chemistry. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  47. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 986-993 (2015).
  48. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), 53911 (2016).
  49. Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 124-134 (2016).
  50. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chemical Communications. 55 (5), 616-619 (2019).
  51. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic Studies of Live Single Cancer Stem Cells Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  52. Tian, X., Zhang, G., Shao, Y., Yang, Z. Towards enhanced metabolomic data analysis of mass spectrometry image: Multivariate Curve Resolution and Machine Learning. Analytica Chimica Acta. 1037, 211-219 (2018).
  53. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single Cell Isolation and Analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
  54. Wu, C., Wu, P., Zhao, H., Liu, W., Li, W. Clinical Applications of and Challenges in Single-Cell Analysis of Circulating Tumor Cells. DNA and Cell Biology. 37 (2), 78-89 (2017).
  55. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single Cell Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  56. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews. 22 (5), 332-364 (2003).

Tags

Single Cell AnalysisSingle-probe Mass SpectrometryIntegrated Cell Manipulation PlatformLiquid BiopsyCellular HeterogeneitySample PreparationPatient-derived CellsAmbient AnalysisGlass Probe FabricationMicroinjector Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells. J. Vis. Exp. (148), e59875, doi:10.3791/59875 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image