単一懸濁細胞における薬物および代謝産物の質量分析分析のための単一プローブと結合された統合細胞操作プラットフォーム

1. ガラス細胞選択プローブ製作 シングルボアガラスチューブを鋭利な先端でテーパードプローブに変換します。 シングルボアガラスチューブ(ID:0.3mm、OD:1.1.mm)を垂直ピペットホルダーのクランプに入れ、加熱コイルに対してガラスを中心に締め付け、チューブを固定します。加熱コイルは、金属棒(直径=3.90mm)の周りに巻かれた18ゲージのニッケルクロム抵抗ワイヤー(長さ約60mm)で構成され、2.5倍です。 ガラス管に温度プログラム19.5(メーカーの単位)を設定します。このパラメータは、特定の計測器に対して変更できます。 ソレノイドプランジャーを4(メーカーユニット)にセットします。このパラメータは、特定の計測器に対して変更できます。 ソレノイドを引き起こしてガラス管を引っ張ります。このステップでは、先端に融合した2つのプローブが作成されます。 ピンセットを使用して各プローブの先端から約1mm離し、プローブ先端に直径約10μmのオリフィスを作成します。 ICMP/シングルプローブSCMSセットアップに簡単にカップリングするためのガラスプローブを曲げます。 引っ張られたガラスプローブをマイクロフォージにセットし、先端をプラチナ加熱ワイヤーの上に約3mm上に置きます。 白金線の熱を最高温度の30%にします。 プローブを元の位置から~45°曲げる(図2)。 2. 統合されたセル操作プラットフォームアセンブリ 反転顕微鏡、マイクロインジェクタ、および2つの細胞操作システムを電動テーブル上に置き、質量分析計と容易に結合します。 端部をアーム クランプに置き換えることで、単一プローブに対応するようにセル操作システムの 1 つを変更します。 マイクロインジェクターにミネラルオイルを充填するには、針でプラスチック製の注射器を使用します。これは吸引に影響を与えるので、チューブ内の気泡を避けてください。 反転顕微鏡のステージインサートを加熱プレートに交換します。分析前に加熱プレートを37°Cに設定します。 ガラスセル選択装置を設定します。 マイクロインジェクターの金属ホルダー内にガラスセル選択プローブを挿入し、長い(曲げのない)側をキャピラリーホルダーに入れ、ネジを締め付け、プローブを所定の位置に固定します。プローブ先端の角度を加熱プレートに平行に配置します。注意:ガラスプローブは非常にシャープで壊れやすく、簡単に壊れます。マイクロインジェクターにプローブを挿入する際は、目を保護し、特に注意してください。 マイクロインジェクターの金属ホルダーをセル操作システムに固定します。プローブ先端を反転顕微鏡光の中央付近に配置します。 3. 質量分析計の入り込み用に拡張イオン転写管を作成する 金属カッターを使用して、ステンレス鋼チューブ(OD:0.0625(1/16))で、ID:0.021インチ)~250mmの長さで切断します。 端部から135mmを測定し、金属の野生を配置するので、〜135ミリメートルは大気にさらされ、〜115ミリメートルは質量分析計の内部になります。2つのレンチを使用して野生を固定し、それを締めます。 4. ICMPをシングルプローブ設定と組み合わせて シングルプローブを含むガラススライドをセル操作システムのアームクランプに固定します。注:単一プローブは、現在の研究で2つのマイナーな変更を伴う以前に公開されたプロトコル48に従って製造される:ナノESIエミッタは質量分析計への容易な結合のために長く作られ、単一のプローブはガラスに接着されるガラスセル選択装置の空間的な動きに干渉しないように、右側の側(図2)。 溶剤を供給する毛細血管を導電性組合に接続し、毛細血管をプラスチックフェルールのスリーブ(1/16 x .005インチ)に入れ、フィッティングを指で締める。 導電性ユニオンの反対側をキャピラリー(ID:40 μm、OD:150 μm)に接続し、サンプリング溶媒を含むシリンジに接続し、キャピラリーをスリーブ(1/32 x.007インチ)に入れ、フィッティングを締めます。これらの実験では、0.1%ギ酸を含むアセトニトリルをサンプリング溶媒として使用します。注:サンプリング溶媒は柔軟ですが、主に急速なマイクロスケール細胞溶解のためにアセトニトリル(またはギ酸を含むアセトニトリル)を含む必要があります。 質量分析計のシリンジポンプにシリンジを固定します。 電導性ユニオンに取り付けられた銅線の上にイオン化電圧コードを置きます。 ナノESIエミッタを拡張イオン転写管のオリフィスに約1mm置きます。 細胞操作システムを使用して、シングルプローブの空間的な動きを制御し、拡張イオン転送チューブの前にナノESIエミッタを中央に配置します。 5. 中断された細胞サンプルの調製 分析の前日(〜18〜24時間)、細胞培養フラスコ(T25)で試験用の細胞を種を出す。K562ヒト骨髄性白血病細胞を本研究のモデルとして用いられる。 熱1xリン酸緩衝生理食生(PBS)とロズウェルパーク記念研究所(RPMI)培地は、10%合成ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン連鎖マイシンを30分間30分間補充した。 細胞を温暖培地と組み合わせて10mLの総体積でシード~1×106細胞を播種する。一般に、10mLピペットを使用して、8 mLのRPMI培地を細胞培養フラスコに入れます。次いで、2mLピペットを用いて、2mLのコンフルエントK562細胞を~1×106細胞用の培地に入れる。 分析するまで37°Cおよび5%CO2で細胞をインキュベートする。 分析用にセルを準備します。 細胞培養フラスコから15mL遠心管にピペット細胞を入れます。 400 x gと37 °Cで5分間セルをスピンダウンし、上清を廃棄します。 所望の治療濃度で薬物化合物を含有するRPMI培地の4mLで細胞を再懸濁する。注: コントロールセルの解析では、RPMI 培地の 4 mL でセルを再中断し、ステップ 6にスキップします。 37°Cおよび5%CO2で処理時間の持続時間のために細胞をインキュベートする。 400 x gと37 °Cで5分間セルをスピンダウンし、上清を吸引します。 細胞はPBSの10 mLで再懸濁し、遠心分離機は400 x gおよび37°Cで5分間である。回転後、上清を捨てます。細胞外成分からの薬物の検出を最小限に抑えるために、この手順を3回繰り返します。 分析のためにPBSの4 mLで細胞を再中断する。 6. ICMP/シングル・プローブ・セットアップを使用してSCMS測定を実行する 実験用の質量分析計のパラメータをカスタマイズします。 計測器ソフトウェアの[スキャンモード]見出しで、[スキャンの定義]を選択します。m/z 400、1マイクロスキャン、100ミリ秒の最大射出時間、自動ゲイン制御(AGC)で60,000 m/mの解像度を使用します。実験には100~1000の質量範囲(m/z)を利用した。パラメータは、計測器モデルに基づいて変更できます。 シリンジポンプでは、150 nL/minの流量を選択し、各実験に最適化する必要があります。 NSIソースを選択し、約4.5 kVの電圧を印加します。このパラメータは、実験ごとに最適化する必要もあります。 反転顕微鏡(トッププレートとボトムレンズの両方に40倍の倍率を選択)をオンにし、ノートパソコンのUSBポートに接続してライブビデオフィードをキャプチャします。加熱プレートの電源を入れ、37°Cに設定します。 コンピュータで[データの取得]タブに移動し、[取得時間]の下にある [継続的に]を選択します。 分析用のサンプルを準備します。 小さいペトリ皿(35 mm x 12 mm)のふたにサンプルのピペット2-3 mL。 6.4.2 加熱されたプレートの上に反転顕微鏡から光の中心にサンプルを配置します。 分析用のガラスセル選択プローブを準備します。細胞操作システムを使用してプローブを動かして、先端が細胞と同じ平面内の反転顕微鏡の下に集中するようにします。 分析用に個々のセルを選択します。 セル操作システムを使用して、セル選択プローブの先端をターゲットセルに移動します。このプロセスは、反転顕微鏡を使用して監視されます。注: セル選択プローブの先端をセルと同じ平面に集めることができない場合は、プローブの曲がった部分が適切に角度付けされていない可能性があります。両方のプローブの先端が顕微鏡下の細胞と一緒に焦点を合わせることができるまで、細胞選択プローブの位置を調整します。 マイクロインジェクターのハンドルをそっと回して、チューブ内の鉱物油の位置を調整します。マイクロインジェクターによって穏やかな吸引が提供され、標的細胞を細胞選択プローブ先端に固定します。注:吸引力を介して細胞選択プローブで細胞を捕捉できない場合は、細胞選択プローブをチェックして、毛細管ホルダーに完全に挿入されていることを確認してください。また、マイクロインジェクターとチューブ内の鉱物油レベルを検査し、空気があれば排出します。 細胞操作システムを使用して、単一プローブ先端に焦点を当てたデジタル顕微鏡を使用して、細胞選択プローブ先端の細胞を単一プローブ先端に移動させ、このプロセスを監視します。触れると、単一プローブ先端の小さなアセトニトリル液滴が細胞の急速なlysesを誘発し、その後、細胞リサートは、オンラインMS分析のために直ちにイオン化されます。注: 選択したセルは、穏やかな吸引を通じてセル選択プローブの先端に固定されているため、このセルはシングルプローブ先端への転送中にデタッチされる可能性があります。したがって、典型的な細胞脂質のイオンシグナル(以下の代表的な結果を参照)が5s以内に観察されない場合、細胞が取り付け解除され、異なる細胞の選択が必要となる可能性がある。