משולב תאים מניפולציה פלטפורמה ביחד עם יחיד-בדיקה עבור ניתוח ספקטרומטר המסה של תרופות מטבוליטים בתאים ההשעיה יחיד

1. בחירת תא זכוכית לייצור בדיקה המר בודד צינורות זכוכית לתוך לווין מחודדות עם טיפ חדה. מניחים צינור זכוכית בודד (מזהה: 0.3 מ”מ, OD: 1.1. mm) לתוך התפסים של מחזיק פיפטה אנכי, מרכוז הזכוכית ביחס סליל החימום ולהדק כדי לאבטח את הצינור במקום. סליל חימום מורכב כבל ההתנגדות 18 כרום ניקל (~ 60 mm אורך) מתפתל על מוט מתכת (קוטר = 3.90 מ”מ) 2.5 פעמים. להגדיר את אבובים זכוכית עם טמפרטורה תוכנית 19.5 (יחידת היצרן). ניתן לשנות פרמטר זה עבור כלי מסוים. הגדר את הסולנואיד ב-4 (יחידת היצרן). ניתן לשנות פרמטר זה עבור כלי מסוים. תפעיל את הסולנואיד. כדי למשוך את צינור הזכוכית שלב זה יוצר שני רגשים התמזגו בקצה. השתמש מלקחיים לחתוך ~ 1 מ”מ מהקצה של כל לווין, יצירת הפתח של ~ 10 יקרומטר בקוטר בקצה המכשיר. לכופף את בדיקה זכוכית עבור צימוד קל ההתקנה של ICMP/בדיקה יחיד SCMS. להגדיר בדיקה זכוכית משכה לתוך מיקרופורג, מיקום הטיפ ~ 3 מ”מ מעל חוט החימום פלטינה. הפעל את החום על חוט הפלטינה ל -30% מטמפרטורת המקסימום. לכופף את החללית ~ 45 ° מהמיקום המקורי (איור 2). 2. פלטפורמת מניפולציה משולבת הרכבה מניחים את המיקרוסקופ ההפוך, microinjector זרק, ושני מערכות מניפולציה תאים על שולחן ממונע עבור צימוד קל עם ספקטרומטר המסה. שנה את אחת ממערכות הטיפול בתאים כדי להכיל לווין יחיד על-ידי החלפת הקצה בתפס זרוע. השתמש מזרק פלסטיק עם מחט כדי למלא את המיקרומזרק עם שמן מינרלי. להימנע בועות אבובים כמו זה ישפיע על השאיבה. החליפו את הוספת השלב של המיקרוסקופ ההפוך עם הצלחת המחוממת. הגדר את הצלחת המחוממת ב-37 ° c לפני הניתוח. הגדר את התקן בחירת תא הזכוכית. הכנס את הזכוכית בחירת התא בתוך מחזיק מתכת של מיקרו מזרק על ידי הצבת ארוך (לא מכופף) צד לתוך המחזיק נימי והידוק הבורג כדי לאבטח את המקדח במקום. הצב את זווית קצה המכשיר במקביל לצלחת המחוממת.התראה: בדיקת הזכוכית חדה מאוד ושברירית, והיא נשברת בקלות. להגן על העיניים שלך להיות זהיר במיוחד תוך החדרת הגשוש לתוך מיקרו מזרק. אבטח את מחזיק המתכת של המיקרומזרק לתוך מערכת מניפולציה התא. הצב את קצה המכשיר בסמוך למרכז אור המיקרוסקופ ההפוך. 3. צור צינור העברת יונים מורחב לספקטרומטר המסה השתמש בחותך מתכת כדי לגזור פיסת צינורות נירוסטה (OD: 0.0625 (1/16) ב, מזהה: 0.021 ב) ~ 250 מ”מ באורך. למדוד 135 מ”מ מהסוף ומקום ברחוב מתכת כל כך ~ 135 מ”מ יהיה חשוף האטמוספירה ~ 115 מ”מ יהיה בתוך ספקטרומטר המסה. אבטחו את הרחוב בעזרת שני. מכלים כדי להדק אותו 4. הזוג ICMP עם התקנה יחידה בדיקה אבטחו את שקופית הזכוכית המכילה את המקדח היחיד לתוך מהדק הזרוע של מערכת הטיפול בתאים.הערה: חד-הרגשים מיוצרים על פי פרוטוקול48 שפורסם בעבר, עם שני שינויים קלים במחקר הנוכחי: פולט NANO-ESI מתבצע זמן רב יותר לצורך חיבור קל לספקטרומטר המסה, והחד-בדיקה מודבקים לזכוכית בצד הימני כדי למנוע הפרעה לתנועה המרחבית של המכשיר בחירת תא הזכוכית (איור 2). לחבר את הממס-מתן נימי לאיחוד מוליך על ידי הצבת הקפילר לתוך השרוול (1/16 x .005 in) של שלטון פלסטיק ואצבע הידוק המדידה. חבר את הצד השני של האיחוד המוליך לקפילר (ID: 40 μm, OD: 150 μm), המחובר למזרק המכיל את הממיסים, על ידי הצבת הקפילר בשרוול (1/32 x .007 in) והידוק המדידה. השתמש acetonitrile עם 0.1% החומצה פורמית כמו ממיס הדגימה בניסויים אלה.הערה: ממיס הדגימה גמישה, אך היא צריכה בעיקר להכיל acetonitrile (או acetonitrile עם חומצה פורמית לאינון טוב יותר) לפירוק תאים מיקרו בקנה מידה מהיר. אבטח את המזרק לתוך משאבת המזרק. על ספקטרומטר המסה הנח את כבל המתח של אינון על חוט נחושת המחובר לאיחוד המוליך. מקם את הפולט nano-ESI ~ 1 מ”מ עד לפתח הצינור של העברת היונים המורחבת. השתמש במערכת מניפולציה התא כדי לשלוט על התנועות המרחביים של הבדיקה היחידה ולמקם את פולט ננו-ESI מרכזי מול אבובים העברת יון מורחב. 5. הכנה לדגימת תא מושעה יום לפני הניתוח (~ 18-24 h), הזרע את התאים לבדיקת בקבוקון תרבות התא (T25). K562 בתאי לוקמיה מיאלואידית אנושית משמשים כמודלים במחקר זה. חום 1x פוספט באגירה מלוחים (PBS) ו רוזוול פארק הזיכרון מכון (RPMI) בינוני עם 10% סרום סינתטי העוברי (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 ° c עבור 30 דקות. זרעי ~ 1 x 106 תאים בנפח כולל של 10 mL על ידי שילוב תאים עם בינוני חם. באופן כללי, השתמש בפיפטה בגודל 10 מ”ל כדי למקם 8 מ ל של RPMI לתוך בקבוקון תרבות התא. לאחר מכן, השתמש בפיפטה 2 מ”ל כדי לשים 2 מ ל של confluent K562 תאים בינוני עבור ~ 1 x 106 תאים. מודאת התאים ב 37 ° צ’ ו 5% CO2 עד ניתוח. הכן תאים לניתוח. . בתוך שפופרת צנטריפוגה של 15 מ ל בתאי ספין למטה ב 400 x g ו 37 ° צ’ עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant. להשעות את התאים ב 4 מ ל של RPMI בינוני המכיל את תרכובת התרופות בריכוז הטיפול הרצוי.הערה: לניתוח תאי בקרה, השהה מחדש את התאים ב-4 מ ל של RPMI בינונית ודלג לשלב 6. דגירה את התאים למשך זמן הטיפול ב 37 ° צ’ ו 5% CO2. בתאי ספין למטה ב 400 x g ו 37 ° צ’ עבור 5 דקות…. תאים מושעה מחדש 10 מ ל של PBS, ו צנטריפוגה ב 400 x g ו 37 ° צ’ עבור 5 דקות. אחרי הספינינג, למחוק את הסופרנטאנט. חזור על שלב זה 3 פעמים כדי למזער את זיהוי התרופה מתוך מרכיבים לחילוץ. השהה תאים מחדש ב-4 מ ל של PBS לניתוח. 6. ביצוע מדידות SCMS באמצעות ההתקנה ICMP/יחיד-בדיקה התאם אישית פרמטרים עבור הספקטרומטר ההמוני עבור הניסוי. תחת הכותרת ‘ מצב סריקה ‘ של תוכנת המכשיר, בחר באפשרות ‘ הגדר סריקה’. השתמש ברזולוציה של 60,000 m/∆ m ב- m/z 400, 1 microscan, 100 ms זמן הזריקה המקסימלי, ובקרת רווח אוטומטי (agc) על. טווח מסה (m/z) של 100-1000 היה מנוצל עבור הניסויים. ניתן לשנות פרמטרים בהתבסס על דגם המכשיר. תחת משאבת מזרק, בחר קצב זרימה של 150 nL/min. שיעור זרימה צריך להיות אופטימיזציה עבור כל ניסוי. בחר Nsi מקור ולהחיל מתח של ~ 4.5 kV. פרמטר זה גם צריך להיות מיטבי עבור כל ניסוי. הפעל את המיקרוסקופ ההפוך (עם ההגדלה של 40x שנבחר עבור הצלחת העליונה והעדשה התחתונה) וחבר אותו ליציאת USB של מחשב נייד כדי ללכוד הזנות וידאו חי. הפעל את הצלחת המחוממת והגדר אותה ל-37 ° c. במחשב, עבור אל הכרטיסיה רכוש נתונים ובחר ברציפות תחת השג זמן. הכן דוגמה לניתוח. פיפטה 2-3 mL של מדגם לתוך המכסה של צלחת פטרי קטנה (35 מ”מ x 12 מ”מ). 6.4.2 מקמו את המדגם במרכז האור ממיקרוסקופ הפוך על גבי הלוחית המחוממת. הכן את תא בחירת הזכוכית בדיקה לניתוח. השתמש במערכת מניפולציה התא כדי להזיז את החללית כך הקצה שלה מתמקד תחת המיקרוסקופ הפוך באותו מישור כמו התאים. בחר תא בודד לניתוח. השתמש במערכת הטיפול בתאים כדי להעביר את העצה של הבדיקה הסלולרית לתא המיועד. תהליך זה מפוקח באמצעות המיקרוסקופ הפוך.הערה: אם לא ניתן למקד את קצה הגשוש של בחירת התא באותו מישור כמו התאים, ייתכן שהחלק העקום של הגשוש אינו מתאים בזווית. להתאים את המיקום של החללית בחירת התא עד שני עצות הבדיקה ניתן למקד יחד עם תאים מתחת למיקרוסקופ. בעדינות להפוך את ידית המיקרו מזרק כדי להתאים את המיקום של שמן מינרלי בתוך אבובים. יניקה עדינה מסופק על ידי המיקרומזרק כדי לאבטח את התא המיועד למכשיר בחירת התא.הערה: אם לא ניתן ללכוד את התא על ידי הגשוש בחירת התא דרך כוח היניקה, לבדוק את התא בחירת בדיקה כדי לוודא שהוא מוכנס במלואו לתוך מחזיק נימי. בנוסף, לבחון את רמות השמן המינרלים של המיקרומזרק ואבובים, ולגרש אוויר אם יש. השתמש במערכת הטיפול בתאים כדי להזיז את התא בעצת הבדיקה הסלולרית לקצה הבדיקה הבודדת, תוך שימוש במיקרוסקופ דיגיטלי המתמקד בקצה המכשיר היחיד כדי לנטר תהליך זה. כאשר נוגעים, שיחה קטנה על-ידי בדיקת המידע החד של המכשיר מעוררת מהירות מהירה של התא, ולאחר מכן התא ליפוסט מיועד באופן מיידי עבור ניתוח MS-line.הערה: מכיוון שהתא הנבחר מאובטח לעצת הבדיקה של בחירת התא דרך שאיבה עדינה, ניתן להתנתק מתא זה במהלך העברתו לקצה הבדיקה הבודדת. לכן, אם אותות יונים של שומנים סלולריים אופייני (ראה תוצאות מייצגות להלן) לא נצפו בתוך 5 s, ייתכן שהתא הפך ללא מצורף, והבחירה של תא אחר נדרש.