Geïntegreerde cel manipulatie platform in combinatie met de single-probe voor massaspectrometrie analyse van drugs en metabolieten in enkele schorsing cellen

1. glas cel-selectie probe fabricage Zet single-boring glasbuis in een taps toelopende sonde met een scherpe tip. Plaats een enkele boring glazen buis (ID: 0,3 mm, OD: 1,1. mm) in de klemmen van een verticale pipet houder, het centreren van het glas met betrekking tot de verwarming spoel en draai aan de buis op zijn plaats te beveiligen. De verwarming Coil bestaat uit een 18-gauge nikkel-chroom weerstand draad (~ 60 mm in lengte) opgerold rond een metalen staaf (diameter = 3,90 mm) 2,5 keer. Stel de glazen buis met temperatuur programma 19,5 (fabrikant eenheid). Deze parameter kan voor een bepaald instrument worden gewijzigd. Stel de solenoïde plunjer op 4 (fabrikant Unit). Deze parameter kan voor een bepaald instrument worden gewijzigd. Trigger de solenoïde om de glazen buis te trekken. Deze stap maakt twee sondes gesmolten op de tip. Gebruik een pincet te snijden ~ 1 mm uit de buurt van het puntje van elke sonde, het creëren van een opening van ~ 10 µm in diameter op de sonde tip. Buig de glazen sonde voor eenvoudige koppeling aan de ICMP/single-probe SCMS Setup. Stel een getrokken glazen sonde in de microforge, de positionering van de Tip ~ 3 mm boven de platina verwarming draad. Zet de warmte op de platinadraad tot 30% van de maximale temperatuur. Buig de sonde ~ 45 ° vanaf de oorspronkelijke positie (Figuur 2). 2. geïntegreerde cel manipulatie platform assemblage Plaats de omgekeerde Microscoop, microinjector, en twee Cell manipulatiesystemen op een gemotoriseerde tafel voor eenvoudige koppeling met de massaspectrometer. Wijzig een van de cel manipulatiesystemen om een single-probe tegemoet door het vervangen van het einde met een arm klem. Gebruik een plastic spuit met een naald om de microinjector met minerale olie te vullen. Vermijd bubbels in de buis, omdat dit zal van invloed zijn zuigen. Vervang de plaats van de omgekeerde Microscoop met de verwarmde plaat. Zet de verwarmde plaat op 37 °C voorafgaand aan de analyse. Stel het glas cel-selectie apparaat in. Plaats de glazen cel-selectie sonde in de metalen houder van de microinjector door het plaatsen van de lange (niet-gebogen) kant in de capillaire houder en aanscherping van de schroef om de sonde op zijn plaats te beveiligen. Plaats de hoek van de sondepunt evenwijdig aan de verwarmde plaat.Let op: de glazen sonde is zeer scherp en breekbaar, en het breekt gemakkelijk. Bescherm uw ogen en wees extra voorzichtig tijdens het plaatsen van de sonde in de microinjector. Beveilig de metalen houder van de microinjector in de cel manipulatie systeem. Plaats de sonde tip in de buurt van het midden van de omgekeerde Microscoop licht. 3. Maak een Extended Ion Transfer tube voor de massaspectrometer inlaat Gebruik een metalen mes om een stuk van roestvrijstalen buizen snijden (OD: 0,0625 (1/16) in, ID: 0,021 in) ~ 250 mm in lengte. Maatregel 135 mm van het einde en plaats een metalen wilde zo ~ 135 mm zal worden blootgesteld aan de atmosfeer en ~ 115 mm zal worden in de massaspectrometer. Beveilig de wilde met behulp van twee sleutels aan te scherpen. 4. Koppel de ICMP met een single-probe Setup Beveilig de glazen glijbaan met de single-probe in de arm klem van de cel manipulatie systeem.Nota: de enig-sondes worden vervaardigd volgens een eerder-gepubliceerd protocol48 met twee minder belangrijke veranderingen in de huidige studie: de nano-ESI zender wordt gemaakt langer voor gemakkelijke koppeling aan de massaspectrometer, en de enig-sondes worden gelijmd aan het glas aan de rechterkant om te voorkomen dat de ruimtelijke beweging van het glas-cel-selectie apparaat wordt verstoord (Figuur 2). Sluit het oplosmiddel-het verstrekken van capillaire aan een geleidende Unie door het plaatsen van de capillaire in de mouw (1/16 x .005 in) van de plastic fitting en vinger-aanscherping van de fitting. Sluit de andere kant van de geleidende Unie aan een capillaire (ID: 40 µm, OD: 150 µm), die is aangesloten op een spuit met de bemonstering oplosmiddel, door het plaatsen van de capillaire in de mouw (1/32 x .007 in) en aanscherping van de fitting. Gebruik acetonitril met 0,1% vorm zuur als de bemonstering oplosmiddel in deze experimenten.Nota: het bemonsterings oplosmiddel is flexibel, maar het zou hoofdzakelijk acetonitril (of acetonitril met vormend zuur voor betere ionisatie) voor een snelle Microscale cel lysis moeten bevatten. Beveilig de spuit in de spuitpomp op de massaspectrometer. Plaats het ionisatie spannings koord op een koperdraad die aan de geleidende Unie wordt gehecht. Plaats de nano-ESI emitter ~ 1 mm aan de opening van de Extended Ion Transfer Tube. Gebruik de cel manipulatie systeem om de ruimtelijke bewegingen van de single-probe controle en de positie van de nano-ESI emitter centraal in de voorkant van de Extended Ion Transfer slang. 5. geschorste cel monstervoorbereiding De dag voor de analyse (~ 18-24 h), zaad uit cellen voor het testen in een cel cultuur kolf (T25). K562 menselijke myeloïde leukemie cellen worden gebruikt als modellen in deze studie. Warmte 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium aangevuld met 10% synthetisch foetale boviene serum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C voor 30 min. Zaad ~ 1 x 106 cellen in een totaal volume van 10 ml door het combineren van cellen met warm medium. Gebruik in het algemeen een pipet van 10 mL om 8 mL RPMI medium in een cel kweek kolf te plaatsen. Gebruik vervolgens een pipet van 2 mL om 2 mL Confluent K562 cellen het medium voor ~ 1 x 106 cellen te zetten. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2 tot analyse. Cellen voorbereiden voor analyse. Pipet cellen uit de cel cultuur kolf in een 15-mL centrifugebuis. Spin cellen naar beneden bij 400 x g en 37 ° c voor 5 min en gooi de bovendrijvende. De cellen opnieuw op te schorten in 4 mL RPMI medium dat de geneesmiddelen bevat bij de gewenste behandelings concentratie.Opmerking: voor de analyse van de controlecellen, de cellen opnieuw op te schorten in 4 mL van RPMI medium en ga naar stap 6. Incubeer de cellen voor de duur van de behandelingstijd bij 37 °C en 5% CO2. Spin cellen neer bij 400 x g en 37 °c voor 5 min. aspireren de bovendrijvende. De cellen worden opnieuw opgeschort in 10 mL PBS, en centrifugeren bij 400 x g en 37 °c voor 5 min. Na het spinnen, gooi de bovendrijvende. Herhaal deze stap 3 keer om de opsporing van drugs te minimaliseren van extracellulaire bestanddelen. Hersuspendeer de cellen in 4 mL PBS voor analyse. 6. Voer SCMS metingen uit met behulp van de ICMP/single-probe Setup Parameters voor de massaspectrometer voor het experiment aanpassen. Selecteer in het onderdeel scanmodus van de instrument software de optie Scan definiëren. Gebruik een resolutie van 60.000 m/∆ m bij m/z 400, 1 MICROSCAN, 100 MS maximale injectietijd, en automatische Gain controle (AGC) op. Een massa bereik (m/z) van 100-1000 werd gebruikt voor de experimenten. Parameters kunnen worden aangepast op basis van het instrumentmodel. Selecteer onder spuitpompeen debiet van 150 nl/min. debiet moet worden geoptimaliseerd voor elk experiment. Selecteer NSI bron en breng een spanning van ~ 4,5 kV. Deze parameter moet ook voor elk experiment worden geoptimaliseerd. Zet de omgekeerde Microscoop (met 40x vergroting geselecteerd voor zowel de bovenste plaat en onderkant lens) en sluit deze aan op de USB-poort van een laptop om live-video-feeds vast te leggen. Zet de verwarmde plaat aan en zet deze op 37 °C. Ga op de computer naar het tabblad gegevens ophalen en selecteer continu onder tijd ophalen . Bereid steekproef voor analyse. Pipetteer 2-3 mL monster in het deksel van een klein Petri schaaltje (35 mm x 12 mm). 6.4.2 positie van de steekproef in het midden van het licht van de omgekeerde Microscoop op de top van de verwarmde plaat. Bereid de glas cel-selectie sonde voor analyse. Gebruik de cel manipulatie systeem om de sonde te verplaatsen, zodat de tip is gericht onder de omgekeerde Microscoop in hetzelfde vlak als de cellen. Selecteer een afzonderlijke cel voor analyse. Gebruik de cel manipulatie systeem om de cel-selectie sonde Tip verplaatsen naar een gerichte cel. Dit proces wordt gecontroleerd met behulp van de omgekeerde Microscoop.Opmerking: als de punt van de cel-selectie sonde niet kan worden gericht in hetzelfde vlak als de cellen, is het mogelijk dat de gebogen deel van de sonde niet geschikt is schuin. Pas de positie van de cel-selectie sonde totdat beide sonde tips kunnen worden gericht, samen met de cellen onder de Microscoop. Draai voorzichtig de hendel van de microinjector om de positie van de minerale olie in de slang aan te passen. Een zachte zuiging wordt verstrekt door de microinjector om de gerichte cel aan de cel-selectie sonde uiteinde te beveiligen.Opmerking: als de cel niet kan worden gevangen door de cel-selectie sonde door de zuigkracht, controleer dan de cel-selectie sonde om ervoor te zorgen dat het volledig is opgenomen in de capillaire houder. Bovendien, Inspecteer de minerale olieniveaus in de microinjector en buizen, en verdrijven lucht als er sprake is. Gebruik de Cell manipulatie systeem om de cel te verplaatsen op de cel-selectie sonde tip om de single-probe tip, met behulp van een digitale microscoop gericht op de single-probe tip om dit proces te controleren. Bij het aanraken, een kleine acetonitril druppel op de single-probe Tip induceert een snelle lyses van de cel, en vervolgens cel lysate wordt onmiddellijk geioniseerd voor on-line MS analyse.Opmerking: omdat de geselecteerde cel is beveiligd naar de cel-selectie sonde Tip door middel van een zachte zuigkracht, kan deze cel mogelijk los tijdens de overdracht aan de single-probe tip. Daarom, als Ion signalen van typische cellulaire lipiden (Zie representatieve resultaten hieronder) niet worden waargenomen binnen 5 s, is het mogelijk dat de cel werd onbevestigd, en de selectie van een andere cel nodig is.