JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

منصة معالجة الخلية المتكاملة مقرونة بمسبار واحد لتحليل قياس الطيف الكتلي للأدوية والأيض في خلايا تعليق واحدة

Published: June 21, 2019
doi:
10.3791/59875
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Oklahoma

Summary

تم تطوير منصة معالجة خلية متكاملة للاستخدام بالاقتران مع إعداد قياس الطيف الكتلي أحادي التحقيق لتحليل خلايا التعليق الفردية على الخط في الظروف المحيطة.

Abstract

يتيح قياس الطيف الكتلي أحادي الخلية (SCMS) الكشف الدقيق والتحليل الدقيق لنطاقات واسعة من الأنواع الخلوية على مستوى الخلايا الفردية. ويمكن أن يقترن المسبار الأحادي، وهو جهاز لأخذ العينات والتأين على نطاق مصغر، بمطياف كتلة لتحليل SCMS السريع على الخط للمكونات الخلوية في ظل الظروف المحيطة. في السابق، كانت تقنية SCMS ذات المسبار الواحد تستخدم في المقام الأول لقياس الخلايا المتوقفة على الركيزة، مما يحد من أنواع الخلايا للدراسات. في الدراسة الحالية، تم دمج تكنولوجيا SCMS ذات التحقيق الواحد مع نظام معالجة الخلايا، الذي يستخدم عادة للإخصاب في المختبر. تستخدم هذه المنصة المتكاملة للتلاعب والتحليل الخلية مسبار اختيار الخلية لالتقاط الخلايا العائمة الفردية المحددة ونقل الخلايا إلى طرف مسبار واحد للتحليل الجزئي، يليه تحليل الطيف الكتلي الفوري. عملية الالتقاط والتحويل هذه تزيل الخلايا من الحل المحيط قبل التحليل، مما يقلل من إدخال جزيئات المصفوفة في تحليل قياس الطيف الكتلي. هذا الإعداد المتكامل قادر على تحليل SCMS للخلايا المعزولة المرضى المستهدفة الموجودة في عينات سوائل الجسم (مثل البول والدم واللعاب، وما إلى ذلك)، مما يسمح بالتطبيقات المحتملة لتحليل SCMS للطب البشري وبيولوجيا الأمراض.

Introduction

علم الأحياء البشري، وخاصة بيولوجيا الأمراض، يُفهم بشكل متزايد على أنه نتيجة لأنشطة على مستوى الخلايا الفردية، ولكن الأساليب التحليلية التقليدية، مثل مطياف الكتلة الكروماتوغرافيا السائلة (LCMS)، تستخدم عموما لتحليل العينات التي تم إعدادها من مجموعات الخلايا، في حين أن المعلومات الجزيئية المكتسبة لا يمكن أن تمثل بدقة العمليات الكيميائية على مستوى الخلايا الفردية. هذه الأساليب القياسية التقليدية غير قادرة على تمييز آثار عدم تجانس الخلوية على قياس تحليلي، وعملية تدمير وخلط الخلايا لإعداد الليسات يحتمل أن يؤدي إلى تغيير أو فقدان الخلوية المكونات1،2. هذه القيود من الأساليب التقليدية هي مهمة بشكل خاص في تحليل خلايا المريض، والتي يمكن أن تحتوي على عينات تم الحصول عليها خليط معقد من العديد من أنواع الخلايا المختلفة. للتغلب على أوجه القصور هذه، يجري تطوير أساليب التحليل الجزيئي لخلايا واحدة، بما في ذلك أساليب قياس الطيف الكتلي أحادي الخلية (SCMS)، وتطبيقها بشكل متزايد على التحليل البيولوجي، وخاصة من الأيض الخلوي والوزن الجزيئي المنخفض الجزيئات الحيوية3،4.

وقد طورت تقنيات SCMS الأولى تقنيات مبنية على الفراغ لإجراء التحليلات في ظل ظروف غير محيطة2و5و6و7و8و9 10,11. تقنيات SCMS غير المحيطة قادرة على تحليل الدهون الخلوية والأيض، ولكن تتطلب قبل المعالجة عينة في ظل ظروف اصطناعية، وبالتالي ليست مناسبة للتحليل في الوقت الحقيقي. وتشمل عملية إعداد العينات للتحليل غير المحيط إضافة مكونات المصفوفة، ويمكن لهذا الإعداد أن يغير المكونات الخلوية من بيئتها الطبيعية12. ولذلك، فإن تقنيات قياس الطيف الكتلي المحيط (MS)، التي لا تتطلب فراغاً لبيئة أخذ العينات، تستخدم لتحليل الخلايا في بيئة قريبة من الأصل. عدم وجود بيئة فراغ يسمح لبراعة في التصميم التجريبي؛ يمكن إضافة الكاميرات لمراقبة العملية الخلوية ويمكن الجمع بين تقنيات تأين ليونة مع تقنيات الفصل للحصول على معلومات أفضل من كل تجربة خلية واحدة4،12،13 14 ،15،16،17،18،19،20،21،22 ،24 24 ،24،26،27،27،29،30،31 32 ،33،34،35،36،37،38،39،40 41,42.

طريقة SCMS ذات التحقيق الواحد هي تقنية محيطة تحلل خطوط خلايا سرطان الثدييات الحية في بيئة قريبة من السكان الأصليين21،43،44،45،46. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام جهاز مسبار واحد لتطبيقات القياس الطيفي الكتلي الأخرى، بما في ذلك تحليل الجزيئات خارج الخلية في كرويات متعددة الخلايا والتصوير MS من الأنسجة47،48،49 ،50،51،52. ومع ذلك، بما أن تجميد الخلية على ركائز مطلوب لهذا الأسلوب، لا يمكن تحليل خلايا التعليق مباشرة باستخدام هذه التقنية3،53. ولذلك، فإن نظام SCMS أحادي التحقيق لا يمكن استخدامها مباشرة لأخذ عينات من الخلايا الفردية غير الملتصقة، مثل خطوط الخلايا غير الملتصقة أو خلايا التعليق المعزولة عن دم المريض أو سوائل الجسم الأخرى54. في هذا العمل، يتم إرفاق منصة معالجة الخلية المتكاملة (ICMP) مع تقنية SCMS أحادية التحقيقلتحليل حية، تعليق الخلايا على الخط مع الحد الأدنى من إعداد عينة (الشكل 1)46. تتكون اللجنة الدولية لشؤون المفقودين من مجهر مقلوب لمراقبة اختيار الخلايا، ومسبار اختيار خلية زجاجية، وحاقن صغير لالتقاط الخلايا العائمة الفردية، ولوحة ساخنة للحفاظ على درجة الحرارة الخلوية، ونظامين للتلاعب بالخلايا للسيطرة على المكاني حركات كل من ال [سل-كّينكأيشن] زجاجيّة تحقيق و [سنغل-سّر], ومجهر رقميّة أن يلاحظ خلية إنتقال من الخلية -إنتقاء تحقيق طرف إلى ال [سنغل-سفير] طرف. يتم تفصيل تصنيع التحقيق واحد في المنشورات السابقة ولن يتم تناولها هنا21،48. ويقترن نظام ICMP/واحد-التحقيق إلى مطياف كتلة عالية الدقة. يسمح هذا الإعداد المتكامل بأخذ عينات من خلايا مفردة محددة من عينات بيولوجية معقدة مع الحد الأدنى من الآثار من جزيئات المصفوفة.

Protocol

1. الزجاج خلية اختيار التحقيق تلفيق تحويل أنابيب الزجاج واحد تتحمل إلى مسبار مدبب مع طرف حاد. وضع أنبوب زجاجي واحد تتحمل (ID: 0.3 مم، OD: 1.1. مم) في المشابك من حامل ماصة عمودي، توسيط الزجاج فيما يتعلق لفائف التدفئة وتشديد لتأمين الأنبوب في المكان. وتتألف لفائف التدفئة من 18 قياس النيكل والكروم سلك المقاومة (~ 60 ملم في الطول) ملفوفحول قضيب معدني (قطر = 3.90 مم) 2.5 مرات. تعيين أنابيب الزجاج مع برنامج درجة الحرارة 19.5 (وحدة الشركة المصنعة). يمكن تعديل هذه المعلمة لأداة معينة. تعيين المكبس الملف اللولبي في 4 (وحدة الصانع). يمكن تعديل هذه المعلمة لأداة معينة. الزناد الملف اللولبي لسحب الأنابيب الزجاجية. هذه الخطوة يخلق اثنين من التحقيقات تنصهر في غيض. استخدام ملاقط لقطع ~ 1 ملم بعيدا عن غيض من كل مسبار، وخلق فتحة من 10 ~m في القطر في طرف التحقيق. ثني التحقيق الزجاج لسهولة اقتران إلى ICMP / واحد التحقيق SCMS الإعداد. تعيين التحقيق الزجاج سحبها في microforge، ووضع غيض ~3 مم فوق سلك التدفئة البلاتين. قم بقلب الحرارة على السلك البلاتيني إلى 30% من درجة الحرارة القصوى. ثني المسبار ~ 45 درجة من الموقف الأصلي (الشكل 2). 2. منصة معالجة الخلية المتكاملة الجمعية وضع المجهر المقلوب، microinjector، ونظامين التلاعب الخلية على طاولة بمحركات لسهولة اقتران مع مطياف الكتلة. تعديل واحد من أنظمة التلاعب الخلية لاستيعاب واحد التحقيق عن طريق استبدال نهاية مع المشبك الذراع. استخدام حقنة بلاستيكية مع إبرة لملء ميكروحاقن مع الزيوت المعدنية. تجنب فقاعات في الأنابيب لأن هذا سيؤثر على شفط. استبدل مرحلة إدراج المجهر مقلوب مع لوحة ساخنة. ضبط لوحة ساخنة في 37 درجة مئوية قبل التحليل. إعداد جهاز اختيار الخلية الزجاجي. أدخل الرقاقة الزجاجية في الموضع داخل حامل المعدن في الحاقن الدقيق بوضع الجانب الطويل (غير العازم) في حامل الشعرية وتشديد المسمار لتأمين المسبار في مكانه. ضع زاوية طرف المسبار موازية لللوحة المدفأة.تحذير: المسبار الزجاجي حاد جدا وهش، ويكسر بسهولة. حماية عينيك وتوخي الحذر أكثر أثناء إدخال التحقيق في حاقن ميكرو. تأمين حامل المعادن من ميكروحاقن في نظام التلاعب الخلية. ضع طرف المسبار بالقرب من منتصف ضوء المجهر المقلوب. 3. إنشاء أنبوب نقل ايون الموسعة لمقدم مطياف الكتلة استخدام قطع المعادن لقطع قطعة من أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ (OD: 0.0625 (1/16) في، ID: 0.021 في) ~ 250 ملم في الطول. قياس 135 ملم من النهاية ووضع المعادن الوحشية حتى 135 سوف يتعرض للغلاف الجوي و 115 ملم سوف يكون داخل مطياف الكتلة. تأمين متوحش باستخدام اثنين من الشدات لتشديد عليه. 4. الزوجين ICMP مع إعداد مسبار واحد تأمين الشريحة الزجاجية التي تحتوي على مسبار واحد في المشبك الذراع من نظام التلاعب الخلية.ملاحظة: يتم تصنيع تحقيقات واحدة وفقا لبروتوكول نشر سابقا48 مع اثنين من التغييرات الطفيفة في الدراسة الحالية: يتم إجراء باعث نانو-ESI لفترة أطول لسهولة اقتران إلى مطياف الكتلة، ويتم لصقها على واحد تحقيقات إلى الزجاج الجانب على الجانب الأيمن لتجنب التدخل في الحركة المكانية لجهاز الزجاجالخلية اختيار (الشكل 2). توصيل الشعرية توفير المذيبات إلى اتحاد موصل عن طريق وضع الشعرية في الأكمام (1/16 × 005 في) من الطويق البلاستيك والاصبع تشديد المناسب. ربط الجانب الآخر من الاتحاد موصل إلى الشعرية (ID: 40 ميكرون، OD: 150 ميكرومتر)، الذي يتصل حقنة تحتوي على مذيب أخذ العينات، عن طريق وضع الشعرية في الأكمام (1/32 س .007 في) وتشديد تركيب. استخدام أسيتونيتريل مع 0.1٪ حمض الفورميك كما أخذ العينات المذيبات في هذه التجارب.ملاحظة: المذيب أخذ العينات مرنة، ولكن ينبغي أن تحتوي في المقام الأول على أسيتونيتريل (أو الأسيتونيتريل مع حمض الفورميك للتأين أفضل) لlysis خلية صغيرة النطاق السريع. تأمين حقنة في مضخة حقنة على مطياف الكتلة. وضع الحبل الجهد التأين على سلك النحاس تعلق على الاتحاد موصل. ضع مصدر الانبعاث نانو-ESI حوالي 1 ملم إلى فتحة أنبوب نقل الأيون الممتد. استخدام نظام التلاعب الخلية للسيطرة على الحركات المكانية للمسبار واحد ووضع انبعاث نانو-ESI مركزيا أمام أنابيب نقل ايون الموسعة. 5. مع وقف التنفيذ إعداد عينة الخلية في اليوم السابق للتحليل (~ 18-24 ح)، والبذور من الخلايا للاختبار في قارورة زرع الخلية (T25). يتم استخدام خلايا سرطان الدم النخاعي البشري K562 كنماذج في هذه الدراسة. الحرارة 1X الفوسفات العازلة المالحة (PBS) وروزويل بارك معهد التذكارية (RPMI) المتوسطة تكملها 10% مصل جنيني اصطناعي البقري (FBS) و 1% البنسلين-العقدي في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. البذور ~ 1 × 106 خلايا في حجم إجمالي 10 مل عن طريق الجمع بين الخلايا مع متوسط دافئ. بشكل عام، استخدم ماصة سعة 10 مل لوضع 8 مل من متوسط RPMI في قارورة ثقافة الخلية. ثم استخدم ماصة 2 مل لوضع 2 مل من خلايا K562 confluent المتوسطة ل ~ 1 X 106 الخلايا. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى التحليل. إعداد الخلايا للتحليل. خلايا الماصة من قارورة زرع الخلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تُثري الخلايا إلى أسفل عند 400 x غ و37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتُترك فوق الناستانت. إعادة تعليق الخلايا في 4 مل من متوسط RPMI تحتوي على مركب الدواء في تركيز العلاج المطلوب.ملاحظة: لتحليل خلايا التحكم، قم بتعليق الخلايا في 4 مل من متوسط RPMI وتخطي إلى الخطوة 6. احتضان الخلايا لمدة وقت العلاج في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تُدْسِبُ الخلايا ُإلى 400 x غ و37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يتم إعادة تعليق الخلايا في 10 مل من PBS، والطرد المركزي في 400 x ز و 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد الغزل، وتجاهل supernatant. كرر هذه الخطوة 3 مرات لتقليل الكشف عن المخدرات من المكونات خارج الخلية. إعادة تعليق الخلايا في 4 مل من PBS لتحليلها. 6. إجراء قياسات SCMS باستخدام إعداد ICMP/واحد التحقيق تخصيص معلمات لمطياف الكتلة للتجربة. ضمن عنوان وضع المسح الضوئي لبرنامج الأداة، حدد تعريف المسح الضوئي. استخدام قرار 60,000 م / م في م / z 400, 1 ميكروسكان, 100 مللي ثانية الحد الأقصى للحقن الوقت, والتحكم التلقائي في السيطرة على (AGC) على. وقد استخدم نطاق كتلة (م/ ض) من 100-1000 للتجارب. يمكن تعديل المعلمات بناء على نموذج الصك. تحت مضخة حقنة، حدد معدل تدفق 150 nL/min. معدل تدفق يحتاج إلى تحسين لكل تجربة. حدد مصدر NSI وتطبيق الجهد من ~ 4.5 كيلو فولت. تحتاج هذه المعلمة أيضا ً إلى تحسين لكل تجربة. قم بتشغيل المجهر المقلوب (مع تكبير 40مرة تم تحديده لكل من اللوحة العلوية والعدسة السفلية) وقم بتوصيله بمنفذ USB لجهاز كمبيوتر محمول لالتقاط موجزات فيديو حية. قم بتشغيل اللوحة المُسخنة واضبطها على درجة حرارة 37 درجة مئوية. على جهاز الكمبيوتر، انتقل إلى علامة التبويب الحصول على بيانات، وحدد باستمرار ضمن الحصول على الوقت. إعداد عينة للتحليل. ماصة 2-3 مل من عينة في غطاء طبق بيتري صغير (35 مم × 12 مم). 6.4.2 ضع العينة في وسط الضوء من المجهر المقلوب على رأس لوحة ساخنة. إعداد التحقيق الزجاج الخلية اختيار للتحليل. استخدام نظام التلاعب الخلية لتحريك التحقيق حتى يتم تركيز طرفه تحت المجهر المقلوب في نفس الطائرة مثل الخلايا. حدد خلية فردية للتحليل. استخدم نظام معالجة الخلية لنقل تلميح مسبار تحديد الخلية إلى خلية مستهدفة. يتم رصد هذه العملية باستخدام المجهر المقلوب.ملاحظة: إذا كان لا يمكن تركيز طرف مسبار اختيار الخلية في نفس المستوى مثل الخلايا، فمن الممكن أن الجزء عازمة من التحقيق غير زاوية بشكل مناسب. ضبط موقف من التحقيق الخلية اختيار حتى يمكن أن تركز كل من نصائح التحقيق جنبا إلى جنب مع الخلايا تحت المجهر. قم بقلب مقبض الحاقن الدقيق لضبط موضع الزيت المعدني داخل الأنابيب. يتم توفير شفط لطيف من قبل حاقن ميكرو لتأمين الخلية المستهدفة إلى طرف التحقيق اختيار الخلية.ملاحظة: إذا تعذر التقاط الخلية بواسطة مسبار اختيار الخلية من خلال قوة الشفط، فتحقق من مسبار اختيار الخلية للتأكد من أنه يتم إدخاله بالكامل في حامل الشعرية. وبالإضافة إلى ذلك، تفقد مستويات الزيت المعدني في ميكروحاقن والأنابيب، وطرد الهواء إذا كان هناك أي. استخدم نظام معالجة الخلية لنقل الخلية في طرف مسبار اختيار الخلية إلى طرف مسبار واحد، وذلك باستخدام مجهر رقمي يركز على طرف مسبار واحد لمراقبة هذه العملية. عند لمس، قطرة صغيرة الأسيتونيتريل في طرف مسبار واحد يحفز على lyses السريع من الخلية، ومن ثم يتم تأين خلية على الفور لتحليل MS على الخط.ملاحظة: لأن الخلية المحددة مؤمنة إلى تلميح مسبار اختيار الخلية من خلال شفط لطيف، يمكن فصل هذه الخلية أثناء نقلها إلى طرف مسبار واحد. لذلك، إذا لم يتم ملاحظة إشارات الأيون من الدهون الخلوية النموذجية (انظر النتائج التمثيلية أدناه) في غضون 5 ق، فمن الممكن أن الخلية أصبحت غير مرتبطة، وهناك حاجة إلى اختيار خلية مختلفة.

Representative Results

أولاً، يتم استخدام الخلايا K562 غير المعالجة لإنشاء الطريقة التجريبية. في تجربة SCMS نموذجية، يمكن ملاحظة تغييرات واضحة من أطياف الكتلة من نقل خلية، أثناء الكشف عن محتويات الخلوية، وبعد الانتهاء من القياس (الشكلS1). ثلاث قمم الدهون الخلوية المشتركة (فوسفاتيديلكولين، PC)، بما في ذلك PC (34: 4) (م/ z 754.536)، PC (36: 4) (م/ z 782.567)، وPC (38: 5) (م/ z 808.583)، ومراقبة لضمان نقل الخلية بنجاح والخلوية يتم الكشف عن محتويات (الشكل S2)21،43،46،55،56. إذا لم يتم رؤية قمم الدهون في غضون 5 ق، يتم تغيير مستوى الزيت المعدني في ميكروحاقن للحد من شفط عقد الخلية في تلميح التحقيق اختيار الخلية. الحذر يحتاج إلى أن تؤخذ بحيث يتم دفع أي النفط المعدني من التحقيق الخلية اختيار. يتم تأكيد هوية العديد من أجهزة الكمبيوتر في النطاق الشامل من م / z 750-850 باستخدام MS / MS على عينات الخلايا غير المعالجة ( الشكل3، الشكل S2، الجدول 1)46. كما تتعرض الخلايا K562 للعلاج مع مركبات المخدرات المختلفة لتوسيع براعة الأسلوب. يتم احتضان خلايا K562 بالأحجار الكريمة (1 ميكرومتر) وتاكسول (1 ميكرومتر) لمدة 1 ساعة وOSW-1 (100 طن، 1 ميكرومتر) لمدة 4 ح و2 ح، على التوالي. ثم يتم غسل الخلايا مع PBS للحد من الكشف عن مركبات المخدرات من المحتوى خارج الخلية. ويمكن القضاء على مساهمة المصفوفة (مثل الأيونات من وسط ثقافة الخلية، وPBS، والمذيبات) إلى أطياف الكتلة من المحتويات الخلوية من خلال طرح البيانات، وذلك بسبب إشارات أيون مختلفة بشكل كبير (الشكلS3). يتم الكشف عن جميع مركبات المخدرات الثلاثة باستخدام ICMP / واحد التحقيق MS الإعداد (الشكلS4)46. وتشير هذه النتائج إلى أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لدراسة الدهون داخل الخلايا, المخدرات, والأيض على مستوى خلية واحدة من الخلايا في الحل في بيئة شبه أصلية. الشكل 1 الإعداد التجريبي لتجارب MS خلية تعليق واحد. (أ) منصة معالجة الخلية المتكاملة (ICMP) مقترنة بمطياف الكتلة. (B) مخطط لتحليل الخلايا العالقة. (C) عرض تجريبي لخلايا K562 يتم اختيارها باستخدام مسبار اختيار الخلية. أعيد طبعها بإذن من Standke وآخرون46. حقوق الطبع والنشر 2019 الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2 صور من معدلة مسبار واحد ومسبار اختيار الخلية المستخدمة لتجارب MS خلية تعليق واحد. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3 تكبير في الطيف الشامل من خلية واحدة تظهر الأنواع التمثيلية (م / z 750-850). يتم تأكيد الهياكل الكيميائية باستخدام تحليل MS /MS (الشكلS1). أعيد طبعها بإذن من Standke et al46. حقوق الطبع والنشر 2019 الجمعية الكيميائية الأمريكية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. جزيء المخدرات* م/ض خطأ كتلة (ppm) [جيمسيتابين + ح] + 264.076 11.32 [تاكسول + نا] + 876.318 2.74 [OSW-1 + Na] + 895.445 0.89 الدهون الخلوية [PC (34: 4) + H] + 754.535 3.71 [PC (34: 3) + ح] + 756.551 3.44 [PC (34: 2) + H] + 758.569 0.66 [PC (36: 5) + H] + 780.551 3.07 [PC (36: 4) + H] + 782.568 2.17 [PC (36: 3) + H] + 784.585 0.64 [PC (38: 7) + H] + 804.551 4.1 [PC (38: 6) + H] + 806.567 2.48 [PC (38: 5) + H] + 808.583 2.72 [PC (38: 4) + H] + 810.601 صفر [PC (40: 7) + H] + 832.583 3.12 الجدول 1 مكونات خلوية تم تحديدها باستخدام إعداد ICMP/Single-probe. وقد تأكد الكشف عن جميع مركبات المخدرات عن طريق مقارنة نتائج التصلب المتعدد/التصلب المتعدد مع المركب القياسي.

Discussion

تم بناء منصة معالجة وتحليل الخلايا المتكاملة لتوسيع براعة طريقة MS ذات المسبار الواحد، مما يسمح بإجراء تحليل سريع على الإنترنت للخلايا غير المنضمة في بيئة شبه أصلية. ميزة رئيسية لهذه التقنية هو أن الحد الأدنى من إعداد عينة مطلوب، لذلك يتم تحليل الخلايا في الظروف التي تحاكي حالتها القياسية. وعلى وجه الخصوص، يمكن تحديد الخلايا ذات الأهمية الفردية واختيارها بصرياً، مما يقلل إلى أدنى حد من تأثير المصفوفة على كفاءة تأين التصلب المتعدد مع الحفاظ على الخلايا في بيئتها الطبيعية، وبالتالي فإن النتائج هي أكثر تمثيلاً للخلايا الأصلية. الحالة (الشكل S3). ويمكن استخدام هذه التقنية المحتملة لدراسة خلايا المرضى المعلقة في السوائل الحيوية في الدراسات المستقبلية. ميزة أخرى من هذه التقنية هو اختيار مرنة من مذيب أخذ العينات. من المهم أن تشمل أسيتونتريل كما مذيب أخذ العينات الرئيسي بحيث يمكن أن يحدث التثليث الميكروي بسرعة. من المحتمل أن تضاف المعايير الداخلية (مثل مركبات الأدوية ذات العلامات المؤينة بـ isotopically) إلى مذيب أخذ العينات من أجل تقدير كمية الجزيئات ذات الأهمية (مثل جزيئات الدواء) من الخلايا الفردية، بما في ذلك تلك التي يمكن أن تلعب دوراً رئيسياً في إحداث ثورة تخصيص العلاجات الدوائية في المستقبل54.

على الرغم من أن هذا النظام المتكامل يمكن استخدامها بشكل ملائم لتحليل نطاقات واسعة من الخلايا، وحد من الأسلوب هو أن لا التحقيق واحد ولا خلية الاختيار التحقيق هو متاح تجاريا. يملي الحاجة إلى تحسين العديد من المعلمات (مثل معدل التدفق، والجهد، والطول بين أنبوب انبعاث نانو-ESI وأنابيب نقل الأيون، إلخ) قبل كل تجربة. [إين دّيأيشن], واجبة إلى الحجم صغيرة من ال [سنغل-سفينس] و [سلّ-نكأيشن] تحقيق, اضطراب بيئيّة ([إ.غ.], هواء دفق) يمكن نتجت في صعوبات يؤسّس ملتقى بين الاثنان تحقيقات. حل قصير الأجل هو الانحناء من التحقيق اختيار الخلية على مقربة من نهاية لتقليل طول مستدق. وتشمل الأعمال المقبلة إنشاء مسكن لتضمين الأجزاء الحاسمة من الإعداد للحد من الآثار البيئية. نظراً لكمية محدودة من المحتويات الخلوية ووقت الاقتناء القصير (~2-3 s) من خلية، لا يمكن إجراء تحليل MS/MS إلا للأنواع الوفيرة نسبياً. وتشمل العوامل الأخرى التي تؤثر على حساسية الكشف كفاءة التأين المكبوتة بسبب إدخال مصفوفة جنبا إلى جنب مع الخلية وفقدان الأيون المحتملة من خلال أنابيب نقل الأيون الموسعة.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويشكر المؤلفان ناغا راما كوتابالي على عملها في إعداد العينات لكل من خلايا التعليق وتجارب lysate الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يشكر المؤلفون المعاهد القومية للصحة (R01GM116116 وR21CA204706) على التمويل.

Materials

Acetontrile Millipore Co. AX0145-1 Sampling solvent
CellTram Vario Eppendorf 6221 ICMP
Copper wire stores.ebay.com/jewelerheaven Dead soft, round, 20 guage, 25 ft Conductive union setup
Digital stereomicroscope Shenzhen D&F Co. Supereyes T004 Analysis
Disposable micropipette, 1-5 µL Rochester Scientific 5065 Cell-selection probe fabrication
Dual bore quartz tubing, 1.120"x0.005"x12" Friedrich & Dimmock, Inc. MBT-005-020-2Q Single-probe fabrication
Epoxy resin Devcon Part No. 20945 Single-probe fabrication
Eppendorf cell manipulation system Eppendorf Transferman NK517800397-U.R. ICMP
External nut VALCO*CHEMINERT EN1 Ion transfer tube fabrication
Formic acid Sigma-Aldrich 399388-500ML Sampling solvent
Fused silica capillary, ID: 40 µm, OD: 100 µm Polymicro Technologies TSP040105 Single-probe fabrication, conductive union setup
Fused silica capillary, ID: 50 µm, OD: 150 µm Polymicro Technologies 1068150015 Conductive union setup
HyClone Synthetic fetal bovine serum (FBS) Fischer Sci SH3006603 Cell culture
Inline MicroFilter IDEX Health & Science LLC M-520 Conductive union setup
Laser puller Sutter Instrument Co. Model P-2000 Single-probe fabrication
LED UV lamp Foshan Liang Ya Dental Equipment LY-C240 Single-probe fabrication
LTQ Orbitrap mass spectrometer Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL Analysis
Microforge Narishige, Co. MF-9 Cell-selection probe fabrication
Microunion IDEX Health & Science LLC M-539 Conductive union
PEEK tubing, 1/32×0.005x 5ft IDEX Health & Science LLC 1576 Conductive union setup
PEEK tubing, 1/32×0.007x 5ft IDEX Health & Science LLC 1577 Conductive union setup
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies 15140-122 Cell culture
Petri dish, 35×10 mm VWR 25382-334 Sample preparation
Phosphate Buffered Saline (PBS) VWR 0780-50L Cell culture
Platinum wire Narishige, Co. Model PT-A Microforge
Power supply Nikon PSM-2120 ICMP
RPMI, 1X with Corning glutagro Corning 10-104-CV Cell culture
Single-bore tubes Boralex 5065 Cell-selection probe fabrication
Stainless steel ferrules, for 1/16" OD IDEX Health & Science LLC VHP-200-01x Ion transfer tube fabrication
Stainless steel tubing, 1/32x 205 µm x30 cm IDEX Health & Science LLC U-1128 Ion transfer tube fabrication
Syringe, 250 µL Hamilton 1725LTN250UL Sampling syringe
T25 flask CellStar 690160 Cell culture
Thermo LTQ XL ion source interface flange New Objective PB5500 Analysis
ThermoPlate TokaiHit 55R30N ICMP
TrypLE Express Gibco 12605-010 Cell culture
Tube cutter, for 1/16" stainless steel SUPELCO 58692-U Ion transfer tube fabrication
USB digital photography microscope dx.com SO2 25~500X Analysis
UV curing resin Prime Dental Item No. 006.030 Single-probe fabrication
Vertical pipette puller David Kopf Instruments Model 720 Cell-selection probe fabrication
Voltage housing PicoChip PCH-A00120 ICMP/MS interface
Wire cutter Craftsman 4 1/2 in end nipper Conductive union setup
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mao, S., et al. In Scatheless Cell Detachment Reveals Correlation between Adhesion Strength and Viability at Single-Cell Resolution. Angewandte Chemie International Edition. 57 (1), 236-240 (2017).
  2. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nature Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
  3. Linwen, Z., Akos, V. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2017).
  4. Chen, X., et al. Single-cell analysis at the threshold. Nature Biotechnology. 34, 1111 (2016).
  5. Fu, Q., Tang, J., Cui, M., Xing, J., Liu, Z., Liu, S. Application of porous metal enrichment probe sampling to single cell analysis using matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Journal of Mass Spectrometry. 51, (2016).
  6. Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. Single-Cell Lipidomics: Characterizing and Imaging Lipids on the Surface of Individual Aplysia californica Neurons with Cluster Secondary Ion Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (4), 2231-2238 (2013).
  7. Passarelli, M. K., et al. Single-Cell Analysis: Visualizing Pharmaceutical and Metabolite Uptake in Cells with Label-Free 3D Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 87 (13), 6696-6702 (2015).
  8. Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. Secondary Ion MS Imaging To Relatively Quantify Cholesterol in the Membranes of Individual Cells from Differentially Treated Populations. Analytical Chemistry. 79 (10), 3554-3560 (2007).
  9. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  10. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. Journal of Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  11. Ong, T. -. H., Tillmaand, E. G., Makurath, M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry-based characterization of endogenous peptides and metabolites in small volume samples. Biochimica et biophysica acta. 1854 (7), 732-740 (2015).
  12. Yang, Y., Huang, Y., Wu, J., Liu, N., Deng, J., Luan, T. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 90, 14-26 (2017).
  13. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a Chip. 7 (4), 423-440 (2007).
  14. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. 43 (12), 1692-1700 (2008).
  15. Fujii, T., et al. Direct metabolomics for plant cells by live single-cell mass spectrometry. Nature Protocols. 10, 1445 (2015).
  16. Esaki, T., Masujima, T. Fluorescence Probing Live Single-cell Mass Spectrometry for Direct Analysis of Organelle Metabolism. Analytical Sciences. 31 (12), 1211-1213 (2015).
  17. Tsuyama, N., Mizuno, H., Tokunaga, E., Masujima, T. Live Single-Cell Molecular Analysis by Video-Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 24 (5), 559-561 (2008).
  18. Mizuno, N., Harada, T., Masujima, T., T, H. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. Journal of Mass Spectrometry. , (2008).
  19. Phelps, M., Hamilton, J., Verbeck, G. F. Nanomanipulation-coupled nanospray mass spectrometry as an approach for single cell analysis. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 124101 (2014).
  20. Phelps, M. S., Verbeck, G. F. A lipidomics demonstration of the importance of single cell analysis. Analytical Methods. 7 (9), 3668-3670 (2015).
  21. Pan, N., Rao, W., Kothapalli, N. R., Liu, R., Burgett, A. W. G., Yang, Z. The Single-Probe: A Miniaturized Multifunctional Device for Single Cell Mass Spectrometry Analysis. Analytical Chemistry. 86 (19), 9376-9380 (2014).
  22. Gong, X., et al. Single Cell Analysis with Probe ESI-Mass Spectrometry: Detection of Metabolites at Cellular and Subcellular Levels. Analytical Chemistry. 86 (8), 3809-3816 (2014).
  23. Lorenzo Tejedor, M., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. In Situ Molecular Analysis of Plant Tissues by Live Single-Cell Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (12), 5221-5228 (2012).
  24. Shimizu, T., et al. Live Single-Cell Plant Hormone Analysis by Video-Mass Spectrometry. Plant and Cell Physiology. 56 (7), 1287-1296 (2015).
  25. Yamamoto, K., et al. Cell-specific localization of alkaloids in Catharanthus roseus stem tissue measured with Imaging MS and Single-cell MS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (14), 3891 (2016).
  26. Date, S., Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Direct Drug Metabolism Monitoring in a Live Single Hepatic Cell by Video Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 28 (3), 201 (2012).
  27. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences. 31 (12), 1215-1217 (2015).
  28. Masuda, K., Abouleila, Y., Ali, A., Yanagida, T., Masujima, T. Live Single-Cell Mass Spectrometry (LSC-MS) for Plant Metabolomics. BT – Plant Metabolomics: Methods and Protocols. , 269-282 (2018).
  29. Ferreira, C. R., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Single oocyte and single embryo lipid analysis by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 29-33 (2012).
  30. Ferreira, C. R., Pirro, V., Eberlin, L. S., Hallett, J. E., Cooks, R. G. Developmental phases of individual mouse preimplantation embryos characterized by lipid signatures using desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (10), 2915-2926 (2012).
  31. Lee, J. K., Jansson, E. T., Nam, H. G., Zare, R. N. High-Resolution Live-Cell Imaging and Analysis by Laser Desorption/Ionization Droplet Delivery Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (10), 5453-5461 (2016).
  32. Bergman, H. -. M., Lanekoff, I. Profiling and quantifying endogenous molecules in single cells using nano-DESI MS. Analyst. 142 (19), 3639-3647 (2017).
  33. Yin, L., Zhang, Z., Liu, Y., Gao, Y., Gu, J. Recent advances in single-cell analysis by mass spectrometry. Analyst. 144 (3), 824-845 (2019).
  34. González-Serrano, A. F., et al. Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry Reveals Lipid Metabolism of Individual Oocytes and Embryos. PLoS ONE. 8 (9), e74981 (2013).
  35. Liu, Y., et al. Study on Variation of Lipids during Different Growth Phases of Living Cyanobacteria Using Easy Ambient Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (14), 7096-7102 (2014).
  36. Shrestha, B., et al. Subcellular Metabolite and Lipid Analysis of Xenopus laevis Eggs by LAESI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 9 (12), e115173 (2014).
  37. Stolee, J. A., Shrestha, B., Mengistu, G., Vertes, A. Observation of Subcellular Metabolite Gradients in Single Cells by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 51 (41), 10386-10389 (2012).
  38. Zhang, L., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
  39. Shrestha, B., Nemes, P., Vertes, A. Ablation and analysis of small cell populations and single cells by consecutive laser pulses. Applied Physics A. 101 (1), 121-126 (2010).
  40. Stolee, J. A., Vertes, A. Toward Single-Cell Analysis by Plume Collimation in Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (7), 3592-3598 (2013).
  41. Zhang, L., Vertes, A. Single-Cell Mass Spectrometry Approaches to Explore Cellular Heterogeneity. Angewandte Chemie International Edition. 57 (17), 4466-4477 (2018).
  42. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (21), (2015).
  43. Liu, R., Pan, N., Zhu, Y., Yang, Z. T-Probe: An Integrated Microscale Device for Online In Situ Single Cell Analysis and Metabolic Profiling Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 90 (18), 11078-11085 (2018).
  44. Pan, N., Rao, W., Standke, S. J., Yang, Z. Using Dicationic Ion-Pairing Compounds To Enhance the Single Cell Mass Spectrometry Analysis Using the Single-Probe: A Microscale Sampling and Ionization Device. Analytical Chemistry. 88 (13), 6812-6819 (2016).
  45. Sun, M., Tian, X., Yang, Z. Microscale Mass Spectrometry Analysis of Extracellular Metabolites in Live Multicellular Tumor Spheroids. Analytical Chemistry. 89 (17), 9069-9076 (2017).
  46. Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Mass Spectrometry Measurement of Single Suspended Cells Using a Combined Cell Manipulation System and a Single-Probe Device. Analytical Chemistry. 91 (3), 1738-1742 (2019).
  47. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 986-993 (2015).
  48. Rao, W., Pan, N., Yang, Z. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), 53911 (2016).
  49. Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (1), 124-134 (2016).
  50. Liu, R., Zhang, G., Yang, Z. Towards rapid prediction of drug-resistant cancer cell phenotypes: single cell mass spectrometry combined with machine learning. Chemical Communications. 55 (5), 616-619 (2019).
  51. Sun, M., Yang, Z. Metabolomic Studies of Live Single Cancer Stem Cells Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91 (3), 2384-2391 (2019).
  52. Tian, X., Zhang, G., Shao, Y., Yang, Z. Towards enhanced metabolomic data analysis of mass spectrometry image: Multivariate Curve Resolution and Machine Learning. Analytica Chimica Acta. 1037, 211-219 (2018).
  53. Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single Cell Isolation and Analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
  54. Wu, C., Wu, P., Zhao, H., Liu, W., Li, W. Clinical Applications of and Challenges in Single-Cell Analysis of Circulating Tumor Cells. DNA and Cell Biology. 37 (2), 78-89 (2017).
  55. Schober, Y., Guenther, S., Spengler, B., Römpp, A. Single Cell Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. Analytical Chemistry. 84 (15), 6293-6297 (2012).
  56. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrometry Reviews. 22 (5), 332-364 (2003).

Tags

Single Cell AnalysisSingle-probe Mass SpectrometryIntegrated Cell Manipulation PlatformLiquid BiopsyCellular HeterogeneitySample PreparationPatient-derived CellsAmbient AnalysisGlass Probe FabricationMicroinjector Setup

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Standke, S. J., Colby, D. H., Bensen, R. C., Burgett, A. W. G., Yang, Z. Integrated Cell Manipulation Platform Coupled with the Single-probe for Mass Spectrometry Analysis of Drugs and Metabolites in Single Suspension Cells. J. Vis. Exp. (148), e59875, doi:10.3791/59875 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image