Otomatik İş İstasyonu Kullanarak Kütle Spektrometresi Için Plazma Numune Spektrometresi Hazırlığı
Summary
Burada, kütle spektrometresi tabanlı kantitatif proteomik analiz için otomatik plazma protein sindirim yöntemi salıyoruz. Bu protokolde protein denatürasyonu, redüksiyon, alkillenme ve tripsin sindirim reaksiyonları için sıvı transfer ve kuluçka adımları düzene sokulmuş ve otomatikhale getirilir. İstenilen hassasiyetle 96 kuyulu bir plaka hazırlamak yaklaşık beş saat sürer.
Abstract
Proteomik kitle spektrometresi analizi için örnek hazırlama bir peptit karışımı içine proteinlerin enzimatik bölünmesi gerektirir. Bu süreç denatürasyon, azaltma, alkillenme ve dekolte elde etmek için çok sayıda kuluçka ve sıvı transfer adımları içerir. Bu iş akışının otomatik bir iş istasyonuna uyarlanması verimliliği artırabilir ve varyans katsayılarını azaltabilir ve böylece örnek türleri arasında istatistiksel karşılaştırmalar için daha güvenilir veriler sağlayabilir. Daha önce otomatik proteomik numune hazırlama iş akışı1’iaçıklamıştık. Burada, daha verimli ve daha iyi kontrollü bir iş akışının gelişimini aşağıdaki avantajlarla bildiririz: 1) Sıvı aktarım adımlarının sayısı reaktifleri birleştirerek dokuzdan altıya düşürülür; 2) Pipetleme süresi, birden fazla kanallı 96 konumlu pipetleme kafası kullanılarak seçici uç pipetleme ile azaltılır; 3) Potansiyel iş artışı, 45 güverte pozisyonuna kadar kullanılabilirliği ile artırılır; 4) Sistemin komple muhafaza sıcanda ve çevresel kontrol gelişmiş sağlar ve numune veya reaktiflerin kontaminasyon potansiyelini azaltır; ve 5) Her numuneye kararlı izotop etiketli peptidlerin yanı sıra β-galaktosidaz proteininin eklenmesi tüm süreç boyunca izleme ve kalite kontrolünü mümkün kılar. Bu donanım ve proses geliştirmeleri iyi tekrarlanabilirlik sağlar ve intra-tsay ve ara türetme hassasiyetini artırır (CV %20’den azdır) LC-MS bazlı protein ve peptit niceliği için. 96 kuyuluk bir plakada 96 numunenin sindirilmesi için tüm iş akışı yaklaşık 5 saat içinde tamamlanabilir.
Introduction
Kütle spektrometresi (MS) bazlı protein ve peptit nicelliği, temel araştırma ve klinik laboratuvarlarda plazma analizi için biyoanalitik bir araç olarak giderek daha fazla uygulanmaktadır2,3. MS tek bir MS çalıştırmak yüzlerce peptidler ölçmek için yeteneği nedeniyle belirli peptid dizileri hedefleyerek proteinlerveya modifiye proteinleri ölçmek için tercih edilen yöntem ve bilişim hızla gelişmiştir4. Numune hazırlama herhangi bir proteomik analiz için temel görevi görededir. MS analizinden önce, biyolojik bir örneklemdeki proteinler tipik olarak denatüre edilir, azalır, alkillenir, triptik peptidlere sindirilir ve5.derecedetuzsuzlaştırılır. Alkillenme kontrolsüz modifikasyonları önlemek ve tüm sisteinların aynı kütleye sahip olmasını sağlamak için sisteinları engeller. Daha sonra, tripsin peptidler içine proteinleri sindirmek için eklenir. Bu adımların her biri optimizasyon gerektirir ve tüm işlem geleneksel olarak el ile gerçekleştirilir ve analitik hataların başlatılmasına olanak sağlar.
Geleneksel biyomarker geliştirme boru hattı iki ana süreçlerden oluşur: küresel protein keşfi için av tüfeği proteomik bir derinlemesine protein envanteri oluşturmak için6 ve doğrulama ve doğrulama için hedeflenen proteomik yüksek hassasiyetli ve yüksek iş itimat protein niceliği amaçlayan7. MS yaklaşımı ne olursa olsun, numune hazırlama aynıdır ve bir peptit karışımı içine proteinlerin enzimatik bölünmesi üzerinde merkezleri. Van Eyk ve Sobhani8tarafından önerildiği gibi, hem keşif hem de hedefli tahliller için doğru, kesin ve tekrarlanabilir analizsağlayan bir yönteme sahip olmak, keşif biyobelirteçlerini klinik olarak uygulanan tahlillere etkin bir şekilde taşımak isteilmektedir. Bunu yapmak için, numune hazırlama otomasyonu yararlı olacaktır ve yüksek iş hacmi analizi için verimliliği artırmak için yeteneği sağlar. Manuel yöntemler genellikle biyobelirteçleri ve tanı 2 içeren gözden geçirilmiş Biyoanalitik Yöntem Doğrulama Kılavuzu, Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından belirtilen kabul edilebilir sınırların ötesinde analitikhatalar,tanıtmak ,9. Binlerce biyolojik numunenin hazırlanması ve analiz edilmesi için biyomarker araştırmasını kolaylaştırmak için hızlı, son derece doğru ve eller serbest MS protein numunesi hazırlama iş akışının geliştirilmesi gerekecektir. MS örnek hazırlama, hataların ortaya çıkarılabildiği birçok adıma sahiptir ve işlem sıkıcı ve zaman alıcıdır.
Geliştirilmiş yöntemimizde, gerekli tüm plazma numune hazırlama prosedürlerini toplam 6 adımda(Şekil 1)gerçekleştirmek üzere otomatik bir iş istasyonu programlandı: 1) doğru sıvı transferleri; 2) reaksiyon başlatılır ve tutarlı bir zamanda durdurulur; 3) reaksiyon kontrollü bir sıcaklıkta yapılır (yani, kuluçka makinesi); ve 4) reaksiyon tüm reaksiyonlar için tek tip karıştırma vardır. Ayrıca, LC-MS bazlı protein ve peptit nicelemesini 96-iyi formatında kaliteli ve tekrarlanabilir bir şekilde sağlamak için eksojen kalite kontrol proteinleri ve iç standartlar (kararlı izotop etiketli peptit standartları) ekleyerek uyguladık. Reaktif hazırlama, çalışma saatleri ve toplam 1.000.000 pipetleme adımı da dahil olmak üzere 96 numunenin tek tek tüplerde işlenmesi gerekecektir. Otomasyon, uygulamalı zamanı ve ilgili insan etkileşimlerinin sayısını azaltır.
Protocol
1. Otomatik sıvı işleyicisi için programlama Dosya menüsünden yeni bir yöntem oluşturma (Dosya | Yeni Yöntem)NOT: Verilen sırayla adımları tamamlayın. Italik yazı tipi, Biomek yazılımında yazı yazmak için metni gösterir. Pipetleme teknikleri ve şablonları hakkında bilgi için lütfen yazarlarla iletişime geçin. Başlangıç adımı değişkenlerini ve değerlerini tablo 1’de listelenen başlangıç adımında yazın. Seçici uç pipetleme için sütunları ayarlayın. 1.3-1.7 adımları için Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Genel Ayarla’yı tıklatın ve metoduna sürükleyin. Genel Ayar adımını kullanarak, değer =FirstColumn’u değişken FirstColumn_Global, değer =LastColumn-LastColumn_Global LastColumn_Globaldeğişkenine , değer =LastColumn-FirstColumn+1-değişken Sütunlarve değer =Sütunlar*8 değişken Wells’e. Denetim Adımları altındaki araç çubuğunda Komut Dosyası adımını seçin ve yönteme sürükleyin. Şekil 2’debelirtildiği gibi VB komut dosyası yazın. Karışımlar için set hacimleri Set Global ve çözümleri ayarlayın. Genel Küme adımını kullanarak, Tablo 2’de gösterildiği gibi birim karışımı değişkenlerine karşılık gelen değerleri ayarlayın. Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki “Artık” adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Koşullar altında, Autosampleryazın. Ardından, Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Genel Küme Ayarla’yı tıklatın ve metoduna sürükleyin. Global Ayar adımını kullanarak, değer =(MobilePhase*Columns)+10 ile değişken MobilePhaseWell’iayarlayın. Elsealtında, Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Genel Küme Ayarla adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Global Ayar adımını kullanarak, değeri =0’ı değişken MobilePhaseWell’e ayarlayın Güdümlü Laboratuvar Kurulumu (GLS) Yapılandırma Yardımcı Programlaraltındaki araç çubuğunda Deck Düzenleyici adımını tıklatın. Şekil 3’teki güverte düzenine karşılık gelecek yeni bir deste oluşturun ve güverte 1 olarak etiketlendi. Kurulum & Aygıtlar altındaki araç çubuğunda Kılavuzlu Kurulum adımını tıklatın ve yönteme sürükleyin. Tablo 3’tebelirtildiği gibi laboratuar yazılım türlerini güverte konumlarında sürükleyin ve bırakın. Daha sonra tablodaki sekmeleri Tablo 3 ve Şekil 4’te gösterildiği gibi doldurun (Kılavuzlu Kurulumu ayarlama). İpucu sayma prosedürü nün ayarlanması Denetim Adımları altındaki araç çubuğunda Yordamı Tanımla’yı tıklatın ve yönteme sürükleyin. TipCountolarak adlandırma yordamı. Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Komut Dosyası adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. VB komut dosyasını Şekil 5’te (İpucu sayma komut dosyası) belirtildiği şekilde yazın. Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki “Artık” adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Koşullar altında TL5 = 0 yazın. Ardından, Kurulum ve Aygıt Adımları altındaki araç çubuğundaki Taşı Labware adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Labware’i TL5’ten TR3’e taşıyın. Kurulum ve Aygıt Adımları altındaki araç çubuğundaki Taşı Labware adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Labware’i TL2’den TL5’e taşıyın. Son olarak, Kurulum ve Aygıt Adımları altındaki araç çubuğundaki Taşı Labware adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Labware’i BC90’dan TL2’ye taşıyın. Kuvöz için tanımlama prosedürü Denetim Adımları altındaki araç çubuğunda Yordamı Tanımla’yı tıklatın ve yönteme sürükleyin. Incubator olarak isim prosedürü. Devre Zamanını Değişken Adı ve Varsayılan Değer olarak 1800 yazın. NextTemp’i Değişken Adı ve Varsayılan Değer olarak 22 olarak yazın. Değişken Adı ve Varsayılan Değer olarak 60 olarak temp yazın. Kurulum ve Aygıt Adımları altındaki araç çubuğundaki Gelişmiş Taşı Labware adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Labware’i P11’den INHECO1’e taşıyın. Denetim Adımları altındaki araç çubuğunda Yordamı Çalıştır’ı tıklatın ve metoduna sürükleyin. İpucu Sayısı olarak adlandırma yordamı. Tümleştirmeler altındaki araç çubuğundaki INHECO Incubate adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Cihazı pozisyonda kullanmak için INHECO1 yazın, =Incubate için HalfTime, °C için =Temp ve hedef sıcaklığın °C için 3’ü yazın. Kuluçka seçeneği ve Orbital (saat yönünde)sallamak tarzı sırasında Shake seçin. Ayarlar için, 1,00 mm’yi yan yana, saniyede 6,6 kez, 1,00 mm ileri reklam geriye ve saniyede 6,6 kez yazın.NOT: INHECO Incubator yazılımının yüklü olduğundan emin olun. Tümleştirmeler altındaki araç çubuğundaki INHECO Incubate adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Cihazı pozisyonda kullanmak için INHECO1 yazın, =Incubate için HalfTime, °C için =Temp ve hedef sıcaklığın °C için 3’ü yazın. Kuluçka seçeneği ve Orbital (Saat yönünün tersine)sallamak tarzı sırasında Shake seçin. Ayarlar için, 1,00 mm’yi yan yana, saniyede 6,6 kez, 1,00 mm ileri ve geriye doğru saniyede 6,6 kez yazın. Kurulum ve Aygıt Adımları altındaki araç çubuğundaki Duraklat adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. 1 s için tüm sistemi duraklatın. Denetim Adımları altındaki araç çubuğunda Yordamı Tanımla’yı tıklatın ve yönteme sürükleyin. Incubator olarak isim prosedürü. Tümleştirmeler altındaki araç çubuğundaki INHECO Incubate adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Cihazı pozisyonda kullanmak için INHECO1 yazın, incubate için 1, hedef sıcaklığın °C için =NextTemp’ı ve 3’ü hedef sıcaklığıiçin. Orbital için prosedürü tanımlıyor. Kurulum ve Aygıt Adımları altındaki araç çubuğundaki Gelişmiş Taşı Labware adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Labware’i P11’den Orbital1’e taşıyın. Denetim Adımları altındaki araç çubuğunda Yordamı Çalıştır’ı tıklatın ve metoduna sürükleyin. Yordam TipCount’i seçin. Kurulum ve Aygıt Adımları altındaki araç çubuğundaki Aygıt Eylemi adımını tıklatın ve yönteme sürükleyin. Aygıt OritalShaker0, Komut TimedShake seçin. Titreme hızı 1000girin , Tam hıza ulaşmak için zaman 2, Zaman sallamak 30. Kurulum ve Aygıt Adımları altındaki araç çubuğundaki Gelişmiş Taşı Labware adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Labware Orbital1’i P11’e taşıyın. İlk karışımı ayarlama Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpucu Seç adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. TL4 konumunu yeniden düzenleyin’i seçin. Tümleştirmeler altındaki araç çubuğundaki INHECO Incubate adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Cihazı pozisyonda kullanmak için INHECO1, incubate için 1, °C için 60 ve hedef sıcaklığın °C için 3’ü yazın. Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Döngü adımını tıklatın ve İpucu Seç adımı içinde yönteme sürükleyin. Başlangıç olarak col olarak col yazın =Başlangıç olarak FirstColumn, =Son Sütun ve 1 Artış olarak. 1 Sıvı Taşıma Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Yükleme İpuçlarını Seç’i tıklatın ve döngü adımı içinde yönteme sürükleyin. Açılan menüden BC90 İpuçları, TL5 Konum ve TL2 yedek İpuçları Konum’u seçin. Tek Sütun(lar) seçin ve 1yazın. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Aspire’ı seç’i tıklatın ve döngü adımı içinde yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaktif Plaka Konumu’nü seçin. Hacim yazın =FirstMix, Sütun 1 ve satır 1’de aspire . 1 Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğunda İpuçları Dağıt adımını seçin ve döngü adımı içinde yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaktif Plaka Konumu’nü seçin. Hacim yazın =FirstMix, sütunda dağıtmak =col ve satır 1. Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçlarıNı Al adımını tıklatın ve döngü adımı içinde yönteme sürükleyin. TR1 için Boşalt ipuçlarını seçin. Örnekleri ayarlama Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki “Artık” adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Koşul olarak SamplePlate yazın. Ardından, Sıvı Taşıma Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Yükle İpuçlarını Seç’i tıklatın ve metoduna sürükleyin. Açılan menüden BC90 İpuçları, TL5 Konum ve TL2 yedek İpuçları Konum’u seçin. Tek Sütun(lar)’ı seçin ve =uçlu sütunlaryazın. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Aspire’ı seç adımını tıklatın ve daha sonra yönteme sürükleyin. Greiner96RoundPS Labware Türü ve Numune Pozisyonu’ni seçin. Hacim yazın =Örnek, Sütunda Aspire =FirstColumn ve satır 1. Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Dağıt adımını seçin ve daha sonra yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaksiyon Plakası Konumu’nü seçin. Hacim yazın =Örnek, sütunda dağıtmak = FirstColumn ve satır 1. Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçlarıNı Boşalt adımını tıklatın ve daha sonra yönteme sürükleyin. TR1 için Boşalt ipuçlarını seçin. If adımının sonunda, Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Yordam ı tıklatın ve metoduna sürükleyin. Prosedür Kuluçka seçin. Devre Zamanını Değişken Adı ve Varsayılan Değer olarak 1800 yazın. NextTemp’i Değişken Adı ve Varsayılan Değer olarak 22 olarak yazın. Değişken Adı ve Varsayılan Değer olarak 60 olarak temp yazın. Sistein Bloğu’nun Kurulumu Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Döngü adımını tıklatın ve ipucunu seç adımı içinde yönteme sürükleyin. Başlangıç olarak col olarak col yazın =Başlangıç olarak FirstColumn, =Son Sütun olarak ve 1 Artış olarak. Döngüaltında, Sıvı Taşıma Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Yükle İpuçlarını Seç adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Açılan menüden BC90 İpuçları, TL5 Konum ve TL2 yedek İpuçları Konum’u seçin. Tek Sütun(lar) seçin ve 1yazın. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Aspire’ı seç adımını tıklatın ve döngü içinde yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaktif Plaka Konumu’nü seçin. Ses türü =SisteineMix, sütun 2 ve satır 1’deaspire . Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğunda İpuçları Dağıt adımını seçin ve döngü içinde yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaksiyon Plakası Pozisyonuseçin. Türü hacim = CysteineMix, sütun = col ve satır 1dağıtmak . Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçlarıNı Boşalt adımını tıklatın ve daha sonra yönteme sürükleyin. TR1 için Boşalt ipuçlarını seçin. If döngüsünün sona ermesinden sonra, Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Yordam ı tıklatın ve metoduna sürükleyin. Prosedür Kuluçka seçin. Devre Zamanını Değişken Adı ve 300’i Varsayılan Değer olarak yazın. NextTemp’i Değişken Adı ve Varsayılan Değer olarak 43 olarak yazın. Değişken Adı ve Varsayılan Değer olarak 25 olarak temp yazın. İkinci karışımı ayarlama Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Döngü adımını tıklatın ve ipucunu seç adımı içinde yönteme sürükleyin. Başlangıç olarak col olarak col yazın =Başlangıç olarak FirstColumn, =Son Sütun olarak ve 1 Artış olarak. Döngü altında, Sıvı Taşıma Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Yükle İpuçlarını Seç’i tıklatın ve metoduna sürükleyin. Açılan menüden BC90 İpuçları, TL5 Konum ve TL2 yedek İpuçları Konum’u seçin. Tek Sütun(lar) seçin ve 1yazın. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Aspire’ı seç adımını tıklatın ve döngü içinde yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaktif Plaka Konumu’nü seçin. Hacim türü =SecondMix, Sütun 3 ve satır 1’deaspire . Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğunda İpuçları Dağıt adımını seçin ve döngü içinde yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaksiyon Plakası Konumu’nü seçin. Türü hacim = SecondMix, sütunda dispense = col ve satır 1. Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçlarıNı Boşalt adımını tıklatın ve daha sonra yönteme sürükleyin. TR1 için Boşalt ipuçlarını seçin. If döngüsünün sonunda, Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Yordam ı tıklatın ve metoduna sürükleyin. Orbital prosedürünü seçin. Kurulum ve Aygıt Adımları altındaki araç çubuğundaki Duraklat adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. 1 s için tüm sistemi duraklatın. Trypsin eklemesi ayarlama Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Döngü adımını tıklatın ve ipucunu seç adımı içinde yönteme sürükleyin. Başlangıç olarak col olarak col yazın =Başlangıç olarak FirstColumn, =Son Sütun olarak ve 1 Artış olarak. Döngüaltında, Sıvı Taşıma Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Yükle İpuçlarını Seç adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Açılan menüden BC90 İpuçları, TL5 Konum ve TL2 yedek İpuçları Konum’u seçin. Tek Sütun(lar) seçin ve 1yazın. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Aspire’ı seç adımını tıklatın ve döngü içinde yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaktif Plaka Konumu’nü seçin. Hacim türü =Tripsin, Sütun 4 ve satır 1’deaspire . Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğunda İpuçları Dağıt adımını seçin ve döngü içindeki yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaksiyon Plakası Konumu’nü seçin. Hacim yazın =Tripsin, Sütunda Dispense = col ve satır 1. Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçlarıNı Boşalt adımını tıklatın ve daha sonra yönteme sürükleyin. TR1 için Boşalt ipuçlarını seçin. If döngüsünün sona ermesinden sonra, Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Yordam ı tıklatın ve metoduna sürükleyin. Prosedür Kuluçka seçin. Devre Zamanını Değişken Adı ve 3600’i Varsayılan Değer olarak yazın. NextTemp’i Değişken Adı ve Varsayılan Değer olarak 25 olarak yazın. Değişken Adı ve Varsayılan Değer olarak 43 olarak geçici yazın. Tümleştirmeler altındaki araç çubuğundaki INHECO Incubate adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. INHECO Incubator yazılımının yüklü olduğundan emin olun. Cihazı pozisyonda kullanmak için INHECO1, incubate için 1, °C için 25 ve hedef sıcaklığın °C için 5’ini yazın. Söndürme ayarlama Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Döngü adımını tıklatın ve İpucu Seç adımı içinde yönteme sürükleyin. Başlangıç olarak col olarak col yazın =Başlangıç olarak FirstColumn, =Son Sütun olarak ve 1 Artış olarak. Döngüaltında, Sıvı Taşıma Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Yükle İpuçlarını Seç adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Açılan menüden BC90 İpuçları, TL5 Konum ve TL2 yedek İpuçları Konum’u seçin. Tek Sütun(lar) seçin ve 1yazın. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Aspire’ı seç adımını tıklatın ve döngü içinde yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaktif Plaka Konumu’nü seçin. Hacim yazın =Söndürme, Sütun 5 ve satır 1’deAspire . Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğunda İpuçları Dağıt adımını seçin ve döngü içinde yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaksiyon Plakası Pozisyonuseçin. Türü hacim =Quench, sütun = col ve satır 1dağıt . Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı Taşıma Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Nı Seç adımını tıklatın ve sonraiçinde yönteme sürükleyin. TR1 için Boşalt ipuçlarını seçin. If döngüsünün sonunda, Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Yordam ı tıklatın ve metoduna sürükleyin. Yordam Orbitalseçin. Kurulum ve Aygıt Adımları altındaki araç çubuğundaki Duraklat adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. 1 siçin tüm sistemi duraklatma . Kurulum ve Aygıt Adımları altındaki araç çubuğundaki Duraklat adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Tüm sistemi Duraklat’ı seçin ve bu iletiyi görüntüleyin. ‘Santrifüjden sonra devam et’ iletisini yazın. Autosampler için plaka ayarlama Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki “Tamam” adımını tıklatın ve İpucu Seç adımı içinde yönteme sürükleyin. Koşul olarak Autosampler yazın. Ardından, Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Döngü adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Başlangıç olarak col olarak col yazın =Başlangıç olarak FirstColumn, =Son Sütun olarak ve 1 Artış olarak. Döngüaltında, Sıvı Taşıma Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Yükle İpuçlarını Seç adımını tıklatın ve metoduna sürükleyin. Açılan menüden BC230 İpuçları, TL6 Konum ve TL2 yedek İpuçları Konum’u seçin. Tek Sütun(lar) seçin ve 1yazın. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Aspire’ı seç adımını tıklatın ve döngü içinde yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaktif Plaka Pozisyonuseçin. Hacim yazın =MobilePhase, Sütun 6 ve satır 1’deaspire . Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğunda İpuçları Dağıt adımını seçin ve döngü içinde yönteme sürükleyin. Labware Type ve Autosampler Plaka Pozisyonu Bio_RadPCR96 seçin. Hacim yazın =MobilePhase, Sütunda Dağıt = col ve satır 1. Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı Taşıma Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Nı Seç adımını tıklatın ve sonraiçinde yönteme sürükleyin. TR1 için Boşalt ipuçlarını seçin. If döngüsünün sona ermesinden sonra, Denetim Adımları altındaki araç çubuğundaki Yordam ı tıklatın ve metoduna sürükleyin. Yordam TipCount’useçin. Sıvı Taşıma Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Yükle İpuçlarını Seç’i tıklatın ve metoduna sürükleyin. Açılan menüden BC90 İpuçları, TL5 Konum ve TL2 yedek İpuçları Konum’u seçin. Tek Sütun(lar)’ı seçin ve =uçlu sütunlaryazın. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçları Aspire’ı seç’i tıklatın ve döngü içindeki yönteme sürükleyin. BCDeep96Round Labware Türü ve Reaksiyon Plakası Pozisyonuseçin. Hacim yazın =DigestTransfer, Sütunda Aspire =firstcolumn ve satır 1. Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı İşleme Adımları altındaki araç çubuğunda İpuçları Dağıt adımını seçin ve döngü içinde yönteme sürükleyin. Labware Type ve Autosampler Plaka Pozisyonu Bio_RadPCR96 seçin. Hacim yazın =MobilePhase, Sütunda Dağıt =FirstColumn ve satır 1. Teknik açılır menüden optimize edilmiş bir teknik seçin. Sıvı Taşıma Adımları altındaki araç çubuğundaki İpuçlarıNı Al adımını tıklatın ve ardındanyönteme sürükleyin. TR1 için Boşalt ipuçlarını seçin. İpuçları nı seç adım burada sona erer. Yöntemi kaydedin ve adlandırın. 2. Numune, laboratuvar ve reaktifler hazırlamak 5 μL havuzlu sağlıklı insan plazmasını Polipropilen, 96-Round Deep Well Plate’e aktarın.NOT: Bu protokolde kullanılan reaktifler ve sarf malzemeleri için Malzemeler Tablosu’na bakınız. TPCK Treated Trypsin satın alındı ve substrat oranına tripsin ve kuluçka süresi özellikle optimize edildi. Sekans dereceli rekombinant tripsin gibi farklı bir tripsin derecesi kullanılıyorsa, enzimden substrat oranına ve kuluçka süresine kadar test edilmeli ve optimize edilmelidir. 3. Çalışma prosedürü Yazılım simgesine çift tıklayın. Yöntem sekmesialtında, otomatik sıvı işleyicisini yönlendirmek ve hazırlamak için Tüm Eksenleri Ana Sayfa’yı seçin. Tüm iş istasyonu şırıngalarının görünür hava kabarcıkları içermediğinden emin olun. DosyaNın Altında , Aç ‘ı seçin | Yöntem. Yöntemi seçin (Şekil 6). Yeşil üçgen şeklindeki Çalıştır simgesini tıklatarak yöntemi başlatın. Yöntemin sonunda bir autosampler plakası hazırlayabilmek için, ‘Autosampler’ komut istemi için kullanılacak bir değeri girin’e ‘true’ değerini girin ve ardından Tamam’ıtıklatın. Bir autosampler plakası hazırlanmıyorsa, ‘false’ değerini girin ve ardından Tamam’ıtıklatın. ‘Firstcolumn’ komut istemi için kullanılacak bir değeri girin ve ardından Tamam’ıtıklatın. ‘Lastcolumn’ komut istemi için kullanılacak bir değeri girin’e ’12’ değerini girin ve ardından Tamam’ıtıklatın.NOT: Bu adım ve adım 4.7 iş istasyonuna 96 kuyulu bir plakanın 12 sütununda sindirim icra etmesini söyleyerek, plakanın tüm kuyularının sindirim için kullanılmasına neden oluyor. Örnek bir plaka en az 20 μL’lik örnek hacimlerle kullanılıyorsa, ‘SamplePlate’ komut istemi için kullanılacak bir değeri girin’e ‘true’ değerini girin ve ardından Tamam’ıtıklatın. Örnek bir plaka kullanılıyorsa, ‘false’ değiştirin ve ok’seçeneğini tıklatın.NOT: Bir numune plakası kullanılıyorsa, Reaksiyon Plakasının ilgili her kuyusuna 5 μL numune ekleyin. Kılavuzlu Labware Kurulumu penceresindeki yönergeleri izleyin ve Devam’ıtıklatın.NOT: Bir sonraki pencerede hazırlanacak “Reaktif Plakası” için düzen açıklanmaktadır(Şekil 7, Ek Tablo 1). Aşağıdaki hacimler, 1 mL Deep Round 96-well plakasındaki tek bir sütunun 8 kuyunun her birine aktarılacaktır:Sütun 1: Reaksiyon Karışımı 540 μL 1.Sütun 2: Sistein Bloğu 50 μL.Sütun 3: Reaksiyon Karışımı 730 μL 2.Sütun 4: Trypsin 130 μL.Sütun 5: 130 μL Quench Çözeltisi.Sütun 5: Mobil Faz Çözümü’nün 1090 μL’si (Kullanıcı adım 6’da ‘true’ girdiyse). İleri’yi tıklatın ve aşağıdaki pencere, Örnek plakasına aktarılmak için gereken minimum hacmi (20 μL) açıklar. Kullanıcı Örnek Plakayı (adım 9) içeren istem için ‘false’ değerini girerse, kullanıcıdan Reaksiyon Plakasına 5 μL numune eklemesi istenir. İleri’yitıklatın.NOT: Sonraki pencerede, otomatik sıvı işleyici güvertesine boş 90 μL’lik bir uç kutusu konulması gerekir. Reaktif Plakası, Reaksiyon Plakası, Örnek Plaka, Otomatik Numune Plakası, 6 tam 90 μL uçlu kutu, boş 90 μL uçlu kutu ve tam 230 μL uçlu kutu yu da içeren otomatik sıvı işleyici destesini belirtildiği ve gösterildiği şekilde(Şekil 8)yeniden İleri’ye tıklayın. Yönteme başlamak için Bitir’i tıklatın.NOT: Finish’itıklattıktan sonra, kullanıcı otomatik sıvı işleyicisine ulaşamaz. Bu makinenin ‘ışık perdesi kırmak’ ve bir güvenlik önlemi olarak sıvı işleyicisi durduracaktır. Santrifüj isteminden sonra Continue’de Reaksiyon Plakasını alın ve 30 dakika 3000 rpm’de santrifüj edin. Santrifüj tamamlandıktan sonra Reaksiyon Plakasını otomatik sıvı işleyicisine santrifüjden önce bulunduğu konuma geri döndürün ve Devam et’itıklatın.NOT: Yöntem tamamlandığında otomatik sıvı işleyicisi tekrar durur. Kullanıcı adım 6 için ‘true’ girdiyse, Autosampler Plakası iş istasyonundan çıkarılabilir ve analiz için sıvı kromatografi aletinin otoörnekleyicisine yerleştirilebilir. 4. LC-MSMS C18 2,1 mm x 100 mm, 0,25 mL/dk akış hızına sahip 3,5 μm sütundan oluşan yüksek akışlı HPLC üzerindeki peptidleri çözün ve üçlü dörtkutuplu kütle spektrometresi üzerinde sıralı olarak analiz edin.NOT: Peptit sindiriminden sonra robotik hazırlanmış örneklerden peptidleri ölçmek için hedeflenen LC-MSMS yöntemi LC-MSMS’in kısa bir açıklamasınıtakiben 1 ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Kolon fırın sıcaklığını 40 °C’ye ayarlayın. İki mobil faz olarak Tampon A (%2 ACN, su, %0,1 formik asit) ve tampon B ( ACN, %5 su, %0,1 formik asit) kullanın. Yüklemeden sonra 5 dakika boyunca kolon %5 B ile dengeleyin. Peptidleri 30 dakika boyunca doğrusal %5 ila oranında tampon B degradesi ile verin. Bir sonraki numuneyi yüklemeden önce kolonu 10 dakika B ve 5 dakika boyunca %5 B ile yıkayarak geri dönüştürün. On-line saptırma için, iki fazlı anahtarlama vanası kullanarak iyon kaynağına girmeden önce post-column eluent’i atık olarak yönlendirin. MRM verilerini işle.
Representative Results
Otomatik iş istasyonundaki otomatik proteomik numune hazırlama iş akışı, kalite kontrol için kullanılan ekzojen bir protein olan albumin, seçilmiş plazma proteini ve β-galaktosidaz (β-gal) için sağlam bir LC-SRM-MS kazanım yöntemi1 ile önceki otomatik protokolümüzden uyarlanmıştır. İşlemden sonra, numuneler serum albumini, β-galaktosidazı hedefleyen bir SRM tahsininde üçlü dörtkutuplu LC-MS ile çalıştırıldı. Otomatik sindirim protokolünün tekrarlanabilirliğini izlemek için her geçiş için SRM sinyalinin varyasyon katsayısı (CV) kullanılmıştır. 5 μL plazma numunesinin sindirimi için reaktif ilavesi ve karıştırma adımlarını 2 saatlik güverte-inkübatör tripsin kuluçka makinesi ile otomatik hale aldık. Tekrarlanabilirliği belirlemek için, bir plazma havuzunun 5°L’si çok kanallı bir kafa (96 pin) ile bir reaksiyon plakasının birden fazla kuyusuna boruhaline getirilmiştir. Kıvamını izlemek için, azalma ve alkillenme reaksiyonları önce β-gal protein ekledi. Otomatik proteomik numune hazırlama iş akışı, kalite kontrol için kullanılan albumin, en yüksek bolluk plazma proteini ve β-gal proteini dahil olmak üzere sağlam bir LC-SRM-MS kazanım yöntemi ile test edilmiştir. İşlenmiş plazma albumin proteinlerinden ve sivri β-gal proteinlerinden üç β-gal peptid ve iki albumin peptid izlendi(Tablo 4). Zamandan tasarruf etmek ve prosedürü basitleştirmek amacıyla, reaktif ve reaksiyon karışımının ekleme/karıştırma/kuluçkaya yatma adımlarını dokuz aşamalı iş akışından altı aşamalı bir iş akışına indirgedik(Şekil 1). Toplam proteomik iş akışı iki deneysel bileşenden oluşuyordu: otomatik numune hazırlama ve LC-MS/MS. Öncelikle, LC-MS/MS SRM veri toplama nın hassasiyetini, autosampler plakasının aynı sindirim kuyularından art arda sekiz enjeksiyonla değerlendirdik. Otomatik numune hazırlama iş akışının hassasiyeti, LC-MS/MS’nin toplam proteomik SRM iş akışı eksi %CV’sinin varyans katsayısı (%CV) yüzdesi ile hesaplanmıştır(Şekil 9B). Otomatik iş istasyonundaki aerodinamik plazma sindirim prosedürü ile, otomatik numune hazırlamanın deneysel hassasiyeti eksojen sivri β-gal proteinleri için ,4’ten daha az (,0 ortalama) ve en bol insan serum albumini için ,9’dan az (ortalama olarak %9,9)(Şekil 9). Beklendiği gibi hem insan serum albumini hem de β-gal proteinleri için iyi sinyal yoğunlukları gözlendi (Şekil 9C). Her pipetleme ve sıvı transfer adımı için teknikler özel olarak optimize edilebildi. Sıvı transfer adımlarının hassasiyetini izlemek için, endojen insan serum albumin proteini ve eksojen β-gal proteini için kararlı izotop etiketli (SIL) peptit standartlarını üç bağımsız reaktif transfer adımlarında tutturduk: Reaksiyon Karışımı 1, Sistein Engelleyici ve Reaksiyon Karışımı 2(Şekil 10). Bu beş SIL peptidinden gelen MRM sinyalleri otomatik sıvı transfer adımlarının hassasiyetini izlemek için elde edildi. Peptidler, DDNPNLPR^ve GDFQFNISR^ (^ Reaksiyon Mix 1 adımından N15 etiketli amino asidi temsil eder) için ortalama %CV %1,8 ile ,2 arasında değişmektedir. Sistein Blokeri adımından bir peptidin ortalama %CV’si (IDPNAWVER^) %6.6 ile %8.8 arasında değişmekteydi. İki peptidin (WVGYGQDSR^ ve LVNEVTEFAK^) ortalama %CV’si %6,2 ile ,9 arasında değişmektedir(Şekil 10). Otomatik proteomik numune hazırlama iş akışını doğrulamak için, insan serum albumini, ekzojen β-gal ve 40 ek plazma proteini için birden fazla protein ve birden fazla gün arasında tekrarlanabilirliği değerlendirdik. Şekil 11A’dagösterilen 21 çoğaltma örneğini (havuzlu normal insan plazması) üç farklı günde işledik. Gün içi CV’ler aynı gün hazırlanan 21 kuyudan hesaplandı. 40 protein için ortalama gün içi %CV’ler %4 ile arasında değişmektedir(Şekil 11B). Plaka tabanlı otomatik iş akışının kenar etkisini değerlendirmek için, %CV belirlenen sütun ve satırlar içindeki belirli kuyulardan hesaplanmıştır (Sütun ve satır haritası içinŞekil 12A). MRM sinyalleri yoğunlukları % 3 – arasında değişen %CV ile tüm kolon ve satır yapılandırmalarında benzerdi(Şekil 12B). Özetle, optimize edilmiş otomatik iş akışı, mükemmel deneysel hassasiyetle beş saatten kısa bir sürede 96 düzgün işlenmiş numune verir. Otomatik bir iş akışıile uyumluluk için, ihmal edilebilir spesifik olmayan yan reaksiyonlara sahip, ortam ışığında kararlı, LC-MS/MS dostu olan ve dondurulmuş aliquots olarak saklanabilir reaktifler seçtik. Şekil 1: Örnek hazırlama iş akışının şeması. Ana 6 sıvı transfer adımları listelenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: İpucu yükleme Komut Dosyası. VB Script ayrıntıları burada gösterilmiştir. Komut dosyası, uç yükleme koşullarını belirtir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Otomatik iş istasyonu Güverte düzeni. Güverte 1×1 ALPs, Tip Yükleme ALPs, Çöp, İpucu yıkama, Peltier ve bir kuluçka oluşur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Reaktif plakasının özellikleri. Kılavuzlu Laboratuvar Kurulumu kullanılarak erişildiğinde Reagent Plate labware için gerekli özellikler gösterilir. Karşılık gelen sütunu seçin ve şekilde belirtildiği gibi değişkenlerde yazın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: İpucu sayma komut dosyası. Bu komut dosyası, güvertedeki ipuçlarının sayısını izlemeye yardımcı olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Plazma örneklerinin sindirilmesi ve aliquoting yöntemine genel bakış. Sıvı işleyici yönteminde reaktif hesaplamaları, labware kurulumu ve sıvı manipülasyonları için adımlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Reaktif plakasının düzeni. Plazma sindirimi ve otoörnekleyici hazırlanması için gerekli olan ve reaktif plakalabware arasında dağıtılan kimyasal reaktifler gösterilmiştir. Bu rakam teknik bir not10’dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: Otomatik iş istasyonunun güvertesindeki laboratuvar yazılımı nın düzeni. Gösterilen sıvı işleyici için plazma sindirim yöntemi için güverte düzenidir. Bu rakam teknik bir not10’dandeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: Toplam proteomik iş akışının hassasiyeti iş istasyonu CV’si ve hedeflenen LC MS/MS CV’den oluşur.Β-gal ve albuminden beş peptid izlendi, her peptid için kromatogramlar ve peptit tutma süresi gösterilmiştir(A),Hassas 30 kuyu/numune işleme temsilcisi deneyden, toplam proteomik iş akışı için CV’ler, LC MS/MS analizi ve otomatik numune işleme hesaplandı (B). Genel olarak, sindirilmiş peptidler iyi sinyaller gösterdi 1×105 kadar 1x108arasında değişmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 10: Sıvı aktarım adımları için hassasiyetin belirlenmesi. Sentetik peptidler adımspesifik reaktiflerde çivili ve otomatik sıvı transferi toplam %CV ile belirlendi. 30 kuyu/numuneden %eksi CV LC MSMS (8 tekrar LC MSMS enjeksiyonu ile belirlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 11: 42 protein MRM analizi ile otomatik proteomik numune hazırlama iş akışının çok gün tekrarlanabilirliği. (A) Üç günün her biri için reaksiyon plakası haritası burada gösterilir, 21 kuyunun her birine 5°L plazma eklenir. Alınan 3 kuyu 5 ul su negatif/boş kontrol olarak kullanılmıştır. (B) Her MRM geçişi için 75 peptid ve 42 protein (solda) ve %CV’den oluşan 190 geçişin ortalama yoğunlukları her gün için 21 kuyu dan (sağda) hesaplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 12: Kuyuların belirli konumlarının tekrarlanabilirliği (sütun ve satırların konumu). (A) Plaka eşlemi olan sütunlar ve Satırlar konumu burada gösterilmiştir. (B) Kolon ve satır konumuna özgü MRM sinyalleri belirtilen kuyulardan ortalama yoğunlukları (sol) ve cv% (sağ) tek bir plaka sindirim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 13: Teknik editörün ekran görüntüsü. Her Pipetting şablonu için sıvı seviyesi algılama, Pıhtı algılama, Delici, Sıvı Tipi, Genel, Aspire, Dağıtım, Mix ve Kalibrasyon özelliklerini tanımlayın. Bu protokolde kullanılan şablon ve teknikler Ek Tablo 2’degösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Değişken Değişken Değer Açıklama Otomatik sampler Boolean True Otomatik örnekleyici kullanın Betagal Tamsayı 5 Betagal hacmi BG1 Tamsayı 0.8 BG1 hacmi BG2 Tamsayı 0.8 BG2 hacmi BG3 Tamsayı 0.8 BG3 hacmi SisteinBloker Tamsayı 1.25 Sistein bloker hacmi SisteinTampon Tamsayı 0.45 Sistein arabellek hacmi Denaturant Tamsayı 5 Denaturant hacmi DigestTransfer Tamsayı 10 Sindir aktarım hacmi İlk Arabellek Tamsayı 25.9 İlk arabellek hacmi İlk Sütun Tamsayı 1 İlk Sütun HSA1 Tamsayı 0.8 HSA1 hacmi HSA2 Tamsayı 0.8 HSA2 hacmi son sütun Tamsayı 12 Son Sütun MobilePhase Tamsayı 90 Mobil faz hacmi Yavaşlaması Tamsayı 10 Söndürme sütunu Azaltıcı Ajan Tamsayı 5 Aracı sütununu azaltma Örnek Tamsayı 5 Örnek sütun Örnek Plaka Boolean True Örnek plaka kullanın İkinciArabellek Tamsayı 58.4 İkinci arabellek hacmi Tripsin Tamsayı 10 Tripsin sütunu Tablo 1: Başlangıç adım değişkenleri Değer Değişken =İlkTampon+Denaturant+ReducingAgent+Betagal+BG1+HSA1 FirstMix =SisteinBloker+SisteinTampon+BG2 SisteinKarışımı =İkinciAraffer+BG3+HSA2 SecondMix =(FirstMix*Sütunlar)+30 FirstMixwell = (SisteinKarışımı*Sütunlar)+20 Sistein Kuyusu =(SecondMix*Sütunlar)+10 İkinciMixwell =(Tripsin*Sütunlar)+10 TrypsinWell =(Söndürme*Sütunlar)+10 QuenchWell =(FirstMixWell*8)+100 FirstMixStock =Sisteinkuyu*8+20 SisteinMixStock =(SecondMixWell*8)+100 SecondMixStock Tablo 2: Hacim karışımı değişkenleri Türü Adı Konum Derinlik Özellikler Kullanın? BCDeep96Round Reaktif Plakası P5 1(üst) # =örnek plaka değil BCDeep96Round Reaktif Plakası P5 1(üst) # =Örnek Plaka BCDeep96Round Reaksiyon Plakası P11 1(üst) True Bio_RadPCR96* Örnekleri P9 1(üst) =Örnek Plaka Bio_RadPCR96* Autosampler Plaka P10 1(üst) =Otomatik örnekleyici M.Ö. 90 Boş 1(üst) True M.Ö. 90 1(üst) True M.Ö. 90 1(üst) True BC230 1(üst) =Otomatik örnekleyici M.Ö. 90 1(üst) =Sütunlar>1 M.Ö. 90 1(üst) =Sütunlar>3 M.Ö. 90 1(üst) =Sütunlar>5 M.Ö. 90 1(üst) =Sütunlar>7 M.Ö. 90 1(üst) =Sütunlar>9 Not:*: 96 iyi Bio-Rad plaka karşılık gelir.#: Özellikleri tıklatın ve ardından Şekil 6’da belirtildiği gibi birim değişkenlerini girin. Tablo 3: Kılavuzlu kurulumun ayarlanması Protein ID Peptit dizisi Q1 Kütlesi (Da) Q3 Kütlesi (Da) Süre (dk) Parça Ion Declustering Potansiyeli Çarpışma enerjisi Çarpışma Hücresi Çıkış Potansiyeli sp| P00722| BGAL_ELOCI GDFQFNISR 542.3 262.1 19.7 +2y2 61 21 8 542.3 636 19.7 +2y5 61 25 12 542.3 764.2 19.7 +2y6 61 25 18 IDPNAWVER 550.3 436.1 18.1 +2y7+2 61 23 8 550.3 871.2 18.1 +2y7 61 25 18 550.3 774.2 18.1 +2y6 61 33 8 WVGYGQDSR 534.3 782.1 12.1 +2y7 51 25 6 534.3 562.1 12.1 +2y5 51 27 6 534.2 505.2 12.1 +2y4 90 25 8 sp| P02768| ALBU_HUMAN DDNPNLPR 470.8 596.2 9.2 +2y5 61 27 16 470.8 499.3 9.2 +2y4 61 27 18 470.8 710.4 9.2 +2y6 61 27 18 LVNEVTEFAK 575.3 694.4 18.2 +2y6 73.1 29.6 18 575.3 937.5 18.2 +2y8 73.1 29.6 18 575.3 823.4 18.2 +2y7 73.1 29.6 18 Tablo 4: MRM parametreleri Ek Tablo 1: Reaktif plakası Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız. Ek Tablo 2: Protokol şablonu Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Kütle spektrometresi için numune işleme sisteinblok protein denatürasyon, azaltma ve alkillenme gerektirir, ve peptidler içine proteinleri cleave tripsin sindirim. Her kimyasal veya enzimatik reaksiyonun belirli bir zamanda başlatılması ve kontrollü bir sıcaklıkta gerçekleştirilmesi gerekir ve bu süreçteki her adım, deneysel varyasyonun ortaya çıkarılabildiği birden fazla sıvı transfer adımı içerir. Otomatik numune işleme bu ikilem için bir çözüm sağlar. Şu anda mevcut olan sıvı işleme sistemleri, kullanılan baş ve uç tipine bağlı olarak reaktifleri %5’in altında doğruluk ve hassasiyetle 96 kuyulu plakalara aktarabilme ve istenirse 14 °C ile 70 °C arasında değişen kontrollü sıcaklıklarda titreme ile numuneleri kuluçkaya yatırma kapasitesine sahiptir. SRM tahlilleri için plazmayı 96 kuyu formatında işlemek için otomatik sıvı işleyicisi kullandık.
Serum, plazma ve diğer biyolojik örneklerdeki proteinlerin karmaşık karışımları içinde binlerce proteaz dekolte alanı vardır; ve bu proteinlerin her biri dekolte site erişilebilirliğini ve ortaya çıkan peptidlerin stabilitesini etkileyen benzersiz özelliklere sahiptir. Bu nedenle, her protein için en uygun bir örnek işleme prosedürü tasarlamak imkansızdır. En iyi alternatif mümkün olduğunca tutarlı olmaktır.
Tutarlılık elde etmek için, otomatik sıvı işleyicitarafından gerçekleştirilen her pipetleme adımını optimize ettik. İlk olarak sıvının tipi (plazma, sulu veya organik) ve buna karşılık gelen özellikler (viskozite, uyum ve uçuculuk), donanım (iş istasyonu pipetleme kafası ve plaka kapma kolları) ve laboratuvar yazılımları tarafından dayatılan hacim ve kısıtlamaları göz önünde bulundurduk. Daha sonra aspirasyon için hız ve sondaj hava boşluğu çeşitli, dağıtım için hız ve üfleme hacmi, ve kuvvet ve karıştırma süresi, aspirasyon ve / veya dağıtım sonra bir ipucu dokunmatik birleştiren ise, gerekirse, uçların dışında sıvı yapışmasını ortadan kaldırmak için(Şekil 13, Ek Tablo 1). İstikrar için önceden taranmış benzersiz bir SIL peptid, her sıvı işleme adımının hassasiyetini izlemeyi mümkün kılmak için her reaktife çivilenmiştir. Optimizasyondan sonra, geçişlerin çoğu için proses CV’leri %10’dan az dı ve otomatik iş istasyonu ile iyi tekrarlanabilirlik gösterdiler(Şekil 9, Şekil 10, Şekil 11 ve Şekil 12).
Burada sunulan otomatik iş akışı, manuel yöntemlere göre geliştirilmiş tekrarlanabilirlik ve elde etme ile tutarlı enzimatik sindirim sağlar(Şekil 9, Şekil 10). Bu yaklaşım, kütle spektrometresi ile biyomarker keşfi nin ve doğrulamanın doğruluğunu ve güvenilirliğini artırmayı vaat etmektedir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiçbiri.
Materials
| A Pooled healthy human plasma | Bioreclamation Inc. | human plasma tested in the manuscript | |
| Acetonitrile, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | A998SK1 | LC MS/MS solvent |
| B-Galactosidase Recombinant from E.Coli | Sigma-Aldrich | G3153-5MG | exogenous control proteins. |
| Biomek i7 Automated Workstation | Beckman Coulter, Inc. | The proteomic sample preparation workstation: Biomek automated workstations are not intended or validated for use in the diagnosis of disease or other conditions | |
| Biomek i-Series Tips 230µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85903 | Tips, i7 consumable |
| Biomek i-Series Tips 90µL Non-Sterile | Beckman Coulter, Inc. | B85881 | Tips, i7 consumable |
| FG, Kit Trypsin TPCK | Sciex | 4445250 | Trypsin used in digestion |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | #hsp9641 | Autosampler plate |
| Octyl B-D-Glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O9882-5G | detergent used in digestion |
| Polypropylene, 96-Round Deep Well Plates Sterile | Beckman Coulter, Inc. | 267007 | Reagent and digestion plate |
| Prominence UFLCXR HPLC system | Shimadzu, Japan | High flow LC sytem | |
| QTRAP 6500 | SCIEX | Mass spectrometer | |
| Water, HPLC Grade | Thermo Fisher Scientific | W54 | LC MS/MS solvent |
| Xbridge BEH30 C18 2.1mm x 100mm | Waters | 186003564 | LC MSMS column |
References
- Fu, Q., et al. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation Workflow for Quantitative Mass Spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Lehmann, S., et al. Clinical mass spectrometry proteomics (cMSP) for medical laboratory: What does the future hold?. Clinica Chimica Acta. 467, 51-58 (2017).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-Scale Interlaboratory Study to Develop, Analytically Validate and Apply Highly Multiplexed, Quantitative Peptide Assays to Measure Cancer-Relevant Proteins in Plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2357-2374 (2015).
- Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (7), 577-583 (2005).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (3), 907-917 (2014).
- Yates, J. R. Pivotal role of computers and software in mass spectrometry – SEQUEST and 20 years of tandem MS database searching. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1804-1813 (2015).
- Nilsson, T., et al. Mass spectrometry in high-throughput proteomics: ready for the big time. Nature Methods. 7 (9), 681-685 (2010).
- Van Eyk, J. E., Sobhani, K. Precision Medicine. Circulation. 138 (20), 2172-2174 (2018).
- Hoofnagle, A. N., et al. Recommendations for the Generation, Quantification, Storage, and Handling of Peptides Used for Mass Spectrometry-Based Assays. Clinical Chemistry. 62 (1), 48-69 (2016).
- Wijayawardena, B., Fu, Q., Johnson, C., Van Eyk, J. E., Kowalski, M. Highly Reproducible Automated Proteomics Sample Preparation on Biomek i-Series. Technical note, Beckman Coulter Life Science. Document # AAG-4890APP02. 19, (2019).
Cite This Article
Fu, Q., Johnson, C. W., Wijayawardena, B. K., Kowalski, M. P., Kheradmand, M., Van Eyk, J. E. A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation. J. Vis. Exp. (158), e59842, doi:10.3791/59842 (2020).