İnsan Kordon Kanı Kaynaklı CD34 Pan-miyeloid Farklılaşması+ Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücreleri
Summary
Burada, dört miyeloid soya immünotipik karakterizasyon ve sitokin kaynaklı cd34+ hematopoetik kök ve ataat hücrelerinin farklılaşması için bir protokol sıyoruz. Bu protokolün uygulamaları cd34+ hücrelerin miyeloid farklılaşması üzerinde miyeloid hastalık mutasyonları veya küçük moleküllerin etkisi üzerine araştırmalar içerir.
Abstract
İnsan hematopoetik kök hücrelerinin ex vivo farklılaşması hematopoezisi incelemek için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Burada açıklanan protokol CD34+ hematopoetik kök ve ata hücrelerinin dört miyeloid soy hücresine sitokin kaynaklı farklılaşması içindir. CD34+ hücreler insan göbek kordon kanIzole ve sitokinler varlığında MS-5 stromal hücreleri ile birlikte kültürlü. Kök ve progenitor hücrelerinin immünonotitipik karakterizasyonu ve diferansiye miyeloid soy hücreleri tanımlanmıştır. Bu protokolü kullanarak, CD34+ hücreleri küçük moleküller ile kuluçkaya ya da miyeloid hastalık mutasyonları miyeloid farklılaşma üzerindeki etkilerini araştırmak için lentivirüsler ile transduced olabilir.
Introduction
Hematopoetik kök hücrelerin (HSC) normal farklılaşması tüm kan hücresi soylarının fizyolojik düzeylerinin sürdürülmesi için önemlidir. Farklılaşma sırasında, büyüme faktörleri ve sitokinler de dahil olmak üzere hücre dışı ipuçlarına eşgüdümlü bir yanıt olarak, HSC’ler ilk lenfo-miyeloid potansiyele sahip çok güçlü progenitor (MPP) hücrelerine yol açar1,2,3 ,4 (Şekil 1). MPP’ler, soy kısıtlamalı yaygın miyeloid atalara (KP) ve yaygın lenfoid atalara (KPS) yol açar. CLP’ler B, T ve doğal öldürücü hücrelerden oluşan lenfoid soylara ayrılırlar. CMP’ler iki daha kısıtlı ata popülasyonu, megakaryosit eritroid ataları (MEP) ve granülosit monosit ataları (GDO) yoluyla miyeloid soyları oluştururlar. MEP’ler megakaryositve eritrositlere yol açarken, GDO’lar granülosit ve monositlere yol açar. CMPs ile kaynaklanan ek olarak, megakaryositler de doğrudan HSCs veya erken MPPs olmayan kanonik yollar üzerinden ortaya bildirilmiştir5,6.
Hematopoetik kök ve ata hücreleri (HSPCs) yüzey marker CD34 ve soy ait belirteçlerin eksikliği ile karakterizedir (Lin–). HSC’leri ve miyeloid ata popülasyonlarını ayırt etmek için yaygın olarak kullanılan diğer yüzey belirteçleri CD38, CD45RA ve CD123 2’dir (Şekil 1). HSC’ler ve MPP’ler Lin–/CD34+/CD38– ve Lin–/CD34+/CD38+, sırasıyla. Myeloid kararlı ata popülasyonları CD45RA ve CD123 varlığı veya yokluğu ile ayırt edilir. CMP’ler Lin–/CD34+/CD38+/CD45RA–/CD123lo, GMP’ler Lin–/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, ve MEP’ler Lin–/CD34+ /CD38+/CD45RA–/CD123–.
CD34+ kök ve ata hücrelerinin toplam popülasyonu insan göbek kordon kanı (UCB), kemik iliği ve periferik kan elde edilebilir. CD34+ hücreler insan UCB’deki toplam mononükleer hücrelerin (MNC) %0,02 ila %1,46’sını oluştururken, bunların yüzdesi kemik iliğinde %0,5 ile %5,3 arasında değişir ve periferik kanda ~%0,01’de çok daha düşüktür7,8,9 . UCB türetilmiş CD34+ hücrelerin proliferatif kapasitesi ve farklılaşma potansiyeli önemli ölçüde kemik iliği veya periferik kanhücrelerinin1,10, elde etmek için ayrı bir avantaj sunan daha yüksektir farklılaşma sırasında hücrelerin immünophenotipik ve morfolojik karakterizasyonu ile birlikte moleküler analizler için yeterli malzeme.
Göbek kordon kanı kaynaklı CD34+ HSPCs ex vivo farklılaşma normal hematopoezis ve hematopoetik hastalık mekanizmaları araştırmak için yaygın olarak uygulanan bir modeldir. Uygun sitokinler ile kültürlü zaman, UCB CD34+ HSPCs miyeloid veya lenfoid soy11,12,13,14,15 boyunca ayırt etmek için indüklenebilir , 16– Burada, CD34+ HSPC’lerin insan UCB’sinden izolasyon ve immünophenotipik karakterizasyonu ve bunların miyeloid soy hücrelerine farklılaşması protokollerini açıklıyoruz. Bu kültür sistemi, kemik iliğindeki mikro ortamı taklit etmek için MS-5 stromal hücrelerinin varlığında HSP’lerin sitokin kaynaklı farklılaşmasına dayanır. Kültür koşulları CD34+ hücrelerin ilk genişlemesine neden olur, ardından dört miyeloid soy hücresi için belirteçleri ifade eden hücrelere farklılaşmaları, yani granülositler (CD66b), monositler (CD14), megakaryositler (CD41) ve eritrositler (CD235a). CD34+ hücre farklılaştırma protokolünün uygulamaları, hematopoeziyi düzenleyen moleküler mekanizmalar üzerine yapılan çalışmaları ve miyeloid hastalığı ile ilişkili mutasyonların ve küçük moleküllerin kendi kendini yenileme ve HSPC’lerin farklılaşması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, UCB’den türetilen CD34+ HSPC’lerin dört miyeloid soya ex vivo farklılaşması için uygundur. SCF, TPO, Flt3L ve IL3’ten oluşan bir sitokin karışımı ile ilk kuluçka CD34+ hücreleri uyarır. Daha sonra, farklılaşma SCF, IL3, Flt3L, EPO ve TPO bir kokteyl ile elde edilir. Bu karışımda, SCF, IL3 ve Flt3L CD34+ HSCs hayatta kalma ve çoğalması için önemlidir. EPO ve TPO eritrositler ve megakaryositler doğru farklılaşma teşvik, sırasıyla, v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Wendy Barrett, Rachel Caballero ve Gabriella Ruiz Maricopa Entegre Sağlık Sistemleri de-tespit ve bağışlanan kordon kan birimleri için, Mrinalini Kala akış sitometri ile yardım için teşekkür etmek istiyorum ve Gay Crooks ve Christopher Seet için ex vivo miyeloid farklılaşma tavsiye. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21CA170786 ve R01GM127464) ve Amerikan Kanser Derneği (Kurumsal Araştırma Hibe 74-001-34-IRG) S.S. fonları ile desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
- Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
- Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
- Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
- Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
- Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
- Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
- Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
- Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
- Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
- Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
- Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
- Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
- Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
- Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
- Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
- Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).
- Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).
