Панмиелоидная дифференциация крови человека, полученная CD34- гематопоиетические стволовые и преддесятинные клетки
Summary
Здесь мы представляем протокол для иммунофенотипической характеристики и цитокинов индуцированной дифференциации пуповинной крови, полученных CD34и гематопоиетических стволовых и клеток-прародителей к четырем миелоидным линиям. Применение этого протокола включает исследования влияния мутаций миелоидных заболеваний или небольших молекул на миелоидную дифференциацию клеток CD34.
Abstract
Ex vivo дифференциации человеческих гематопоитических стволовых клеток является широко используемой моделью для изучения гематопоезии. Описанный здесь протокол предназначен для цитокинов индуцированной дифференциации CD34и гематопоиетического стебля и клеток-прародителей к четырем клеткам миелоидной линии. Клетки CD34 изолируются от пуповинной крови человека и совместно культивируются с стромальными клетками MS-5 в присутствии цитокинов. Описана иммунофенотипическая характеристика стволовых и клеток-прародителей, а также дифференцированных клеток миелоидной линии. Используя этот протокол,клетки CD34 могут быть инкубированы с небольшими молекулами или трансумционированы с лентивирусами для выражения мутаций миелоидной болезни, чтобы исследовать их влияние на дифференциацию миелоидов.
Introduction
Нормальная дифференциация гематопоэтических стволовых клеток (ГСК) имеет решающее значение для поддержания физиологических уровней всех линий клеток крови. Во время дифференциации, в скоординированной реакции на внеклеточные сигналы, включая факторы роста и цитокины, HSCs сначала приводят к многопотентным клеткам-прародителям (MPP), которые имеют лимфо-миелоидный потенциал1,2,3 ,4 (Рисунок1). MPPs дают начало к общим меелоидным прародителям (CMPs) и общим протекторам лимфоида (CLPs) которые lineage-ограниченно. CLPs дифференцируются в лимфоидные линии, состоящие из B, T и естественных клеток-убийц. CMPs генерировать миелоидные линии через два более ограниченных популяций прародителей, мегакариоцитов эритроидных прародителей (MEPs), и гранулоцитмонов прародителей (GMPs). Депутаты Европарламента порождают мегакариоциты и эритроциты, в то время как ГМП порождают гранулоциты и моноциты. В дополнение к возникающим через CMPs, мегакариоциты, как сообщается, также возникают непосредственно из HSCs или ранних MPPs через неканонические пути5,6.
Гематопоитические стволовые и клетки-прародители (HSPCs) характеризуются поверхностным маркером CD34 и отсутствием родовых специфических маркеров (Lin–). Другие поверхностные маркеры, которые обычно используются для различения HSCs и миелоидных популяций прародителей включают CD38, CD45RA и CD1232 (Рисунок 1). HSCs и MPPs являются Лин–/CD34/CD38– и Лин–/CD34//CD38,соответственно. Популяции миелоидных прародителей отличаются наличием или отсутствием CD45RA и CD123. CMPs являются Лин–/CD34 /CD38/CD45RA–/CD123lo, GMPs являются Лин–/CD34//CD38 / CD45RA / CD123lo, и MEPs являются Лин–/CD34 /CD38/CD45RA–/CD123–.
Общая популяция клеток ствола и прародителей CD34 может быть получена из пуповинной крови человека (UCB), костного мозга и периферической крови. КлеткиCD34 составляют от 0,02% до 1,46% от общего числа моноядерных клеток (МНК) в UCB человека, в то время как их процент колеблется от 0,5% до 5,3% в костном мозге и значительно ниже на 0,01% в периферической крови7,8,9 . Пролиферативная способность и потенциал дифференциации UCB производных клеток CD34значительно выше, чем у костного мозга или периферических клеток крови1,10, тем самым предлагая явное преимущество для получения достаточноматериала для молекулярного анализа в сочетании с выполнением иммунофенотипической и морфологической характеристики клеток во время дифференциации.
Ex vivo дифференциации пуповинной крови, полученных CD34и HSPCs является широко прикладной моделью для исследования нормальных механизмов гематопоезии и гематопоетических заболеваний. При культивировании с соответствующими цитокинами, UCB CD34и HSPCs могут быть индуцированы, чтобы дифференцировать вдоль миелоидных или лимфоидных линий11,12,13,14,15 , 16. Здесь мы описываем протоколы для изоляции и иммунофенотипической характеристики CD34и HSPCs от человека UCB, и для их дифференциации к клеткам линии миелоида. Эта культурная система основана на цитокино-индуцированной дифференциации HSPCs в присутствии стромальных клеток MS-5 для имитации микросреды в костном мозге. Условия культуры причиняют первоначальное расширение клеток CD34, последовано за их дифференциацией к клеткам которые выражают маркеры для 4 клеток линии миелоида, а именно granulocytes (CD66b), monocytes (CD14), megakaryocytes (CD41), и эритроцитов (CD235a). Применение протокола дифференциации клеток CD34включает исследования молекулярных механизмов, регулирующих гематопоис, а также исследования влияния связанных с миелоидными мутациями и малых молекул на самообновление и дифференциации HSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь протокол подходит для дифференциации ex vivo uCB, полученных CD34и HSPCs к четырем миелоидным линиям. Первоначальная инкубация с цитокиновым миксом, состоящим из SCF, TPO, Flt3L и IL3, стимулирует клетки CD34. Впоследствии дифференциация достигается с помощью коктейля SCF, IL3, Flt3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Венди Барретт, Рейчел Кабальеро, и Габриэлла Руис Марикопа интегрированных систем здравоохранения для де-идентифицированных и сданных пуповинной крови единиц, Mrinalini Кала за помощь с потоком цитометрии, и Гей Крукс и Кристофер Seet для советы по ex vivo миелоидной дифференциации. Эта работа была поддержана средствами для S.S. из Национальных институтов здравоохранения (R21CA170786 и R01GM127464) и Американского онкологического общества (Институциональные исследования Грант 74-001-34-IRG). Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
- Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
- Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
- Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
- Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
- Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
- Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
- Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
- Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
- Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
- Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
- Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
- Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
- Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
- Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
- Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
- Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).
- Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).
