Panmyeloische Differenzierung von humanem Cordblood abgeleitet CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur immunphenotypischen Charakterisierung und Zytokin-induzierten Differenzierung von Nabelschnurblut abgeleitet CD34+ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Linien vor. Die Anwendungen dieses Protokolls umfassen Untersuchungen über die Wirkung von myeloischen Krankheitsmutationen oder kleinen Molekülen auf die myeloische Differenzierung der CD34+ Zellen.
Abstract
Die Ex-vivo-Differenzierung menschlicher hämatopoetischer Stammzellen ist ein weit verbreitetes Modell zur Untersuchung der Hämatopoese. Das hier beschriebene Protokoll ist für die zytokininduzierte Differenzierung von CD34+ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Abstammungszellen. CD34+ Zellen werden aus menschlichem Nabelschnurblut isoliert und in Gegenwart von Zytokinen mit MS-5 Stromalzellen kokultiviert. Die immunotypische Charakterisierung der Stamm- und Vorläuferzellen sowie der differenzierten myeloischen Abstammungszellen werden beschrieben. Mit diesem Protokoll können CD34+ Zellen mit kleinen Molekülen inkubiert oder mit Lentiviren transduziert werden, um myeloische Krankheitsmutationen auszudrücken, um ihre Auswirkungen auf die myeloische Differenzierung zu untersuchen.
Introduction
Die normale Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen (HSCs) ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der physiologischen Werte aller Blutkörperchen. Während der Differenzierung, in einer koordinierten Reaktion auf extrazelluläre Hinweise einschließlich Wachstumsfaktoren und Zytokine, HSCs zuerst entstehen multipotente Vorläuferzellen (MPP) Zellen, die lympho-myeloides Potenzialhaben 1,2,3 ,4 (Abbildung 1). MPPs führen zu gemeinsamen myeloischen Vorläufern (CMPs) und gemeinsamen lymphoiden Vorläufern (CLPs), die Abstammungsbeschränkungen sind. CLPs unterscheiden sich in die lymphoiden Linien, die aus B, T und natürlichen Killerzellen bestehen. CMPs erzeugen die myeloischen Abstammungen durch zwei eingeschränkte Vorläuferpopulationen, MegakaryozytenerErythroid-Vorläufer (MEP) und Granulozytenmonozytenvorläufer (GMPs). Die MdEP führen zu Megakaryozyten und Erythrozyten, während GSP Granulozyten und Monozyten hervorrufen. Zusätzlich zu den Durchgängen durch CMPs, Megakaryozyten wurden berichtet, dass auch direkt aus HSCs oder frühen MPPs über nicht-kanonische Wege5,6.
Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) zeichnen sich durch den Oberflächenmarker CD34 und das Fehlen von linienspezifischen Markern (Lin–) aus. Andere Oberflächenmarker, die häufig zur Unterscheidung von HSCs und myeloiden Vorläuferpopulationen verwendet werden, sind CD38, CD45RA und CD1232 (Abbildung 1). HSCs und MPPs sind Lin–/CD34+/CD38– und Lin–/CD34+/CD38+, bzw. Myeloide engagierte Vorläuferpopulationen zeichnen sich durch das Vorhandensein oder Fehlen von CD45RA und CD123 aus. CMPs sind Lin–/CD34+/CD38+/CD45RA–/CD123lo, GMPs sind Lin–/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, und MePs sind Lin–/CD34+ /CD38+/CD45RA–/CD123–.
Die Gesamtpopulation von CD34+ Stamm- und Vorläuferzellen kann aus menschlichem Nabelschnurblut (UCB), Knochenmark und peripherem Blut gewonnen werden. CD34+ Zellen machen 0,02 % bis 1,46 % der gesamten mononukleären Zellen (MNCs) im menschlichen UCB aus, während ihr Anteil zwischen 0,5 % und 5,3 % im Knochenmark schwankt und im peripherenBlutmit 0,01 % viel niedriger ist 7,8,9 . Die proliferative Kapazität und das Differenzierungspotenzial von UCB-abgeleiteten CD34+ Zellen ist signifikant höher als die der Knochenmark- oder peripheren Blutkörperchen1,10, wodurch ein deutlicher Vorteil für die ausreichendes Material für molekulare Analysen in Kombination mit der durchführung immunophenotypic und morphologischen Charakterisierung der Zellen während der Differenzierung.
Ex-vivo-Differenzierung von Nabelschnurblut abgeleitet CD34+ HSPCs ist ein weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der normalen Hämatopoese und hämatopoetischen Krankheit Mechanismen. Bei Kultur mit den entsprechenden Zytokinen können die UCB CD34+ HSPCs induziert werden, um entlang der myeloischen oder lymphoiden Linien11,12,13,14,15 zu unterscheiden , 16. Hier beschreiben wir Protokolle zur Isolierung und immunphänotypischen Charakterisierung der CD34+ HSPCs aus humanem UCB und für deren Differenzierung zu myeloischen Abstammungszellen. Dieses Kultursystem basiert auf der zytokininduzierten Differenzierung von HSPCs in Gegenwart von MS-5-Stromalzellen, um die Mikroumgebung im Knochenmark nachzuahmen. Die Kulturbedingungen führen zu einer anfänglichen Ausdehnung der CD34+ Zellen, gefolgt von deren Differenzierung zu Zellen, die Marker für die vier myeloischen Abstammungszellen ausdrücken, nämlich Granulozyten (CD66b), Monozyten (CD14), Megakaryozyten (CD41) und Erythrozyten (CD235a). Anwendungen des CD34+ Zelldifferenzierungsprotokolls umfassen Studien über molekulare Mechanismen zur Regulierung der Hämatopoese und Untersuchungen der Auswirkungen von myeloiden Krankheitsmutationen und kleinen Molekülen auf die Selbsterneuerung und Differenzierung von HSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll eignet sich zur ex vivo-Differenzierung von UCB-abgeleiteten CD34+ HSPCs zu den vier myeloischen Linien. Die anfängliche Inkubation mit einem Zytokin-Mix bestehend aus SCF, TPO, Flt3L und IL3 stimuliert die CD34+ Zellen. Anschließend wird die Differenzierung mit einem Cocktail aus SCF, IL3, Flt3L, EPO und TPO erreicht. In diesem Mix sind SCF, IL3 und Flt3L wichtig für das Überleben und die Proliferation von CD34+ HSCs. EPO und TPO fördern die Differenz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Wendy Barrett, Rachel Caballero und Gabriella Ruiz von Maricopa Integrated Health Systems für die entidentifizierten und gespendeten Nabelschnurbluteinheiten, Mrinalini Kala für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie und Gay Crooks und Christopher Seet für Beratung zur ex-vivo-Myeloiddifferenzierung. Diese Arbeit wurde durch Mittel unterstützt, die S.S. von den National Institutes of Health (R21CA170786 und R01GM127464) und der American Cancer Society (Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) erhielten. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
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