Pan-myeloïde differentiatie van menselijk snoer bloed afgeleid CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor immunophenotypic karakterisering en cytokine geïnduceerde differentiatie van snoer bloed afgeleide CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen tot de vier myeloïde lijn. De toepassingen van dit protocol omvatten onderzoeken naar het effect van myeloïde ziekte mutaties of kleine moleculen op myeloïde differentiatie van de CD34+ cellen.
Abstract
Ex vivo differentiatie van menselijke hematopoietische stamcellen is een veel gebruikt model voor het bestuderen van hematopoiese. Het protocol dat hier wordt beschreven, is voor cytokine geïnduceerde differentiatie van CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen tot de vier myeloïde Lineage cellen. CD34+ cellen zijn geïsoleerd van humaan navelstreng bloed en co-gekweekt met MS-5 stromale cellen in de aanwezigheid van cytokines. Immunophenotypische karakterisering van de stam-en voorlopercellen, en de gedifferentieerde myeloïde Lineage cellen worden beschreven. Met behulp van dit protocol, kunnen CD34+ cellen worden geïnineerd met kleine moleculen of met lentivirussen worden weergegeven om myeloïde mutaties uit te drukken om hun impact op myeloïde differentiatie te onderzoeken.
Introduction
Normale differentiatie van hematopoietische stamcellen (HSCs) is van cruciaal belang voor het behoud van fysiologische niveaus van alle bloedcellen. Tijdens de differentiatie, in een gecoördineerde reactie op extracellulaire signalen, waaronder groeifactoren en cytokines, geven hscs eerst aanleiding tot multipotente voorlopercellen (MPP) die LYMPHO-myeloïde potentiaal hebben1,2,3 ,4 (Figuur 1). Mpp’s geven aanleiding tot gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMPs) en gemeenschappelijke lymfoïde voorlopercellen (Clp’s) die afstamming-beperkt zijn. CLPs differentiëren in de lymfoïde lijn afstanden die bestaan uit B, T en Natural killer cellen. CMPs genereren de myeloïde lijn door twee beperktere voorlopercellen, Megakaryocyt erytroïde voorlopercellen (EP-leden) en granulocyt monocyt-voor ouders (GMPs). Europarlementsleden geven aanleiding tot megakaryocyten en erytrocyten, terwijl Gmp’s aanleiding geven tot granulocyten en monoytes. Naast het ontstaan via CMPS, zijn er ook megakaryocyten gemeld om zich rechtstreeks te voordoen bij hscs of vroege mpp’s via niet-canonieke trajecten5,6.
Hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc’s) worden gekenmerkt door de oppervlakte marker CD34 en het ontbreken van Lineage specifieke markers (Lin–). Andere oppervlakte markeringen die vaak worden gebruikt om HSCs-en myeloïde voorlopercellen te onderscheiden, zijn onder andere CD38, CD45RA en CD1232 (Figuur 1). HSCs en MPPs zijn respectievelijk Lin–/Cd34+/cd38– en Lin–/cd34+/cd38+. Myeloïde gepleegde voorlopercellen worden gekenmerkt door de aanwezigheid of afwezigheid van CD45RA en CD123. CMPS zijn Lin–/cd34+/cd38+/cd45ra–/cd123lo, gmps zijn Lin–/cd34+/cd38+/cd45ra+/cd123lo, en Europarlementsleden zijn Lin–/cd34+ /Cd38+/Cd45ra–/cd123–.
De totale populatie van CD34+ stam-en voorlopercellen kan worden verkregen uit humaan navelstreng bloed (UCB), beenmerg en perifeer bloed. CD34+ cellen vormen 0,02% tot 1,46% van de totale mononucleaire cellen (mnc’s) in menselijke UCB, terwijl hun percentage tussen 0,5% en 5,3% in het beenmerg varieert en veel lager is bij ~ 0,01% in perifeer bloed7,8,9 . Het proliferatieve vermogen en het differentiatie potentieel van CD34+ cellen van UCB is significant hoger dan die van het beenmerg of perifere bloedcellen1,10, waardoor een duidelijk voordeel wordt verkregen voor het verkrijgen van voldoende materiaal voor moleculaire analysen in combinatie met het uitvoeren van immunophenotypische en morfologische karakterisering van de cellen tijdens differentiatie.
Ex vivo differentiatie van navelstreng bloed afgeleid CD34+ hspcs is een breed toegepast model voor het onderzoeken van normale hematopoiese en hematopoietische ziekte mechanismen. Wanneer gekweekt met de juiste cytokines, kunnen de UCB CD34+ hspc’s worden geïnduceerd om te differentiëren langs de myeloïde of lymfoïde lijn11,12,13,14,15 , 16. hier beschrijven we protocollen voor isolatie en immunophenotypische karakterisering van de CD34+ hspc’s van menselijke UCB, en voor hun differentiatie aan myeloïde Lineage cellen. Dit cultuur systeem is gebaseerd op cytokine-geïnduceerde differentiatie van Hspc’s in de aanwezigheid van MS-5 stromale cellen om de micro-omgeving in beenmerg na te bootsen. De cultuuromstandigheden veroorzaken een initiële expansie van de CD34+ cellen, gevolgd door hun differentiatie naar cellen die de markers voor de vier myeloïde Lineage cellen uitdrukken, namelijk granulocyten (CD66b), MONOCYTEN (CD14), megakaryocyten (CD41), en erytrocyten (CD235a). Toepassingen van de CD34+ Cell differentiatie protocol omvatten studies over moleculaire mechanismen reguleren van hematopoiese, en onderzoeken van de gevolgen van de myeloïde ziekte geassocieerde mutaties en kleine moleculen op zelf vernieuwing en differentiatie van Hspc’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol is geschikt voor ex-vivo-differentiatie van UCB afgeleide CD34+ hspc’s tot de vier myeloïde lijn afstanden. De initiële incubatie met een cytokine mix bestaande uit SCF, TPO, Flt3L en IL3 stimuleert de CD34+ cellen. Vervolgens wordt differentiatie gerealiseerd met een cocktail van SCF, IL3, Flt3L, EPO en TPO. In deze mix zijn SCF, IL3 en Flt3L belangrijk voor overleving en proliferatie van CD34+ hscs. EPO en TPO bevorderen differentiatie ten opzichte van ery…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Wendy Barrett, Rachel Caballero en Gabriella Ruiz van Maricopa Integrated Health Systems voor de geïdentificeerde en gedoneerde koord bloed eenheden, Mrinalini Kala voor hulp met Flow cytometrie, en homoseksuele boeven en Christopher Seet voor advies over ex vivo myeloïde differentiatie. Dit werk werd gesteund door fondsen aan S.S. van de National Institutes of Health (R21CA170786 en R01GM127464) en de American Cancer Society (het institutioneel onderzoek Grant 74-001-34-IRG). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
- Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
- Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
- Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
- Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
- Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
- Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
- Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
- Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
- Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
- Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
- Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
- Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
- Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
- Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
- Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
- Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).
- Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).
