Pan-النخاع التمايز من الدم الحبل البشري المستمدة CD34+ الجذعية المكونة للدم وخلايا السلف
Summary
هنا، نقدم بروتوكول توصيف الفينومينتيك والسيتوكين الناجم عن التمايز من دم الحبل السري المستمدة CD34+ الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف إلى السلالات النقويالأربعة. وتشمل تطبيقات هذا البروتوكول التحقيقات على تأثير طفرات مرض النخاع أو جزيئات صغيرة على تمايز النخاع من CD34+ الخلايا.
Abstract
التمايز السابق للخلايا الجذعية المكونة للدم هو نموذج يستخدم على نطاق واسع لدراسة الهيماتوبويز. البروتوكول الموصوف هنا هو للتفرقة الناجمة عن السيتوكين من CD34+ الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف إلى الخلايا السلالية النخاعية الأربعة. يتم عزل CD34+ الخلايا من دم الحبل السري البشري ومشتركة مع الخلايا سترومال MS-5 في وجود السيتوكينات. يتم وصف التوصيف المناعي للخلايا الجذعية والسلف، وخلايا النسب النخاعية المتمايزة. باستخدام هذا البروتوكول، CD34+ الخلايا قد تكون حاضنة مع جزيئات صغيرة أو تنتقل مع الفيروسات اللينة للتعبير عن طفرات مرض النخاع للتحقيق في تأثيرها على تمايز النخاع.
Introduction
التمايز الطبيعي للخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) أمر بالغ الأهمية للحفاظ على المستويات الفسيولوجية لجميع سلالات خلايا الدم. خلال التمايز، في استجابة منسقة للإشارات خارج الخلية بما في ذلك عوامل النمو والسيتوكينات، HSCs تؤدي أولا إلى خلاياذرية متعددة القوى (MPP) التي لديها إمكانية اللمفاوية النخاعية 1،2،3 ،4 (الشكل1). وتنشأ عن هذه التسميات سلالات النخاعية الشائعة (CMPs) والذرية اللمفاوية الشائعة (CLPs) المقيدة النسب. تُميّز CLPs في السلالات اللمفاوية المكونة من B وT والخلايا القاتلة الطبيعية. وتولد الـ CMPs سلالات النخاع من خلال اثنين من السكان السلف الأكثر تقييداً، وذرية الكريات الحمر ية الضخمة (MEPs)، وذرية الخلايا الأحادية الحبيبية (GMPs). وتنشأ عن هذه الـ MEPs خلايا عملاقة وكريات الدم الحمراء، في حين أن هذه الخلايا تؤدي إلى ظهور المحببات والخلايا الأحادية. بالإضافة إلى أن تنشأ من خلال CMPs، وقد أفيد أن الخلايا الضخمة تنشأ أيضا مباشرة من HSCs أو MPPs في وقت مبكر عن طريق مسارات غير الكنسية5،6.
تتميز الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف (HSPCs) بعلامة السطح CD34 وعدم وجود علامات محددة النسب (لين–). وتشمل العلامات السطحية الأخرى التي تستخدم عادة للتمييز بين HSCs وتجمعات ذرية النخاع CD38 وCD45RA وCD1232 (الشكل1). HSCs وMPPs هي لين–/ CD34+/ CD38– ولين–/CD34+/CD38+، على التوالي. تتميز مجموعات الذرية الملتزمة النخاعية بوجود أو غياب CD45RA وCD123. CMPs هي لين–/ CD34+/ CD38+/ CD45RA–/CD123لو،GMPs هي لين–/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123لو، وأعضاء البرلمان من البمعة لين–/CD34 ++ /CD38+/CD45RA–/CD123–.
يمكن الحصول على إجمالي عدد السكان من CD34+ الخلايا الجذعية والسلف من دم الحبل السري البشري (UCB)، نخاع العظام، والدم المحيطي. CD34+ الخلايا تشكل 0.02٪ إلى 1.46٪ من مجموع الخلايا أحادية النووية (MNCs) في UCB الإنسان، في حين أن نسبتهم تتراوح بين 0.5٪ و 5.3٪ في نخاع العظام وأقل بكثير في ~ 0.01٪ في الدم المحيطي7،8،9 . القدرة التكاثرية وإمكانات التمايز من UCB المستمدة CD34+ الخلايا هي أعلى بكثير من نخاع العظام أو خلايا الدم الطرفية1،10، مما يوفر ميزة متميزة للحصول على مادة كافية للتحليلات الجزيئية في تركيبة مع أداء توصيف المناعية والمورفولوجية للخلايا أثناء التمايز.
التمايز السابق للدم السري المستمد من دم الحبل السري CD34+ HSPCs هو نموذج تطبيقي على نطاق واسع للتحقيق في حالات الدم الطبيعية وآليات أمراض الدم. عندما يتم استزراعها مع السيتوكينات المناسبة، يمكن حث UCB CD34+ HSPCs على التمييز على طول السلالات النخاعية أو اللمفاوية11،12،13،14،15 , 16.هنا، ونحن نصف بروتوكولات للعزل وتوصيف المناعية من CD34+ HSPCs من UCB الإنسان، وللتمايز إلى خلايا النسب النخاعي. ويستند هذا النظام الثقافي على التمايز الناجم عن السيتوكين من HSPCs في وجود الخلايا سترومال MS-5 لتقليد البيئة الدقيقة في نخاع العظام. تتسبب ظروف الثقافة في توسع أولي في الخلايا CD34+ ، يليها تمايزها إلى الخلايا التي تعبر عن علامات لخلايا النسب النخاعية الأربعة ، وهي الخلايا الحبيبية (CD66b) ، والخلايا الأحادية (CD14) ، والخلايا الضخمة (CD41) ، و كريات الدم الحمراء (CD235a). وتشمل تطبيقات بروتوكول تمايز الخلايا CD34+ دراسات عن الآليات الجزيئية التي تنظم داء الهيماتوبوي، والتحقيقات في تأثير الطفرات المرتبطة بمرض النخاع والجزيئات الصغيرة على التجديد الذاتي و تمايز HSPCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموضح هنا مناسب للتمايز في الجسم الحي السابق من UCB المستمدة CD34+ HSPCs إلى السلالات النخاعية الأربعة. الحضانة الأولية مع مزيج السيتوكين تتكون من SCF، TPO، Flt3L وIL3 يحفز CD34+ الخلايا. في وقت لاحق، يتم تحقيق التمايز مع كوكتيل من SCF، IL3، Flt3L، EPO، وTPO. في هذا المزيج، SCF، IL3، وFlt3L مهمة ل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا ويندي باريت، وراشيل كاباييرو، وغابرييلا رويز من ماريكوبا للأنظمة الصحية المتكاملة على وحدات دم الحبل السري التي تم تحديدها والتبرع بها، ومريناليني كالا للمساعدة في قياس التدفق، وغاي كروكس وكريستوفر ريت من أجل المشورة بشأن التمايز النخاعي السابق. وقد تم دعم هذا العمل بأموال إلى S.S. من المعاهد الوطنية للصحة (R21CA170786 و R01GM127464) والجمعية الأمريكية للسرطان (منحة البحوث المؤسسية 74-001-34-IRG). والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
- Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
- Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
- Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
- Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
- Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
- Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
- Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
- Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
- Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
- Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
- Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
- Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
- Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
- Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
- Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
- Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, 383-390 (2000).
- Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).
