In vitro Generation fare kalp alanı-spesifik kardiyak progenitor hücreler
Summary
Bu yöntemin amacı, progenitör hücre spesifikasyonu ve fonksiyonel özelliklerini incelemek ve kalp hastalığı modelleme için oda spesifik kardiyak hücreler oluşturmak için, in vitro kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücreleri oluşturmadır.
Abstract
Pluripotent kök hücreleri kalp gelişimi ve hastalık ve rejeneratif tıp anlamak için büyük bir potansiyel sunuyor. Gelişimsel kardiyolojideki son gelişmeler, pluripotent kök hücrelerinden kardiyak hücreler üretmeye yol açtı, Eğer iki kardiyak alan-ilk ve ikinci kalp alanları (FHF ve SHF) — pluripotent kök hücreler sistemlerinde indüklenir. Bunu ele almak için, In vitro spesifikasyon ve kalp alanına özgü kardiyak progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir protokol oluşturacağız. Hcn4-GFP ve Tbx1-CRE taşıyan embriyonik kök hücre hatları kullandık; FHF ve SHF ‘nin Rosa-RFP gazetecileri, sırasıyla ve hücre membranı protein Cxcr4, bir SHF Marker canlı hücre immün boyama. Bu yaklaşım ile, biz fonksiyonel özellikleri ve onların in vivo karşı transkriptom özetlemek progenitör hücreler oluşturuldu. Protokollerimiz, iki kalp alanlarının erken spesifikasyonları ve ayrım çalışması için ve kalp hastalığı modelleme için odasına özgü kardiyak hücreler oluşturmak için kullanılabilir. Bu bir in vitro nevuslardır sistemi olduğundan, hassas anatomik bilgiler sağlayamayabilir. Ancak, bu sistem gastrülasyon-aşama embriyoları kötü erişilebilirlik üstesinden gelir ve yüksek verim ekranlar için ölçeklendirilebilir.
Introduction
Pluripotent kök hücrelerinin kullanımı (PSC ‘ler) kardiyak rejenerasyon ve kişisel tıp alanında hastalık modelleme ve ilaç terapileri için hasta spesifik miyositlerle devrim yarattı1,2,3, 4. daha yakın zamanda, atriyal vs ventriküler üretimi için in vitro protokoller ve pacemaker gibi PSC türevi kardiyomiyositler geliştirilmiştir5,6. Bununla birlikte, kardiyogenezinin kardiyak gelişimi incelemek ve daha sonra ventriküler odasına özgü kardiyak hücreler oluşturmak için yeniden oluşturulabilir olup olmadığı hala belirsiz.
Erken embriyonik gelişim sırasında, BMP4 gibi salgılanmış morfojenlerin etkisi altında Mezodermal hücreler, Wnts ve Activin A form ilkel çizgi7. Mesp1 ifadesi ile işaretlenmiş kardiyak Mezodermal hücreler, kalp hilal ve sonra ilkel kalp tüpü7,8oluşturmak için anteriora ve latterly göç. Bu göç grubu hücre kalp progenitör hücrelerin iki çok farklı nüfus içerir (TBM), yani ilk ve ikinci kalp alanı (FHF ve SHF)9,10. SHF hücreleri yüksek proliferatif ve göç ve öncelikle uzama ve kalp tüpü döngü sorumludur. Ayrıca, SHF hücreleri kardiyomiyositler ayırt, fibroblastlar, düz kas ve endotel hücreler onlar sağ ventrikül oluşturmak için kalp tüpü girerken, sağ ventriküler çıkış yolu ve hem Atria büyük parçası7,10. Buna karşılık, FHF hücreleri daha az proliferatif ve göç ve onlar sol ventrikül ve Atria11daha küçük bir kısmı yükselmesine gibi kardiyomiyositler çoğunlukla ayırt. Ayrıca, SHF ataları Tbx1, FGF8, FGF10 ve Six2 ifadesiyle işaretlenmiş iken FHF hücreleri Express Hcn4 ve Tbx511, 12,13,14,15.
PSC ‘ler üç germ katmanını ve daha sonra vücudun4,16‘ daki herhangi bir hücre tipine ayırt edebilir. Bu nedenle, kalp gelişimini anlamak ve konjenital kalp hastalığı ile sonuçlanan spesifik gelişimsel kusurları modelleme için muazzam bir potansiyel sunuyoruz, Doğum kusurlarının en sık nedeni17. Konjenital kalp hastalığının büyük bir alt grubu, Odaya özgü kardiyak anormallikleri içerir18,19. Ancak, hala bu anormalli kalp alanı gelişimi kaynaklanan olup olmadığını belirsiz. Buna ek olarak, kardiyomiyositlerin doğumdan sonra proliferasyon yetersizlik göz önüne alındığında, kalp rejenerasyonu için kardiyak doku oluşturmak için geniş çaba olmuştur1,7,20. Kardiyak Odalar arasındaki fizyolojik ve morfolojik farklılıkları göz önünde bulundurarak, PSC ‘leri kullanarak odaya özgü kalp dokusu üretme önemli bir öneme sahiptir. Gelişimsel kardiyolojideki son gelişmeler, PSC ‘lerde iki kalp alanlarının indüklenmiş olması durumunda, hala belirsizdir.
İn vitro kardiyogenezi ve TBM ‘lerin spesifikasyonunu ve özelliklerini incelemek için, daha önce PSC ‘den türeyen kardiyak küre21,22,23,24farklılaşmasına dayanan bir sistem kullandık. Son zamanlarda, FHF geni Hcn4 ve SHF geni Tbx1 kontrolü altında GFP ve RFP muhabirleri ile fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) ürettik (mESCsTbx1-CRE; Rosa-RFP; HCN4-GFP) 25. In vitro farklılaşmış mescs, Gfp + ve RFP + hücrelerinin iki farklı mezodermal hücre alanlarından ortaya çıktığı ve tamamlayıcı bir şekilde desenli kardiyak kürler oluşturdu. Elde edilen GFP + ve RFP + hücreleri, sırasıyla RNA sıralaması ve klonal analizler ile belirlenen FHF ve SHF özelliklerini sergiledi. Önemlisi, Isl1-RFP muhabiri (mESCIsl1-RFP) taşıyan mescs kullanarak, BIZ SHF hücrelerinin sadakatle hücre yüzeyı protein CXCR4 tarafından işaretlenmiş olduğunu keşfetti ve bu transgenes olmadan kalp alanına özgü hücrelerin yalıtım etkinleştirebilirsiniz. Mevcut protokol, odağa özel kalp hastalığının incelenmesi için değerli bir araç olarak hizmet veren mESCs ‘den kalp alanına özgü TBM ‘lerin oluşumunu ve yalıtımını tarif edecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolimizde, kalp kürleri ve izole kalp alanına özgü TBM ‘Ler oluşturmak için bir metodoloji tarif ediyoruz. Bunlar, TBM spesifikasyonlarının mekanizmaları ve özelliklerinin yanı sıra kardiyak odasına özel hastalık modelleme için de kullanılabilir. Daha önce yayınlanmış bir çalışma, iki floresan muhabiriyle (Mef2c/nkx 2.5) bir mESC hattı kullanmış ve kardiyogenezi in vitro olarak incelemek için, her iki işaretçinin de kardiyomiyositler zaten26meydana geldiğinde em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. T. Magic this Matters ve AHA tarafından desteklenmektedir. C. K. NICHD/NıH (R01HD086026), AHA ve MSCRF tarafından hibe tarafından destekleniyordu.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors–a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
