マウス心臓分野特異的心臓前駆細胞のインビトロ生成

多能性幹細胞(PSC)の使用は、疾患モデリングおよび薬物療法のための患者特異的筋細胞を用いた心臓再生および個別化医療の分野^に革命を起こした1,²,^3,4.さらに最近では、心房対心室およびペースメーカー様PSC由来心筋細胞の生成のためのインビトロプロトコルが5、6^に開発されている。しかし、心臓の発達を研究し、その後心室特異的な心臓細胞を生成するために、心形成をインビトロで再現できるかどうかは、まだ不明である。

初期胚発生の間、BMP4、WntsおよびアクティビンAなどの分泌された形態素の影響下にある中皮細胞は原始的な筋7を形成する。Mesp1の発現によってマークされた心臓中皮細胞は、心三日月を形成し、次いで原始的な心臓管7、8を形成するために前部および後者に移行する。この細胞の移動群は、心臓前駆細胞(CPC)の2つの非常に異なる集団、すなわち第1および第2の心臓場(FHFおよびSHF)9、10を含む。SHFからの細胞は非常に増殖性と移動性であり、主に心臓管の伸びとループを担当しています。さらに、SHF細胞は心筋細胞、線維芽細胞、平滑筋および内皮細胞に分化し、心臓管に入り、右心室、右心室流出路および両方の心房7、10の大部分を形成する。対照的に、FHF細胞は、左心室および心^房11の小さな部分を生み出すので、主に心筋細胞に分化する増殖性および移動性が低い。さらに、SHF前駆体は、THF細胞がHcn4およびTbx511、12、13、14、15を発現する間、Tbx1、FGF8、FGF10およびSix2の発現によって特徴付けされる。

PSCは、すべての3つの胚芽層に分化し、その後、体内の任意の細胞タイプ4、16に分化することができます。したがって、それらは、心臓の発達を理解し、先天性心疾患をもたらす特定の発達欠陥をモデル化するための大きな可能性を提供し、出生時欠損の最も頻繁な原因17。先天性心疾患の大きなサブグループは、チャンバー特異的な心臓異常18,19を含む。しかし、これらは異常な心臓分野の発達に起因するかどうかは依然として不明である。さらに、出生後に増殖する心筋細胞の能力を考えると、心臓再生1、7、20のための心臓組織を作成するための広範な努力があった。心臓室間の生理的および形態学的な違いを考慮すると、PSCを用いたチャンバー特異的心臓組織の生成は非常に重要である。発達心理学の最近の進歩はPSCからの心臓細胞の堅牢な生成につながったが、2つの心臓界がPSCシステムで誘導できるかどうかはまだ不明である。

体外での心生発生を要約し、CPCの仕様と特性を研究するために、以前にPSC由来心臓スフェロイド21、22、23、24の分化に基づくシステムを使用した。最近では、FHF遺伝子Hcn4とSHF遺伝子Tbx1の制御下でGFPおよびRFPレポーターを用いてマウス胚性幹細胞(MESC)をそれぞれ生成した(mESC^{Tbx1-Cre;ローザ RFP;HCN4-GFP}) ²⁵.インビトロ分化MESCは、GFP+およびRFP+細胞が中皮細胞の2つの異なる領域から出現し、相補的な方法でパターン化された心臓スフェロイドを形成した。得られたGFP+およびRFP+細胞は、それぞれRNAシーケンシングおよびクローン解析によって決定されたFHFおよびSHF特性を示した。重要なことに、Isl1-RFPレポーター(mESC^Isl1-RFP)を搭載したMESCを用いて、SHF細胞が細胞表面タンパク質CXCR4によって忠実にマークされ、トランスジーンのない心臓場特異的細胞の単離を可能にすることが分かりました。本プロトコルは、室内特異的な心臓病を研究するための貴重なツールとして役立つ可能性のあるMESCからの心臓場特異的CPCの生成と単離について説明する。