בדור מחוץ לתחום של לב העכבר שדה מסוים בתאי לב
Summary
מטרת שיטה זו היא לייצר תאים ספציפיים לשדה הלב בחלל החוץ בתוך מבחנה כדי ללמוד את המפרט תא מחולל ותכונות פונקציונלי, וליצור תאי לב מסוימים בחדר לדגמי מחלות לב.
Abstract
תאי גזע פלאוריטי מציעים פוטנציאל רב להבנת התפתחות לב ומחלות ולרפואה רגנרטיבית. בעוד ההתקדמות האחרונה בקרדיולוגיה התפתחותית הובילו לייצר תאים לב מתאי גזע פלאוריטי, זה לא ברור אם שני שדות הלב-הראשון והשני שדות הלב (FHF ו SHF)-הם המושרה במערכות מערכות גזע רב עוצמה pluripotent ובידוד של תאים. ספציפיים לשדה-הלב השתמשנו בתאי גזע עובריים הנושאים Hcn4-GFP ו Tbx1-היצורים; רוזה-RFP כתבים של FHF ואת SHF, בהתאמה, ואת החיסוני לחיות התאים של הקרום התא חלבון Cxcr4, סימן SHF. עם גישה זו, יצרנו תאים מחולל קדמון אשר לכידה של המאפיינים הפונקציונליים ואת ההמרה של שלהם vivo עמיתיהם. הפרוטוקול שלנו יכול להיות מנוצל כדי ללמוד מוקדם מפרט והפרדה של שני שדות הלב וליצור תאי לב ספציפיים לחדר לדגמי מחלות לב. מאחר שזוהי מערכת ארגונית מחוץ למערכת, ייתכן שהיא אינה מספקת מידע אנטומי מדויק. עם זאת, מערכת זו גוברת על הנגישות הירודה של עוברי הבמה והוא יכול להיות מוקטן עבור מסכי תפוקה גבוהה.
Introduction
השימוש בתאי גזע פלאוריטי (PSCs) יש מהפכה בתחום התחדשות הלב ורפואה אישית עם מיציטים ספציפיים לחולה עבור מידול מחלות וטיפולים בסמים1,2,3, 4. לאחרונה, בפרוטוקולי חוץ גופית עבור דור של פרפור לעומת המוח, כמו גם קוצב לב PSC-הקרדיוציטים הנגזר פותחו5,6. עם זאת, אם cardiogenesis ניתן ליצור מחדש בתחום החוץ כדי ללמוד את התפתחות הלב ולאחר מכן ליצור החדרית תאי הלב ספציפיים לחדר עדיין לא ברור.
במהלך ההתפתחות העובריים המוקדמת, התאים המזושים תחת השפעת מורגנים מופרשים כגון BMP4, Wnts ופעילות בצורה פרימיטיבית7. תאים מזופנים לב מסומנים על-ידי הביטוי של Mesp1, להעביר למטה ולמטה ליצור את הסהר הקרדיולוגית ולאחר מכן את צינור הלב הפרימיטיבי7,8. זו קבוצת הנדידה של תאים כולל שתי אוכלוסיות נפרדות מאוד של תאים מחולל לב (cpcs), כלומר הראשון ואת שדה הלב השני (fhf ו shf)9,10. תאים מן SHF הם מתרבים מאוד נדידה והם אחראים בעיקר התארכות ולולאה של צינור הלב. בנוסף, תאים shf להבדיל הקרדיוציטים, פיברותקיעות, שריר החלקה ותאים אנדותל כפי שהם נכנסים לצינור הלב כדי ליצור את החדר הימני, מערכת הכניסה הבין-חדרית הימנית ואת החלק הגדול של שתי האטריה7,10. לעומת זאת, תאים fhf הם מתרבים פחות הנדידה ולהבדיל בעיקר הקרדיוציטים כפי שהם מעניקים לחדר שמאל וחלק קטן יותר של אטריה11. יתר על כן, shf ושלתי מסומנים על ידי הביטוי של Tbx1, FGF8, FGF10 וSix2 בעוד fhf תאים express Hcn4 ו Tbx511,12,13,14,15.
PSCs יכול להבדיל לכל שלוש שכבות הנבט ולאחר מכן כל סוג תא בגוף4,16. לכן, הם מציעים פוטנציאל עצום להבנת התפתחות הלב ולמידול פגמים התפתחותיים ספציפיים כתוצאה ממחלת לב מולדים, הגורם השכיח ביותר למומים מולדים17. תת קבוצה גדולה של מחלת לב מולדים כולל ליקויים בתאי הלב הספציפיים18,19. עם זאת, עדיין לא ברור אם אלה מקורם בפיתוח שדה לב חריג. בנוסף, בהינתן חוסר היכולת של הקרדיוציטים להתרבות לאחר הלידה, היו מאמצים נרחבים ליצור רקמת לב להתחדשות הלב1,7,20. בהתחשב ההבדלים הפיסיולוגיים ומורפולוגיים בין תאי לב, הדור של רקמת הלב ספציפי לחדר באמצעות PSCs הוא בעל חשיבות משמעותית. בעוד ההתקדמות האחרונה בקרדיולוגיה התפתחותית הובילו לדור חזק של תאי לב מ PSCs, זה עדיין ברור אם שני שדות הלב יכול להיות המושרה במערכות PSC.
כדי לcardiogenesis את המפרט והמאפיינים של cpcs, השתמשנו בעבר מערכת מבוססת על ההבחנה PSC-נגזרות לב הנגזרים21,22,23,24. לאחרונה, שיצרנו תאים גזע מעובריים של העכבר (mESCs) עם כתבים GFP ו-RFP תחת שליטה של FHF gene Hcn4 ואת הגן SHF Tbx1, בהתאמה (mESCsTbx1-יצור; . רוזה-ראFP HCN4-GFP) 25. ב מתורבת הבדיל mESCs יצר spheroids לב שבו GFP + ו RFP התאים הופיעו משני אזורים ברורים של תאים מזועורי ומתבנית באופן משלים. התאים המתקבלים GFP + ו RFP + הציגו FHF ו SHF מאפיינים, בהתאמה, נקבע על-ידי רצפי RNA וניתוחים שבטיים. חשוב מכך, באמצעות mESCs נושאים את הכתב Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP), גילינו כי תאים shf היו מסומנים בנאמנות על ידי חלבון פני השטח התאים CXCR4, וזה יכול לאפשר בידוד של תאים ספציפיים לשדה הלב ללא טרנסגנים. הפרוטוקול הנוכחי יתאר את הדור והבידוד של CPCs לשדה הלב ספציפיים מ mESCs, אשר עשוי לשמש כלי רב ערך ללימוד מחלת לב מסוימת לחדר.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול שלנו, אנו מתארים מתודולוגיה ליצירת מידרואידים קרדיולוגית ומבודדים בשדה הלב הייחודיים של ה-CPCs. ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מנגנונים של מפרט CPC ותכונותיהם, כמו גם לדגמי מחלות ספציפיות לתאי לב. אחת העבודות שפורסמו בעבר השתמשו בשורה mESC עם שני כתבים פלורסנט (Mef2c/Nkx 2.5) כדי ללמוד cardiogenesis בת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
א. ט. נתמך על ידי הקסם החשוב ו-AHA. ג. ק. הייתה נתמכת על ידי מענקים מ-R01HD086026/NIH, AHA ו-MSCRF.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors–a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
