في المختبر جيل من خلايا القلب القلب حقل محدد
Summary
الغرض من هذه الطريقة هو توليد القلب حقل محدد خلايا القلب السلف في المختبر من أجل دراسة مواصفات الخلية السلف والخصائص الوظيفية، وتوليد خلايا القلب غرفة محددة لنمذجة أمراض القلب.
Abstract
الخلايا الجذعية متعددة القدرات توفر إمكانات كبيرة لفهم نمو القلب والمرض والطب التجديدي. في حين أن التقدم الأخير في أمراض القلب التنموية قد أدى إلى توليد خلايا القلب من الخلايا الجذعية متعددة القدرات، فإنه من غير الواضح ما إذا كان حقلي القلب – الأول والثاني من مجالي القلب (FHF وSHF) – مستحثة في أنظمة الخلايا الجذعية متعددة القدرات. لمعالجة هذا، وضعنا بروتوكولا للمواصفات في المختبر وعزل القلب حقل محدد خلايا القلب السلف. استخدمنا خطوط الخلايا الجذعية الجنينية تحمل HCN4-GFP وTbx1-Cre; [روسا-رفب] مراسلات من ال [فهف] وال [سهف], على التّوالي, وحيّة خلية [إيمّونّينغ] من الخلية غشاء بروتين [إكسككر4], [شف] علامة. مع هذا النهج، قمنا بإنشاء خلايا السلف التي تلخص الخصائص الوظيفية والنسخ من نظرائهم في الجسم الحي. يمكن استخدام بروتوكولنا لدراسة المواصفات المبكرة والفصل في مجالي القلب وتوليد خلايا القلب الخاصة بالحجرة لنمذجة أمراض القلب. وبما أن هذا النظام هو في المختبر، فإنه قد لا توفر معلومات تشريحية دقيقة. ومع ذلك، فإن هذا النظام يتغلب على ضعف إمكانية الوصول إلى الأجنة في مرحلة التقطير ويمكن رفعها للشاشات عالية الإنتاجية.
Introduction
وقد أحدث استخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) ثورة في مجال تجديد القلب والطب الشخصي مع الخلايا النخاعية الخاصة بالمريض لنمذجة الأمراض والعلاجات الدوائية1،2،3، 4.في الآونة الأخيرة, في المختبر وقد وضعت بروتوكولات لتوليد الأذيني مقابل البطين وكذلك منظم ضربات القلب مثل PSC-مشتقات خلايا القلب 5,6. ومع ذلك، ما إذا كان يمكن إعادة تكوين القلب في المختبر لدراسة نمو القلب وتوليد خلايا القلب الخاصة بغرفة البطين لا يزال غير واضح.
خلال النمو الجنيني المبكر، الخلايا الجلدية تحت تأثير مورفيوجينات مفرزة مثل BMP4، Wnts وActivin A شكل سلسلة البدائية7. خلايا القلب الأدمة التي تميزت بالتعبير عن Mesp1، تهاجر بشكل أمامي وأخير لتشكيل الهلال القلبي ثم أنبوب القلب البدائية7،8. هذه المجموعة المهاجرة من الخلايا تشمل اثنين من السكان متميزة جدا من خلايا السلف القلبية (CPCs)، وهما حقل القلب الأول والثاني (FHF وSHF)9،10. الخلايا من SHF هي تكاثرية للغاية والهجرة وهي مسؤولة في المقام الأول عن اطالة وحلقة من أنبوب القلب. بالإضافة إلى ذلك، خلايا SHF تفرق لخلايا القلب والخلايا الليفية والعضلات الملساء والخلايا البطانية عند دخولها إلى أنبوب القلب لتشكيل البطين الأيمن، والقناة الهوائية اليمنى والجزء الأكبر من كلا الأذين7،10. وعلى النقيض من ذلك، خلايا FHF هي أقل تكاثرية والهجرة وتفرق أساسا لخلايا القلب كما أنها تؤدي إلى البطين الأيسر وجزء أصغر من الأذين11. وعلاوة على ذلك، تتميز السلف SHF من خلال التعبير عن Tbx1، FGF8، FGF10 و Six2 في حين أن الخلايا FHF التعبير عن HCN4 و Tbx511،12،13،14،15.
يمكن لـ PSCs التفريق بين الطبقات الجرثومية الثلاث وبالتالي إلى أي نوع من الخلايا في الجسم4و16 . ولذلك، فإنها توفر إمكانات هائلة لفهم نمو القلب ونمذجة عيوب نمو محددة تؤدي إلى أمراض القلب الخلقية، والسبب الأكثر شيوعا للعيوب الخلقية17. مجموعة كبيرة من أمراض القلب الخلقية تشمل تشوهات القلب الخاصة بغرفة18,19. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت هذه تنبع من تطور حقل القلب الشاذة. وبالإضافة إلى ذلك، نظرا لعدم قدرة خلايا القلب في الانتشار بعد الولادة، كانت هناك جهود واسعة النطاق لخلق أنسجة القلب لتجديد القلب1،7،20. وبالنظر إلى الاختلافات الفسيولوجية والمورفولوجية بين غرف القلب، فإن توليد أنسجة القلب الخاصة بالحجرات باستخدام مراكز الأمن العام أمر ذو أهمية كبيرة. في حين أن التقدم الأخير في أمراض القلب التنموية قد أدى إلى توليد قوي من خلايا القلب من مراكز الأمن العام، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كان يمكن أن يسبب هاتي في مجالي القلب في أنظمة PSC.
لتلخيص توليد القلب في المختبر ودراسة مواصفات وخصائص CPCs، استخدمنا سابقا نظام يستند إلى تمييز SPHeroids القلب المشتقة PSC21،22،23،24. في الآونة الأخيرة، قمنا بإنشاء الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (mESCs) مع GFP ومراسلي RFP تحت سيطرة الجين HCN4 FHF وجين SHF Tbx1، على التوالي (mESCsTbx1-Cre؛ روزا- طلب تقديم العروض؛ HCN4-GFP) 25. في المختبر mESCs متباينة شكلت كرويات القلب التي GFP + وخلايا RFP + ظهرت من منطقتين متميزتين من الخلايا الأدمية ومنقوشة بطريقة تكميلية. وأظهرت الخلايا الناتجة عن ذلك GFP+ وRFP+ خصائص FHF وSHF، على التوالي، التي تحددها التحليلات تسلسل الحمض النووي الريبي والتحليلات الكلونية. الأهم من ذلك، باستخدام mESCs تحمل مراسل Isl1-RFP (mESCIsl1-RFP)،اكتشفنا أن خلايا SHF تميزت بإخلاص من قبل بروتين سطح الخلية CXCR4، وهذا يمكن أن تمكن عزل خلايا القلب الميدانية الخاصة دون transgenes. وسيصف هذا البروتوكول توليد وعزل مراكز القلب الأساسية الخاصة بحقول القلب عن الشركات الصغيرة والمتوسطة الحجم، مما قد يكون بمثابة أداة قيمة لدراسة أمراض القلب الخاصة بالحجرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
في بروتوكولنا، فإننا نوصف منهجية لتوليد كرويات القلب والقلب معزول حقل مراكز المعالجة بالقلب. ويمكن استخدام هذه الآليات لدراسة آليات مواصفات CPC وخصائصها، وكذلك لنمذجة الأمراض الخاصة بغرفة القلب. واحدة سابقا نشر عمل استعمل [مسك] خطّ مع اثنان [فلسنت] مراسلات ([مف2ك/نكإكس2.5]) أن يدرس [كرديوجنسس] …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. T. كان مدعوما من قبل السحر الذي يهم وAHA. C. K. كان مدعوما من قبل المنح من NICHD/NIH (R01HD086026)، AHA، وMSCRF.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
References
- Laflamme, M. A., Murray, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Spater, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
- Birket, M. J., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell derived cardiovascular progenitors–a developmental perspective. Developmental Biology. 400 (2), 169-179 (2015).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Atrial and Ventricular Cardiomyocytes Develop from Distinct Mesoderm Populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Galdos, F. X., et al. Cardiac Regeneration: Lessons From Development. Circulation Research. 120 (6), 941-959 (2017).
- Lescroart, F., et al. Early lineage restriction in temporally distinct populations of Mesp1 progenitors during mammalian heart development. Nature Cell Biology. 16 (9), 829-840 (2014).
- Bruneau, B. G. Signaling and transcriptional networks in heart development and regeneration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (3), 008292 (2013).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), (2014).
- Bruneau, B. G., et al. Chamber-specific cardiac expression of Tbx5 and heart defects in Holt-Oram syndrome. Developmental Biology. 211 (1), 100-108 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Fibroblast growth factor 10 gene regulation in the second heart field by Tbx1, Nkx2-5, and Islet1 reveals a genetic switch for down-regulation in the myocardium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (45), 18273-18280 (2012).
- Huynh, T., Chen, L., Terrell, P., Baldini, A. A fate map of Tbx1 expressing cells reveals heterogeneity in the second cardiac field. Genesis. 45 (7), 470-475 (2007).
- Zhou, Z., et al. Temporally Distinct Six2-Positive Second Heart Field Progenitors Regulate Mammalian Heart Development and Disease. Cell Reports. 18 (4), 1019-1032 (2017).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- Cho, G. S., Tampakakis, E., Andersen, P., Kwon, C. Use of a neonatal rat system as a bioincubator to generate adult-like mature cardiomyocytes from human and mouse pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (10), 2097-2109 (2017).
- Bruneau, B. G., Srivastava, D. Congenital heart disease: entering a new era of human genetics. Circulation Research. 114 (4), 598-599 (2014).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature Genetics. 49 (7), 1152-1159 (2017).
- Li, L., et al. HAND1 loss-of-function mutation contributes to congenital double outlet right ventricle. International Journal of Molecular Medicine. 39 (3), 711-718 (2017).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Uosaki, H., et al. Direct contact with endoderm-like cells efficiently induces cardiac progenitors from mouse and human pluripotent stem cells. PLoS One. 7 (10), 46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140 (12), 2587-2596 (2013).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, 02164 (2014).
- Morita, Y., et al. Sall1 transiently marks undifferentiated heart precursors and regulates their fate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 92, 158-162 (2016).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9 (1), 3140 (2018).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326 (5951), 426-429 (2009).
