Bir besleyici içinde ınsan pluripotent kök hücrelerinden hemogenik endotelyum farklılaşma-ve Xeno-ücretsiz tanımlı koşul

1. reaktifler Hücre hatları (insan PSC ‘Ler): embriyonik kök hücreleri (ESCs) veya IPSC hatları 409B2 ve 201B7 (317-9)) ve CBA11. Reakajın hazırlanması PSC kaplama ortamı: 10 μM Y-27632 ile PSC bakım ortamını karıştırın ve 4 °C ‘ de saklayın. PSC küre döşeme Orta: karışım PSC bakım orta ile 625 – 1250 ng/mL insan rekombinant laminin-511 E8 parça (LM511-E8) (hücre hattına bağlı olarak) hemen önce kullanmayın.Not: LM511-E8 medya15′ te karıştırılabilir. Tam uzunluklu laminin-511 gibi diğer matris önceden kaplanmış olması gerekir, ve hatta bunu yaptı, onlar Farklılaşma süreci sırasında yapışmış Mezodermal organoids sürdüremez. Gün 0 farklılaşma Orta: Mix Mesodermal bazal Orta 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) ve 80 ng/ml vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF). 2. gün farklılaşma ortamı: 1 μM SB431542, 80 ng/mL VEGF ve 100 ng/mL kök hücre faktörü (SCF) ile Hemogenik bazal orta karışımı. Fosfat tampon tuz (PBS) kalsiyum veya magnezyum olmadan hazırlayın (bkz. malzeme tablosu). 1 mM etylenediaminetetraasetic asit (EDTA) tampon: 0,5 M EDTA 500 mL PBS için 1 mL ekleyin. EHT Orta: 50 ng/ml SCF ile karışım hematopoetik bazal orta, 20 ng/ml trombopoetine (TPO), 50 ng/ml FMS ile ilgili Tirozin kinaz 3 ligand (flt-3l), 20 ng/ml interlöin-6/interlökin-6 reseptör Alfa (IL-6/Il-6rα), insülin-transferrin-selenyum-etololin, L-glutamin ve penisilin/streptomisin/Amphotericin B. FACS tampon: 2% fetal buzağı serum ve 1 mM EDTA ile mix PBS. Manyetik ayırma tamponu hazırlayın (bkz. malzeme tablosu). Metilselüloz bazlı medyayı hazırlayın (bkz. malzeme tablosu). 2. PSC kolonisi oluşumu MTeSR1% 5 CO2’ ye sahip bir 37 °c ‘ lik küvatör ile 0,5 μg cm-2 LM511-E8 kaplamalı 6-kuyu plakasında hpscs ‘ye 70 – 80% konflukans büyütün. PSC ayrışma (gün-4) Orta aspirate ve iki kez PBS ile hücreleri yıkayın. Hücreleri ayrışma çözeltisi ile durulayın. 37 °C ‘ de 15 dakika (hücreler bu süre içinde kurutmaz) için Inküye yapın. PSC bakım ortamdaki hücreleri askıya alın, süspansiyonu uygun boyutta bir tüpe aktarın ve hücreleri 3 dakika boyunca 200 x g ‘de santrifüjler, süpernatant aspirate ve PSC kaplama ortamdaki hücreleri askıya alın. PSC süspansiyonunu 48.000 – 70.000 hücreli cm-2 (hücre hattına bağlı olarak) bir yoğunlukta mikro fabrikasyon plastik bir damar üzerine yerleştirin ve bir gecede 37 °c kuluçkörü ile 5% Co2’ yeNot: Biz 100 öneririz μL iyi-1 hücre süspansiyon bir 96-iyi mikro-fabrikasyon plastik gemi. Genellikle 20.000 hücreleri iyi-1 bir 96-iyi plaka yaklaşık 100 kürler verim için tohum olacaktır. Üzerinde karoseri PSC kürleri LM511-E8 (Gün-3) Bir 15 mL konik tüpteki PSC küroları, P1000 micropipetter kullanarak hafifçe pipetleme yaparak toplayın ve kürleri 2 dakika boyunca yerçekimi ile çöktmek için oda sıcaklığında bırakın. Süpernatant aspirate. Küratör kaplama ortamında askıya alma, süspansiyonu, 3 gün boyunca 5% CO2 Ile 37 °c ‘ deki 4-küre cm-2 ve kültürün yoğunluğu ile kaplı olmayan 6-kuyu kültürü plakasına dağıtın. 3. hemogenik Indüksiyon (gün 0) % 5 O2 ve 5% Co2 (hipoxik kuluçk) ile 37 °c ‘ de Day0 diferansiyel orta ve kültür ekleyin. Day0 farklılaşma ortamında iki gün kültür sonra, orta Aspire, daha sonra hipotatik inkükör day2 farklılaşma orta ve kültür ekleyin. 4. Hemogenik endotelyum izolasyonu (gün 4) İki gün sonra, orta Aspire ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri ayrışma çözeltisi ile durulayın. 37 °C ‘ de 5% CO2 ile 30 dakika boyunca kuluçko. Tek hücreli seviyeye ayırmak için 1 mm EDTA hücrelerinde yavaşça askıya, süspansiyon bir 50 ml konik tüp içine aktarmak ve 3 dakika için 200 x g hücrelerde Santrifüjlü, süpernatant aspirate ve hücre Pelet askıya 300 μL manyetik ayırma ile Arabellek. 100 μL CD34+ mikroboncuk ve hafifçe pipet ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye yapın. 100 μL CD34+ boncuk başına 20.000.000 hücreye kadar kullanılabilir. 40 μm hücre süzgeci ile süspansiyonu filtreleyin. CD34+ hücrelerini manyetik ayırıcı kullanarak ayırın. 5. endotelial-hematopoetik geçiş İndüksiyon (EHT) Fibronektin kaplama PBS ‘de 1 mg/mL fibronektin seyreltilerek 5 μg/mL fibronektin-kaplama çözeltisi gerekli hacmini hazırlayın. 24-Well kültür plakasının her bir kuyusu içine kaplama çözeltisi 0,5 mL dispense. Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kulküat. Sıralı CD34+ hücreleri at 200 x g Için 3 dk. resuspend 1 ml EHT ortamdaki hücre Pelet. Hücre sayacı ile uygun hücre yoğunluğunu belirleyin. 200.000 hücreleri mL-1 EHT orta ekleyerek hücre yoğunluğunu ayarlayın. Kaplama çözümünü fibronektin kaplı kuyunda aspirate ve atın. 0,5 mL CD34+ hücre süspansiyonu her fibronektin kaplı kuyunda dispense edilir. Bir hafta boyunca hipoktanli kuluçkan içinde inkük. 6. hematopoetik hücrelerin akış Cytometri Analizi Kayan hücre koleksiyonu: Kültür ortamını 15 mL Konik Tüpe aktarın. 3 dakika boyunca 200 x g ‘de orta santrifüj yapın. Yapışıcı hücre koleksiyonu Hücreleri iki kez 0,5 mL PBS ile yıkayın. Hücreleri çözünerek durulayın ve fazlalığı sıvı Aspire. 37 °C ‘ deki plakayı 5 dakika boyunca kuluçat. Hücreleri 1 mL FACS arabelleğinde resuspend. Yüzen hücreleri ve yapışan hücreleri karıştırın. Hücre Santrifüjü 200 x g ‘de 3 dk. supernatant aspirate. 50 μL FACS arabelleğinde resuspend. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat için anti-CD34 ve anti-CD45 antikorları ile hücreleri kulyur. Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın ve 3 dakika boyunca 200 x g ‘de santrifüjün, 0,5 μg/ml 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole ile 0,5 ml ‘lik FACS tampon olarak süpernatant ve pelletini aspirate. Ölçüm CD34 ve CD45 ifade akış cytometer tarafından. 7. koloni şekillendirme ünitesi (CFU) hematopoetik hücrelerin tahlil Hematopoetik hücre koleksiyonu: Orta kültürden 15 mL konik tüp aktarın. PBS ile iyi iki kez yavaşça durulayın. Hücre Santrifüjü 200 x g ‘de 3 dk. supernatant aspirate. 1 mL EHT orta resuspend. Hücre sayacı ile hücre numarasını belirleyin. 16 G veya 18 G şırınga ile 5 kez antibiyotik ve mix ile tamamlayıcı 3 mL metilselüloz tabanlı medya 10.000 hücreler için bir süspansiyon hacmi eşdeğer ekleyin. Tüm metilselüloz bazlı medya süspansiyonunu 6-kuyu plakasının her bir kuyusu içine dağıtın. 37 °C ‘ de iki hafta boyunca 5% CO2 ile kuluçko, nemli tutarken. Yemeği rahatsız etmeyin. Koloniler hareket duyarlı. İki hafta sonra, kolonileri mikroskop altında say.