フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

1. 試薬 細胞株(ヒトPSC):胚性幹細胞(ESC)またはiPSC線409B2および201B7(317-9))およびCBA11のいずれかを得る。 試薬の調製 PSCめっき媒体:10 μM Y-27632とPSCメンテナンス培地を混合し、4°Cで保存します。 PSCスフェロイドタイリング培地:使用直前にPSCメンテナンス培地を625-1,250 ng/mLヒト組換えラミニンラミニン-511 E8フラグメント(LM511-E8)と混合します。注:LM511-E8は、メディア15で混合することができる。フルレングスラミニン-511のような他のマトリックスは、事前にコーティングする必要があり、そうしたとしても、彼らは分化プロセス中に付着した中皮オルガノイドを維持しません。 0日目分化培地:2 μM CHIR99021、80 ng/mL骨形態形成タンパク質4(BMP4)および80 ng/mL血管内皮成長因子(VEGF)とメソダーマル基底培地を混合する。 2日目分化培地:1 μM SB431542、80 ng/mL VEGFおよび100 ng/mL幹細胞因子(SCF)とヘモジェニック基底培地を混合する。 カルシウムやマグネシウムを使用せずにリン酸緩衝食塩水(PBS)を調べてください(材料の表を参照)。 1 mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)バッファー:PBSの500 mLに0.5 M EDTAの1 mLを追加します。 EHT培地:50 ng/mL SCF、20 ng/mLトロンボポエチン(TPO)、50 ng/mL Fms関連チロシンキナーゼ3リガンド(Flt-3L)、20 ng/mLインターロイキン-6/インターレウキン-6/インターレウキン-α(IL-6)を混合インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン、L-グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンB. FACSバッファー:2%の胎児子牛血清および1 mM EDTAとPBSを混合する。 磁気分離バッファーを準備する(「材料の表」を参照)。 メチルセルロースベースのメディアを準備する(「材料の表」を参照)。 2. PSCコロニー形成 0.5 μg cm-2 LM511-E8コーティングされた6ウェルプレートを37°Cのインキュベーターで5%CO2で70~80%の合流に成長させます。 PSC解離(日 -4) 培地を吸引し、PBSで2回細胞を洗浄します。解離液で細胞をすすいで下します。37°Cで15分間インキュベートします(この時間では細胞は乾燥しません)。 PSC維持培地で細胞を懸濁し、懸濁液を適宜大きさのチューブに移し、200×gで3分間遠心分離する。 PSC懸濁液を48,000~70,000セルcm-2(細胞株に応じて)の密度でマイクロ加工プラスチック容器にプレートし、5%CO2で37°Cインキュベーターで一晩インキュベートします。注:96ウェルのマイクロ製造プラスチック容器に100 μLウェル-1の細胞懸濁液を推奨します。通常、20,000細胞を96ウェルプレートに-1でシードし、約100のスフェロイドを得ます。 PSC スフェロイドをタイリングするLM511-E8(日 -3) P1000マイクロピペッターを使用して穏やかにピペッティングすることにより、15 mL円錐形チューブにPSCスフェロイドを収集し、重力によって沈殿するために2分間室温に立つようにスフェロイドを残します。上清を吸引する。 スフェロイドめっき媒体で懸濁液を、4-スフェロイドcm-2の密度で非コーティングされた6ウェル培養プレートに懸濁液を分配し、37°Cインキュベーターで培養し、3日間5%CO2で培養する。 3. ヘモジェニック誘導(0日目) 培地を吸引し、5%O2及び5%CO2(低酸素インキュベーター)で37°CインキュベーターにDay0分化培地および培養剤を加加える。 Day0分化培地で2日間培養した後、培地を吸引し、次いで低酸素化インキュベーターにDay2分化培地および培養を加える。 4. ヘモゲン内皮の分離(4日目) 2日後、培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄する。解離液で細胞をすすいで下します。37°Cインキュベーターで30分間5%CO2でインキュベートします。 1 mM EDTAで細胞を静かに懸濁して単一細胞レベルに解離し、懸濁液を50mL円錐管に移し、200 x gで細胞を遠心分離し、上清を3分間吸引し、300μLの磁気分離で細胞ペレットを懸濁する。バッファー。 CD34+マイクロビーズと穏やかなピペを100 μLを追加します。室温で30分間インキュベートします。100 μL CD34+ビーズあたり最大2,000万個の細胞を使用できます。 40 μmセルストレーナーを通して懸濁液をろ過します。 磁気セパレータを使用してCD34+セルを分離します。 5. 内皮から平行性への転移(EHT) フィブロネクチンコーティング PBSで1mg/mLフィブロネクチンを希釈して5μg/mLフィブロネクチンコーティング溶液の必要量を調製します。 コーティング溶液の0.5 mLを24ウェル培養プレートの各ウェルに分配します。プレートを室温で30分間インキュベートします。 選別されたCD34+細胞を200xgで3分間遠心分離し、EHT培地の1mLで細胞ペレットを再ステースする。 セル カウンタを使用して、実行可能なセル密度を決定します。EHT培地を添加して細胞密度を200,000セルmL-1に調整します。 フィブロネクチンコーティングからコーティング溶液を吸引し、廃棄します。各フィブロネクチンコーティングによくCD34+セル懸濁液の0.5 mLを分配します。 低酸素インキュベーターで1週間インキュベートします。 6. 血化細胞のフローサイトメトリー解析 フローティング セル コレクション:培養培地を15mL円錐管に移します。上清を吸引する場合は、200 x gで3分間遠心分離します。 付着細胞コレクション 0.5 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。 溶解溶液で細胞をすすいで、余剰液体を吸引します。 プレートを37°Cインキュベーターで5分間インキュベートします。 FACS バッファーの 1 mL でセルを再中断します。 浮動細胞と付着細胞を混ぜます。 細胞を200 x gで3分間遠心分離し、上清を吸引する。FACSバッファの50 μLで再中断します。暗闇の中で室温で1時間抗CD34および抗CD45抗体で細胞をインキュベートする。 PBSで2回、遠心分離機を200 x gで3分間洗浄し、0.5 μg/mL 4’、6-ダイアミド-2-フェニリンドールでFACSバッファーの0.5 mLで再中断します。 フローサイトメーターでCD34およびCD45発現を測定します。 7. 血化細胞のコロニー形成ユニット(CFU)アッセイ 血化細胞コレクション:培養物から15mL円錐管に培地を移します。PBSで2回、井戸をゆっくりとすすいで下ろします。 細胞を200 x gで3分間遠心分離し、上清を吸引する。EHT培地の1mLで再中断する。セル カウンタを使用してセル番号を決定します。 抗生物質を添加したメチルセルロース系培体3mLに10,000細胞相当の懸濁量を加え、16Gまたは18G注射器で5回よく混ぜます。 メチルセルロースベースのメディアサスペンション全体を6ウェルプレートの各ウェルに分配します。 しっとりとした状態を保ちながら、2週間CO2を5%で37°Cインキュベーターでインキュベートします。料理の邪魔をしないでください。コロニーはモーションセンシティブです。 2週間後、顕微鏡下でコロニーを数えます。