הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

1. ריאגנטים קווי תא (אדם PSCs): להשיג תאים גזע עובריים (ESCs) או הקווים iPSC 409B2 ו 201B7 (317-9)) ו CBA11. הכנה מגיב ציפוי PSC בינוני: לערבב PSC תחזוקה בינונית עם 10 μM Y-27632 ולאחסן ב 4 ° c. PSC ספרואיד ריצוף בינוני: לערבב PSC תחזוקה בינונית עם 625 – 1250 ng/mL אדם רקומביננטי למינציה-511 E8 קטע (LM511-E8) (בהתאם לקו התא) רק לפני השימוש.הערה: LM511-E8 ניתן לערבב ב-media15. מטריצה אחרת כגון באורך מלא-511 צריך להיות מצופה מראש, ואף עשה זאת, הם אינם מקיימים עיבוד מזונואידים בתהליך הבידול. יום 0 בידול בינוני: לערבב בינונית בסיס מזועורי עם 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL העצם מורמורגנטית חלבון 4 (BMP4) ו 80 Ng/ml כלי הגידול האנדותל (מנשא). יום 2 בידול בינוני: לערבב מדיום בסיס הומוגניים עם 1 μM SB431542, 80 ng/mL ו100 ng/mL תא גזע גורם (SCF). הכנת תמיסת מלח (PBS) ללא סידן או מגנזיום (ראה טבלת חומרים). 1 מ”מ (EDTA) מאגר החומצה של התרופה: להוסיף 1 מ ל של 0.5 M EDTA כדי 500 mL של PBS. Eht בינוני: לערבב המטפיאה מדיום בסיס עם 50 ng/mL scf, 20 ng/ml (tpo), 50 ng/ml fms-הקשורים טירולך קינאז 3 ליגנד (טיסה-3l), 20 ng/mL interleukin-6/אינטרלוקין-6 הקולטן אלפא (il-6/il-6rα), אינסולין-מועבר-סלניום-אתיאנאמין, L-גלוטמין ו פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוריטיצין B. מאגר FACS: מערבבים PBS עם סרום עגל עוברי 2% ו 1 מ”מ EDTA. הכן מאגר הפרדה מגנטית (ראה טבלת חומרים). הכנת מתילצלולוזה מדיה מבוססת (ראה טבלת חומרים). 2. מבנה המושבה PSC לגדול hPSCs 70 – 80% שליטה על 0.5 μg ס”מ-2 LM511-E8 מצופה צלחת 6-באר ב mTeSR1 בחממה 37 ° c עם 5% CO2. PSC דיסוציאציה (יום-4) מטפי את המדיום ושוטף. את התאים בערוץ הPBS פעמיים שטפו את התאים באמצעות פתרון הדיסוציאציה. דגירה ב 37 ° צ’ עבור 15 דקות (התאים לא להתייבש בזמן הזה). להשעות את התאים במדיום תחזוקה PSC, להעביר את ההשעיה שפופרת בגודל מתאים וצנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות. לבשל את הסופרנטאנט ולהשעות את התאים במדיום ציפוי PSC. צלחת ההשעיה PSC בצפיפות של 48,000 – 70,000 תאים cm-2 (בהתאם לקו התא) אל כלי פלסטיק מיקרו מפוברק ו דגירה לילה בחממה 37 ° c עם 5% CO2.הערה: אנו ממליצים 100 μL היטב1 של השעיית תא בכלי פלסטיק 96-היטב מיקרו מפוברק. אתה בדרך כלל זרע 20,000 תאים היטב-1 בצלחת 96-באר כדי להניב כ 100 spheroids. ריצוף PSC הרואידים ב LM511-E8 (יום-3) לאסוף את PSC spheroids ב 15 מ”ל שפופרת חרוט על ידי ליטוף בעדינות באמצעות P1000 microפיפיטר ולהשאיר את spheroids לעמוד בטמפרטורת החדר עבור 2 דקות כדי לזרז על ידי כוח הכבידה. . ומכה את הסופרנטאנט השהה במדיום ציפוי ספרואיד, לוותר על ההשעיה לתוך הלוח מצופה 6-היטב התרבות בצפיפות של 4-spheroids ס”מ-2 ותרבות בחממה 37 ° c עם 5% CO2 במשך שלושה ימים. 3. מעבר הומוגניים (יום 0) מDay0 את המדיום, להוסיף בינוני ותרבות ב37 ° c בחממה עם 5% O2 ו 5% CO2 (חממה ארוי). לאחר יומיים של תרבות ב Day0 בידול בינוני, מרוב המדיום, לאחר מכן להוסיף Day2 בידול בינוני ותרבות בחממה ארוי. 4. בידוד הומוגניים אנדותל (יום 4) יומיים לאחר מכן, מטפי את המדיום. ושוטף את התאים בערוץ הPBS פעמיים שטפו את התאים באמצעות פתרון הדיסוציאציה. מודטה בחממה 37 ° c עם 5% CO2 עבור 30 דקות. בעדינות להשעות את התאים ב 1 מ”מ EDTA כדי לנתק את הרמה תא בודד, להעביר את ההשעיה לתוך שפופרת 50 mL ו צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות. ומתה את supernatant ולהשעות את הגלולה תא עם 300 μl של הפרדה מגנטית אגר. הוסף 100 μL של CD34+ מיקרוחרוזי ובעדינות pipet. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להשתמש עד 20,000,000 תאים לכל 100 μL CD34+ חרוזים. לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא 40 יקרומטר. הפרד את התאים CD34+ באמצעות מפריד מגנטי. 5. אינדוקציה של מעבר אנדותל (EHT) ציפוי פיברוטין הכן את הנפח הנדרש של 5 μg/mL fibronectin פתרון ציפוי על ידי דילול 1 מ”ג/mL fibronectin ב PBS. מדבקות 0.5 mL של פתרון הציפוי לתוך כל טוב של לוחית של 24 היטב תרבות. מודקת את הצלחת בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות. צנטריפוגה את CD34+ תאים ממוינים ב 200 x g עבור 3 דקות. השהה מחדש את התא גלולה ב 1 מ ל של מדיום eht. קבע את צפיפות התא הקיימא עם מונה התא. כוונן את צפיפות התא ל-200,000 תאים mL-1 על-ידי הוספת מדיום eht. מפחית ומפחית את הפתרון ציפוי מתוך הבאר מצופה fibronectin. מדבקות 0.5 mL של CD34+ תא הבולם לתוך כל fibronectin מצופה היטב. מודטה בחממה הארוי. לשבוע אחד 6. הזרמת כדוריות התאים אוסף תאים צף: העבר את מדיום התרבות לצינורית חרוטית בגודל 15 מ”ל. צנטריפוגה את המדיום ב 200 x g עבור 3 דקות.. ומכה את הסופרנטאנט אוסף תאים מחסיד שטוף את התאים עם 0.5 מ ל של PBS פעמיים. לשטוף את התאים עם פתרון הנתק ומכה את הנוזל העודף. מודקת את הצלחת בחממה 37 ° c עבור 5 דקות. השהה מחדש את התאים ב-1 mL של מאגר FACS. לערבב את התאים צף תאים חסיד. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות.. והוא מבשל את הסופרנטאנט השהה מחדש ב-50 μL של מאגר FACS. דגירה את התאים עם אנטי CD34 ואנטי CD45 נוגדנים עבור 1 h בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות. מרוב הסופרנטאנט ולהשעות מחדש ב 0.5 mL של מאגר facs עם 0.5 μg/mL 4 ‘, 6-diamidino-2-פניינילידול. מדידת CD34 ו-CD45 ביטוי על ידי cytometer זרימה. 7. המושבה היחידה (CFU) שיטת היווצרות תאים מהמטפאות מתחת לאוסף התאי המטכיפת: העבירו את המדיום מהתרבות לצינור החרוט בגודל 15 מ”ל. שטוף בעדינות את הבאר פעמיים עם PBS. צנטריפוגה את התאים ב 200 x g עבור 3 דקות.. והוא מבשל את הסופרנטאנט השהה מחדש ב 1 מ ל של מדיום EHT. קבע מספר תא עם מונה התא. הוסף נפח השעיה המקבילה של 10,000 תאים 3 מ ל של מתילתאית מדיה מבוססת בתוספת אנטיביוטיקה ומערבבים היטב 5 פעמים עם 16 G או 18 גרם מזרק. לוותר על כל מתילתאית מבוססי התקשורת מושעה לתוך כל טוב של צלחת 6-היטב. מודטה בחממה 37 ° c עם 5% CO2 במשך שבועיים תוך שמירה על לח. . אל תפריע לצלחת . המושבות רגישות לתנועה אחרי שבועיים, תספור את. המושבות מתחת למיקרוסקופ