Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

1. Reagenzien Zelllinien (menschliche PSK): erhalten entweder embryonale Stammzellen (ESCs) oder iPSC-Linien 409B2 und 201B7(317-9)) und CBA11. Reagenz-Präparation PSC-Beschichtungsmedium: PSC-Wartungsmedium mit 10 ‘M Y-27632 mischen und bei 4 °C lagern. PSC Spheroid-Fliesenmedium: Mischen Sie das PSC-Wartungsmedium mit 625–1.250 ng/ml menschlichem rekombinantem Laminin-511 E8-Fragment (LM511-E8)(je nach Zelllinie) kurz vor der Verwendung.HINWEIS: LM511-E8 kann in Medien15gemischt werden. Andere Matrix wie Volllängen-Laminin-511 muss vorbeschichtet werden, und sogar, sie tragen nicht mesodermale Organoide während des Differenzierungsprozesses haften. Tag 0 Differenzierungsmedium: Mischen Sie mesodermales Basalmedium mit 2 ‘M CHIR99021, 80 ng/mL Knochenmorphogenetischem Protein 4 (BMP4) und 80 ng/mL Vaskulärem endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF). Tag 2 Differenzierungsmedium: Mischen Sie hämogenes Basalmedium mit 1 M SB431542, 80 ng/mL VEGF und 100 ng/mL Stammzellfaktor (SCF). Phosphatpuffer-Saline (PBS) ohne Kalzium oder Magnesium vorbereiten (siehe Materialtabelle). 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Puffer: 1 ml 0,5 M EDTA zu 500 ml PBS hinzufügen. EHT-Medium: Mischen Hematopoietic Basalmedium mit 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL Thrombopoietin (TPO), 50 ng/mL Fms-bezogene Tyrosinkinase 3 Liganden (Flt-3L), 20 ng/mL Interleukin-6/Interleukin-6-Rezeptor alpha (IL-6/IL-6R), Insulin-Transferrin-Selen-Ethanolamin, L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B. FACS-Puffer: PBS mit 2% fetalem Kalbsserum und 1 mM EDTA mischen. Vorbereiten des magnetischen Trennpuffers (siehe Materialtabelle). Vorbereiten von Methylcellulose-basierten Medien (siehe Materialtabelle). 2. PSC-Koloniebildung HPSCs auf 70 – 80 % Konfluenkation auf einer 0,5 g cm-2 LM511-E8-beschichteten 6-Well-Platte in mTeSR1 in einem 37 °C-Inkubator mit 5% CO2anbauen. PSC-Dissoziation (Tag -4) Das Medium ansaugen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Spülen Sie die Zellen mit Dissoziationslösung. Inkubieren Bei 37 °C für 15 min (Zellen werden in dieser Zeit nicht ausgeimpft). Die Zellen im PSC-Wartungsmedium aussetzen, die Suspension auf ein entsprechend großes Rohr übertragen und die Zellen 3 min bei 200 x g zentrifugieren. Den Überstand ansaugen und die Zellen im PSC-Beschichtungsmedium aussetzen. Die PSC-Suspension mit einer Dichte von 48.000 – 70.000 Zellen cm-2 (je nach Zelllinie) auf ein mikrogefertigtes Kunststoffgefäß aufteilenund über Nacht im 37 °C-Inkubator mit 5% CO2 bebrüten.HINWEIS: Wir empfehlen 100 l well-1 der Zellsuspension in einem 96-well mikrogefertigten Kunststoffgefäß. Sie säen in der Regel 20.000 Zellen gut-1 in einer 96-Well-Platte, um etwa 100 Sphäroide zu ergeben. Fliesen PSC Sphäroide auf LM511-E8 (Tag -3) Sammeln Sie die PSC-Sphäroide in einem 15 ml konischen Rohr, indem Sie vorsichtig Pipettieren mit P1000 Mikropipetter und lassen Sie die Sphäroide bei Raumtemperatur für 2 min stehen, um durch die Schwerkraft zu fallen. Aspirieren Sie den Überstand. In Sphäroid-Beschichtungsmedium aufsetzen, die Suspension drei Tage lang in eine unbeschichtete 6-Well-Kulturplatte mit einer Dichte von 4-Sphäroidencm-2 und Kultur im 37 °C-Inkubator mit 5% CO2 geben. 3. Hämogene Induktion (Tag 0) Aspirieren Sie das Medium, fügen Sie Day0 Differenzierungsmedium und Kultur im 37 °C Inkubator mit 5% O2 und 5% CO2 (hypoxischer Inkubator) hinzu. Nach zwei Tagen Kultur in Day0 Differenzierung medium, aspirieren Sie das Medium, dann fügen Sie Day2 Differenzierung Medium und Kultur im hypoxischen Inkubator. 4. Isolierung des hämogen Endothel (Tag 4) Zwei Tage später das Medium ansaugen und die Zellen zweimal mit PBS waschen. Spülen Sie die Zellen mit Dissoziationslösung. Inkubieren Sie im 37 °C Inkubator mit 5%CO2 für 30 min. Die Zellen in 1 mM EDTA vorsichtig aufhängen, um sich von der einzelzelligen Ebene zu trennen, die Suspension in ein 50 ml konisches Rohr zu übertragen und die Zellen bei 200 x g für 3 min zentrieren. stoßdämpfer. Fügen Sie 100 L CD34+ Mikroperlen und sanft Pipetten. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Es können bis zu 20 Millionen Zellen pro 100 L CD34+ Perlen verwendet werden. Filtern Sie die Suspension durch ein 40-m-Zellensieb. Trennen Sie die CD34+ Zellen mit einem magnetischen Separator. 5. Induktion des endotheliaalen zu hämatopoetischen Übergangs (EHT) Fibronectin-Beschichtung Bereiten Sie das erforderliche Volumen von 5 g/ml Fibronectin-Beschichtungslösung vor, indem Sie 1 mg/ml Fibronectin in PBS verdünnen. Geben Sie 0,5 ml der Beschichtungslösung in jeden Brunnen einer 24-Well-Kulturplatte. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 min. Zentrifugieren Sie die sortierten CD34+ Zellen bei 200 x g für 3 min. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml EHT-Medium wieder auf. Bestimmen Sie die lebensfähige Zelldichte mit dem Zellzähler. Passen Sie die Zelldichte auf 200.000 Zellen mL-1 an, indem Sie EHT-Medium hinzufügen. Die Beschichtungslösung aus dem fibronectinbeschichteten Brunnen ansaugen und entsorgen. Geben Sie 0,5 ml CD34+ Zellsuspension in jeden fibronectinbeschichteten Brunnen. Inkubieren Sie im hypoxischen Inkubator für eine Woche. 6. Durchflusszytometrie Analyse hämatopoetischer Zellen Floating-Zell-Sammlung: Übertragen Sie das Kulturmedium auf eine 15 ml kegelförmige Röhre. Zentrifugieren Sie das Medium bei 200 x g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand. Adherent-Zellsammlung Waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,5 ml PBS. Spülen Sie die Zellen mit dissoziierender Lösung und aspirieren Sie die überschüssige Flüssigkeit. Inkubieren Sie die Platte im 37 °C Inkubator für 5 min. Setzen Sie die Zellen in 1 ml FACS-Puffer wieder aus. Mischen Sie die schwebenden Zellen und anhaftenden Zellen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspend in 50 L FACS-Puffer. Inkubieren Sie die Zellen mit Anti-CD34- und Anti-CD45-Antikörpern für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen mit PBS zweimal und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min. Den Überstand ansaugen und in 0,5 ml FACS-Puffer mit 0,5 g/ml 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole wieder aufsetzen. Messen Sie die EXPRESSION CD34 und CD45 nach Durchflusszytometer. 7. Colony Forming Unit (CFU) Assay von hämatopoetischen Zellen Hämatopoetische Zellsammlung: Übertragen Sie das Medium von der Kultur auf eine 15 ml kegelförmige Röhre. Spülen Sie den Brunnen zweimal mit PBS ab. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 3 min. Aspirieren Sie den Überstand. Resuspend in 1 ml EHT Medium. Bestimmen Sie die Zellennummer mit dem Zellenzähler. Fügen Sie ein Suspensionsvolumenäquivalent von 10.000 Zellen zu 3 ml Methylcellulose-basierten Medien hinzu, die mit Antibiotika ergänzt werden, und mischen Sie sie gut 5 Mal mit einer 16 G- oder 18 G-Spritze. Geben Sie die gesamte Methylcellulose-basierte Mediensuspension in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte. Inkubieren Sie im 37 °C Inkubator mit 5%CO2 für zwei Wochen unter Feuchte. Stören Sie das Gericht nicht. Kolonien sind bewegungsempfindlich. Zählen Sie nach zwei Wochen die Kolonien unter dem Mikroskop.