Hemogenic endoteel differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in een voeder-en xeno-vrije gedefinieerde voorwaarde

1. reagentia De lijnen van de cel (menselijk Psc’s): Verkrijg of embryonale stamcellen (Ser’s) of iPSC lijnen 409B2 en 201B7 (317-9)) en CBA11. Reagentia voorbereiding PSC plating medium: Meng PSC onderhouds medium met 10 µ M Y-27632 en bewaar bij 4 °C. PSC sferoïde betegelen medium: mix PSC onderhoud medium met 625-1250 ng/mL humaan recombinant laminin-511 E8 fragment (LM511-E8) (afhankelijk van de cel lijn) net voor gebruik.Opmerking: LM511-E8 kan worden gemengd in media15. Andere matrix, zoals full-length laminin-511 moet worden pre-coated, en zelfs deed, ze niet ondersteunen mesodermaal organoids aangehouden tijdens differentiatie proces. Dag 0 differentiatie medium: mix Mesodermaal basale medium met 2 µ M CHIR99021, 80 ng/mL Bone morfogenetische Protein 4 (BMP4) en 80 ng/ml vasculaire endothelial growth factor (VEGF). Dag 2 het middel van de differentiatie: mengeling Hemogenic basis middel met 1 µ M SB431542, 80 ng/mL VEGF en 100 ng/mL de factor van de cel van de stam (SCF). Bereid fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) zonder calcium of magnesium (Zie tabel van materialen). 1 mM ethylenediaminetetraacetic zuur (EDTA) buffer: Voeg 1 mL 0,5 M EDTA toe aan 500 mL PBS. EHT medium: mix hematopoietische basale medium met 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL thrombopoietin (TPO), 50 ng/mL FMS-gerelateerde tyrosine kinase 3 ligand (flt-2 l), 20 ng/mL interleukin-6/interleukin-6 receptor alpha (IL-6/IL-6Rα), insuline-transferrin-selenium-amine, L-glutamine en penicilline/streptomycine/amfotericine B. FACS buffer: Meng PBS met 2% foetale kalf serum en 1 mM EDTA. Bereid magnetische scheidings buffer voor (Zie de lijst van materialen). Bereid cellulose media voor (Zie de materiaallijst). 2. PSC Kolonievorming Grow hPSCs tot 70-80% confluentie op een 0,5 µ g cm-2 LM511-E8-Coated 6-well plaat in mTeSR1 in een 37 °c incubator met 5% Co2. PSC dissociatie (dag-4) Aspireren het medium en was de cellen met PBS tweemaal. Spoel de cellen met dissociatie oplossing. Incubeer bij 37 °C voor 15 min (de cellen zullen niet in deze tijd uitdrogen). Suspendeer de cellen in het PVC-onderhouds medium, breng de suspensie over naar een geschikte buis en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 3 min. aspireren de bovendrijvende en schort de cellen op in PSC plating medium. Plaat de PSC schorsing op een dichtheid van 48.000-70.000 cellen cm-2 (afhankelijk van de cel lijn) op een micro-gefabriceerd plastic vat en broeden ‘s nachts in de 37 ° incubator met 5% Co2.Opmerking: Wij raden 100 l goed-1 van de cel schorsing in een 96-goed micro-gefabriceerd plastic vat. U zult typisch zaad 20.000 cellen goed-1 in een 96-well plaat tot ongeveer 100 sferoïden opbrengst. Tegels PSC sferoïden op LM511-E8 (Dag-3) Verzamel de PSC sferoïden in een conische buis van 15 mL door voorzichtig pipetten met behulp van P1000 micro pipetter en laat de sferoïden te staan bij kamertemperatuur voor 2 minuten om neerslag door de zwaartekracht. Aspireren de bovendrijvende. Schors in sferoïde plating medium, afzien van de schorsing in een niet-gecoate 6-well cultuur plaat op een dichtheid van 4-sferoïden cm-2 en cultuur in de incubator 37 ° c met 5% Co2 voor drie dagen. 3. Hemogenic inductie (dag 0) Aspireren het medium, voeg Day0 differentiatie medium en cultuur in de 37 °C incubator met 5% O2 en 5% Co2 (hypoxische incubator). Na twee dagen van cultuur in Day0 differentiatie medium, aspireren het medium, voeg dan Day2 differentiatie medium en cultuur in de hypoxische incubator. 4. isolatie van Hemogenic endoteel (dag 4) Twee dagen later, aspireren het medium en was de cellen met PBS tweemaal. Spoel de cellen met dissociatie oplossing. Incubeer in de incubator van 37 °C met 5% CO2 voor 30 min. Schors voorzichtig de cellen in 1 mM EDTA te scheiden van de single-cell niveau, de overdracht van de schorsing in een 50 mL kegelvormige buis en centrifugeer de cellen op 200 x g voor 3 min. aspireren de bovendrijvende en schorten de cel pellet met 300 µ l van magnetische scheiding Buffer. Voeg 100 µ L van CD34+ microkralen en zacht pipet. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Tot 20.000.000 cellen per 100 l CD34+ kralen kunnen gebruikt worden. Filter de schorsing door middel van een 40 µm cel zeef. Scheid de CD34+ cellen met behulp van een magnetische separator. 5. inductie van endothelial-to-hematopoietische overgang (EHT) Fibronectine coating Bereid het vereiste volume van 5 µ g/mL fibronectine-coating oplossing door 1 mg/mL fibronectine in PBS te verdunnen. Doseer 0,5 mL van de deklaag oplossing in elk goed van een 24-goed cultuur plaat. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Centrifugeer de gesorteerde CD34+ cellen bij 200 x g voor 3 min. hersuspendeer de Cell PELLET in 1 ml eht medium. Bepaal de levensvatbare cel dichtheid met de cel teller. Pas de dichtheid van de cellen aan op 200.000 cellen mL-1 door eht medium toe te voegen. Aspireren en gooi de coating oplossing van de fibronectine goed. Doseer 0,5 mL CD34+ cel suspensie in elk fibronectine goed. Incubatie in de hypoxische incubator voor een week. 6. flow Cytometry analyse van hematopoietische cellen Floating Cell collectie: Breng het kweekmedium over op een conische buis van 15 mL. Centrifugeer het medium bij 200 x g voor 3 min. aspireren de bovendrijvende. Aanhangende cel collectie Was de cellen tweemaal met 0,5 mL PBS. Spoel de cellen met het scheiden van oplossing en aspireren de overtollige vloeistof. Incubeer de plaat in de incubator van 37 °C voor 5 min. Hersuspendeer de cellen in 1 mL FACS buffer. Meng de zwevende cellen en de aanhangende cellen. Centrifugeer de cellen bij 200 x g voor 3 min. aspireren de bovendrijvende. Opnieuw op te schorten in 50 µ L van FACS buffer. Incubeer de cellen met anti-CD34 en anti-CD45 antilichamen voor 1 h bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen tweemaal met PBS en centrifugeer bij 200 x g 3 min. aspireren de bovendrijvende en hersuspendeer in 0,5 ml FACS buffer met 0,5 µ g/ml 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole. Meet CD34 en CD45 expressie door flow cytometer. 7. Colony vormende eenheid (CFU) assay van hematopoietische cellen Hematopoietische Cell collectie: Breng het medium van de cultuur naar een 15 mL conische buis. Spoel voorzichtig de put tweemaal met PBS. Centrifugeer de cellen bij 200 x g voor 3 min. aspireren de bovendrijvende. Hersuspendeer in 1 mL EHT medium. Bepaal het cel nummer met de cel teller. Voeg een suspensie volume equivalent van 10.000 cellen tot 3 mL van cellulose-gebaseerde media aangevuld met antibiotica en meng goed 5 keer met een 16 G of 18 G spuit. Verdeel de gehele cellulose-gebaseerde media opschorting in elk goed van een 6-goed plaat. Incubeer in de incubator van 37 °C met 5% CO2 voor twee weken terwijl het houden van vochtig. Niet verstoren de schotel. De kolonies zijn motie-gevoelig. Na twee weken, Tel de kolonies onder een microscoop.