البطانة الظهارة الظهارية الظهارة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حالة محددة خالية من التغذية وXeno
Summary
هنا، نقدم بروتوكولا لتشكيل البطانة هيوجينيك على وجه التحديد من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حالة التغذية وخالية من الزينو. وسيكون لهذه الطريقة تطبيقات واسعة في نمذجة الأمراض وفحص المركبات العلاجية.
Abstract
اشتقاق الخلايا الجذعية والسلف الوظيفية المكونة للدم (HSPCs) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) كانت هدفابعيد المنال لعمليات الزرع الذاتية لعلاج أمراض الدم والاضطرابات الخبيثة. البطانة هيمنية (HE) هي منصة قابلة لإنتاج HSPCs وظيفية عن طريق عوامل النسخ أو للحث على الخلايا الليمفاوية بطريقة قوية. ومع ذلك، فإن الأساليب الحالية لاستخلاص HE إما مكلفة أو متغيرة في الغلة. في هذا البروتوكول، أنشأنا طريقة فعالة من حيث التكلفة ودقيقة لاستخلاص HE في غضون 4 أيام في حالة التغذية خالية وxeno محددة. وخضع HE الناتجة عن انتقال البطانة إلى المكونة وإنتاج CD34+CD45+ الجينات المكونة للدم الكلونية. القدرة المحتملة لمنصتنا لتوليد HSPCs وظيفية سيكون لها تطبيقات واسعة في نمذجة الأمراض وفحص المركبات العلاجية.
Introduction
وقد أعاق تطوير علاجات جديدة للاضطرابات الدموية والمناعية بسبب عدم وجود منصات قوية لنمذجة الأمراض وفحص المخدرات عالية الإنتاجية مع الخلايا الجذعية المكونة للدم الذاتية (HSCs) المستمدة من المريض الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs). إن اختراق التكنولوجيا المستحثة (i)PSC يبشر بنمذجة الأمراض من خلايا المرضى، ولكن إنشاء مراكز الصحة والصحة والرعاية الصحية الوظيفية من iPSCs المريض كان بعيد المنال. من أجل استخلاص HSCs من مراكز دعم البرامج البشرية، فإن الاستقراء السليم لبرامج النقوش الجنينية والنسخية هو المفتاح1،2،3،4،5،6، 7,8. وقد أظهر التقدم الذي أحرز مؤخرا في تطوير المكونة للدم دور البطانة هيموجيني (HE) في تطوير HSC9. يمكن أن يكون مستحثا من PSCs وهو قادر على التدخل في المصب مثل نقل الجينات10،11،12،13. باستخدام HE كمنصة، والجمع بين 5 عوامل النسخ(ERG، HOXA5، HOXA9، LCOR، RUNX1)تسبب بنجاح HSCs الوظيفية التي engraft على المدى الطويل والتفريق في سلالات متعددة14. ومع ذلك، فقد أعاق جيل متغير وغير فعال من HE من PSCs التلاعب المنهجي وتحليل الخلايا جنبا إلى جنب مع الإنتاج على الرف والحث على نطاق واسع من الخلايا المكونة للدم للاستخدام السريري.
هنا، نحن نوصف طريقة فعالة من حيث التكلفة ودقيقة لاستخلاص HE في 4 أيام مع وحدة تغذية خالية من وxeno شرط محدد. في هذه الطريقة، تشكيل كروي وإعادة تسطيح عفوية على iMarix-511 يضمن كثافة متسقة من المستعمرات PSC، وهو أمر حاسم للحث كفاءة خلايا HE.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر طريقة الحث المعرّف خالية من التغذية والزينو منصة دقيقة وفعالة من حيث التكلفة لحث خلايا HE بطريقة قابلة للتطوير. وقد أعاقت تشكيل المؤمنين من البطانة هيماجينيفية في البروتوكولات التقليدية10،11،12،13،14 بسبب عدم وجود سيطرة دقيقة على كثافة مستعمرة PSC وحجمها ، الذي يؤثر على كفاءة التمايز الموجه القائم على المورتوجين/السيتوكين. لقد شهدنا عدم اتساق في الحث البطانة هيموجينيك في كل دفعة مستقلة من البروتوكولات التقليدية. البروتوكول الجديد يتيح تنظيم محكم من كثافة مستعمرة PSC وحجمها، وبالتالي يتغلب على عدم اتساق التعريفي البطانة هيموجينيك.
استغلنا تشكيل الكروية النظامية ونقلنا فيما بعد شرط ًا محدداً خالياً من التغذية وxeno لتشكيل HE في مجموع 4 أيام. وأكدنا باستخدام ثلاثة خطوط خلايا مستقلة أن تشكيل كروي يضمن تشكيل ثابت من خلايا HE. ونتيجة لذلك، أسفرت خطوط الخلايا 409B2 12.7%-23.6% CD34+ كفاءة الخلايا على أساس ثلاث تجارب مستقلة. العامل الحاسم لبلاط كرويات PSC LM511-E8. نحن لا نوصي باستبدال هذا مع مصفوفة أخرى، مثل ماتريغل أو منتجات لامينين كاملة الطول في تجاربنا. لقد اختبرنا أن الأورغانويدات الجلدية النخاعية كانت منفصلة بسهولة عن ماتريغل وفقدت أثناء عملية التمايز. ولا ماتريغل أو كامل طول لامينين لا مرساة الخلايا دون ما قبل الطلاء.
والقصور المحتمل لهذا البروتوكول هو أننا نعتمد على وسيط صيانة PSC للحفاظ على الشركات الأمنية الخاصة. لقد اختبرنا وسائل الإعلام الأخرى مثل StemFit، لكننا للخطر التعريفي هيموجينيك. يفترض أن الخلايا كانت مقاومة للخروج من حالة متعددة القدرات في وقت قصير لدينا (4 أيام) بروتوكول التعريفي. إذا كان أحد يحافظ على PSCs في وسائل الإعلام الأخرى، فإننا نوصي بتكييف الخلايا في وسط صيانة PSC وإجراء بضع مقاطع قبل التمايز. هذه المنصة سوف تسمح بالتلاعب المنهجي وتحليل الخلايا، والإنتاج خارج على الرف والحث على نطاق واسع من الخلايا المكونة للدم للاستخدام السريري المحتمل. والهدف الطويل الأجل لهذا النظام هو وضع نموذج لأمراض نقص المناعة في نماذج الفأرة التي تُصنع من الأنسنة للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية المسؤولة وإجراء فحوص للعقاقير.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لآلينا لي وسايكو بينو على مساعدتهما التقنية. ونود أيضا أن نشكر السيدة هارومي واتانابي على تقديم المساعدة الإدارية، والدكتور بيتر كاراغيانيس على تحرير هاوية الورقة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المركز الأساسي لبحوث الخلايا iPS لشبكة مركز البحوث لتحقيق الطب التجديدي من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (AMED) [M.K.S.] ، برنامج أبحاث الأمراض المستعصية استخدام. خلايا iPS الخاصة بالأمراض من AMED (17935423) [M.K.S.] ومركز الابتكار في وكالة العلوم والتكنولوجيا اليابانية (JST) [R.O. وM.K.S.].
Materials
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5M EDTA |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
| 6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B |
| anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
| anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
| CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
| CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
| Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
| Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
| FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
| Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
| Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
| IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
| iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
| MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
| Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
| mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
| SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
| SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
| Stemline Ⅱ Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
| TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
| Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |
References
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
- Lancrin, C., et al. The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage. Nature. 457, 892-895 (2009).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Ng, E. S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros. Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).
- Batta, K., et al. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).
- Sturgeon, C. M., et al. Defining the path to hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).
- Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
- Blaser, B. W., Zon, L. I. Making HSCs in vitro: don’t forget the hemogenic endothelium. Blood. , (2018).
- Speck, N., Dzierzak, E. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nature imunology. , (2008).
- Niwa, A., et al. A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors. PLoS One. 6, e22261 (2011).
- Sturgeon, C. M., et al. Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).
- Ditadi, A., et al. Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages. Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7, 41165 (2017).
