Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

1. medya hazırlama15,16 Stok çözümleri MgCl252,5 g ekleyerek 50x tuz stok çözümü hazırlayın · 6h20, 0,735 g CAcl2· 2H20, 50 g KCL, ve 2 g na2S04 bir şişe içeren 1 L distile su. Solüsyonu iyice karıştırın ve filtrasyon ile sterilize edin. Uzun süreli depolama için 4 °C ‘ de yerleştirin. 1 g pantotenik asit, 10 g nikoinik asit, 10 g inositol ve 1 L distile su içeren bir şişe biotin 10 mg karıştırarak bir 1, 000x vitamini stok çözüm olun. Solüsyonu iyi karıştırın ve filtrasyon ile sterilize edin. Uzun süreli depolama için 4 °C ‘ de tutun. 10, 000x mineral stok çözeltisi 5 gr Borik asit, 4 gr MnSO 4, 4 g ZnSO4· 7h2o, 2 g FeCl2· 6h2o, 1 g, 0,4 g Molibdıc asit, 0,4 g Cuso4· 5h20 ve 1 L distile su içeren bir şişede 10 gr sitrik asit. Solüsyonu iyice karıştırın ve filtrasyon ile sterilize edin. Uzun süreli depolama için 4 °C ‘ de yerleştirin. 1 L distile su içeren bir şişe içine iki adenin, lösin, histidin veya lizin 7,5 g ekleyerek bireysel besin stok çözümleri yapın. Urasil solüsyonu yapmak için sadece 3,75 g kullanın. Otoklavlama ile çözeltileri sterilize edin.Not: Zamanla, urasil çözeltinin dışında çökelir. Solüsyona tekrar getirmek için, mikrodalga fırın içinde% 60 ‘ lik güç 10 s artışlarla veya 55 °C su banyosuna 20 dk. kadar ısıtın. tüm urasil kümeleri yok olana kadar sıcak solüsyonu yerleştirin. Maya özü artı takviyeleri (YES) 2 L Flask içinde, 1 L distile su, 5 g maya özü tabanı, 30 g glikoz ve 225 mg adenin, urasil, L-histidin, L-leucine ve L-lizin ekleyin. Katı orta yapmak için agar 20 g ekleyin. Çözeltinin içine malzemeyi tamamen çözmek için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın. Orta otoklavlama ile sterilize edildikten sonra agar eriyecek.Not: Kolaylık sağlamak için, kullanıma hazır YES tozu da ticari olarak mevcuttur. Edinburgh minimal Orta (EMM) ve pombe glutamat Orta (PMG) 2 L Flask olarak, 1 L distile su 3 g potasyum hidrojen ftalat, 2,2 g na2HPO4, 5 g NH4CL, glikoz 20 g, 20 mL tuz stok çözüm, 1 ml vitamin stok çözüm birleştirir ve 0,1 mL mineral stok çözeltisi. Yerine NH4Cl ile 2,2 g L-glutamik asit Monosodyum tuz PMG hazırlamak için. Katı orta yapmak için, agar 20 g ekleyin. Manyetik karıştırın çubuğu kullanarak, maddeleri iyice çözülür. Orta otoklavlama ile sterilize edildikten sonra agar eriyecek. Kullanmadan önce, gerektiğinde besin stok çözümlerini ekleyin. Her 1 L orta için, 15 mL her adenin, lösin, histidin ve lizin ekleyin. Diğer besin çözeltileri daha az konsantre olduğundan, urasil için 30 mL kullanın.Not: Kolaylık sağlamak için, kullanıma hazır EMM ve PMG tozları da ticari olarak mevcuttur. Malt özü (ME) 2 L damıtılmış su 1 L malt özü ve 225 mg her adenin, urasil, histidin ve leucine ile karıştırılır. PH 5,5 için ayarlayın. Katı orta yapmak için agar 20 g içerir. Manyetik bir karıştırma çubuğunu kullanarak bileşenleri çözüme dağıt. Orta otoklavlama ile sterilize edildikten sonra agar eriyecek. Takviyeleri ile sportif agar (SPAS) 2 L Flask içinde, 1 L distile su, 10 g glikoz, 1 g KH2Po4, 1 mL vitamini stok, 45 mg her adenin, urasil, histidin, leucine ve lizin hidroklorür ekleyin. Katı orta yapmak için agar 20 g ekleyin. Malzemeyi iyice birleştirmek için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın. Orta otoklavlama ile sterilize edildikten sonra agar eriyecek. 2. Fission Maya kültürü15,16 Kriyojenik koruma fisyon maya suşları uyanmak için Yes katı orta kullanın. Her bir gerilimin sıcaklık gereksinimlerine bağlı olarak, 3-5 gün boyunca 25 °C ya da 32 °C ‘ de inkübe edilir. Koloniler görünür olduğunda, başlangıç sıvı kültürü hazırlayın. Bireysel kolonilerden hücreleri pick ve 3 ml Yes sıvı orta içeren test tüpleri içine aşılamak. Orta veya geç günlük aşamasına uygun sıcaklıkta büyütün.Not: Uygun havalandırması için, borular veya flsorlar ile ilgili sıvı kültürü hacmine göre en az 5 kat daha büyüktür. 150-220 rpm arasında sallama hızları rutin kültür büyümesi için gelenekcüdür. 9.75 mL, Evet, EMM veya PMG artı uygun takviyeleri içeren bir 50 mL Flask içine Starter kültürü μL 250-500 dispense. Hücrelerin istenilen yoğunluğa yetişmesine izin verin ve uygun hücre morfolojisi ve beslenme durumu için mikroskop altında kontrol edin.Not: Bir aya kadar uyanır suşları saklamak için, 4 °C ‘ de parafin bandı ve yer ile YES plakaları mühür. 3. numune hazırlama2 Mikroskop slayt kurulum En az orta artı takviyeleri (mitoz) veya sıvı Spa (Meiosis) 100 ml içeren bir 500 ml kabı 2 g agaroz ekleyin. 10 sn artışlarla% 60 ‘ lik bir mikrodalga fırınında agaroz solüsyonu ısıtın veya 10 dakika boyunca 55 °c su banyosuna yerleştirin. verimli erime sağlamak için çözüm girdap. Hızlı Pad hazırlığı için agaroz slayt yapma kurulumunu (Şekil 1a) hazırlayın ve erimiş agaroz ‘nin zamanından önce katılaştırmasını engelleyin. Erimiş agaroz ‘nin oda sıcaklığında 1 dakika soğumasını ve 50-100 μL lekeleri, geniş çap pipet uçları kullanarak mikroskop slaytlarında dağıtmasına izin verin. Agaroz soğutmadan önce, yaklaşık 1,5-2 cm çapı (Şekil 1B-C) bir yayılma Pad oluşturmak için üst bir mikroskop slayt yerleştirin. Agaroz yastık genişliği genellikle görüntüleme süresi uzunluğuyla orantılıdır. Başka bir deyişle, kalın pedler daha uzun görüntüleme dönemleri dayanabilir. Kalın agaroz pedleri ile slaytların uygun kapsama sağlamak ve lamel magazini kenarları solvent maruz kalma hücre ölümü önlemek için bir sızdırmazlık maddesi olarak bir hidrokarbon karışımı kullanın. 500 mL ‘Lik bir Beaker içinde petrol jölesi, lanolin ve parafin eşit parçaları (w/w) karıştırın. 120 °C ‘ de sıcak plakalı ısı maddeleri 5 dk. Bileşenleri erime olarak, dikkatle uygun karıştırma sağlamak için erimiş çözüm girdap. Örnek kurulum Mitotik olayların incelenmesi için, her iki sıvı EMM veya PMG artı takviyeleri yaklaşık orta günlük faz (OD595 0,4) başlangıç kültürlerinden hücreleri büyümek. Santrifüjü 1 ml hücre süspansiyon 1.375 x g 1 dakika, süpernatant kaldırmak ve en az orta artı takviyeleri hücre Pelet 100 μL son hacmine yeniden pelletini. Görüntü Mayoz bölünmenin olaylar için, minimum orta artı takviyeleri başlangıç kültürlerinden hücreler büyümek geç günlük faz (OD595 0.7-1.0). 1 mL hücreli süspansiyona karşı montaj ilişkisi tipi hücrelerin eşit hacimlerini (h- ve h+) birleştirin. Santrifüjler at 1.375 x g 1 dakika ve sıvı Me Pelet pelletini. Verimli besin kaldırma sağlamak için bu adımı tekrarlayın. Son Me yıkama sonra, benim 1 ml pelletini hücreleri ve bir 50 ml Flask 9 ml Me içeren ekleyin. Minimum dönme hızı (50-100 RPM) üzerinde 22-25 °C ‘ de 12-16 h için kulkaylık yapın. Bol hücre Flocculation, hangi sonuçları birçok yuvarlak fisyon Maya kümeleri ve verimli çiftleşme gösterir. 1 dk. için 1.375 x g ‘de çiftleşme kültürü ve santrifüjler, 1ml örnek almak süpernatant ortadan kaldırmak ancak hücreleri yeniden pelletini tüp 250 μL bırakın. Agaroz pedleri üzerine hücreler yerleştirmeden önce, 5 s için güçlü Vortex kümeleri bozmak için.Not: Kalan 250 μL Me hücrelerini yeniden pelletini için kullanılan hücreler Meiosis girmek yardımcı olmak çiftleşme faktörleri içerir. % 2 agaroz yastık üzerine 20 μl ya da mitotik veya meiyotik bir hücre süspansiyonu yerleştirin. Slayt ters çevirme ve 2-3 s (Şekil 1D) için bir Lint ücretsiz kağıt havlu üstüne koyarak herhangi bir aşırı orta çıkarın. Slayt ped-tarafı yukarı ayarlayın ve yavaşça hava kabarcıkları (Şekil 1F) oluşturmak için sağlamak, bir cam coverslip yerleştirin.Not: Kağıt havlusu ile aşırı orta ortadan kaldırılması, özellikle mayoz deneylerinde kritik olan yerçekimi emiliminden daha uzun süre etkilidir. Bir hücre monolayer oluşturmak için, bir (mitoz) veya iki (Meiosis) tam döner (Şekil 1F) için işaret parmağı ile lamel magazini saat yönünde döndürün. Hücre maddenin agaroz yastık üzerinde dağıldığından emin olun tek hücrelerin veya ascı daha iyi ayrılması için izin. Küçük bir ahşap sopa yardımıyla, her agaroz Pad (Şekil 1G) mühür için lamel magazini kenarları boyunca erimiş dolgu dağıtmak. Agaroz Pad mühürlendikten sonra, mikroskop aşamasına yerleştirin ve uygun görüntüleme koşullarında (örn. sıcaklık) 10-15 dakika için dengelenmesini sağlar (Şekil 1s) hava kabarcıklarının dağılmasına ve son dakika agaroz vardiyaları oluşmasına izin verir. Slayt verimli bir şekilde dengelenmiş ve veri toplama bitinceye kadar sahne alanı ‘ndan kaldırmayın bir kez görüntüleme başlayın.Not: Sıcaklık ve nem kontrolü, kullanılan mikroskop sistemi ve spesifik deneysel gereksinimler tarafından belirlenir. Eğer varsa, sıcaklık ve nem kontrolünü tüm görüntüleme deneylerine uygulayın. Yoksa, araştırmacılar özellikle mayoz deneylerinde sıcaklık dalgalanmalarını önlemek için bir yol geliştirmelidir. 4. canlı hücre görüntüleme2 ve işleme Görüntüye uygun görünüm alanlarını bulmak için 40X hedefini kullanın. Veri edinme başlamak için 60x hedefe geçin. Kullanılan mikroskop sistemine bağlı olarak, her zaman noktasında örnek üzerinde sonraki refocusing ve kesişme el ile veya bir mikroskop veya yazılım otomatik işlem yoluyla ortaya çıkar.Not: Bu protokolde sunulan görüntüler, sedat, RFP ve GFP filtre setleri, nano hareket aşaması, 60x NA 1,4 objektif objektif ve 12-bit CCD kamera ile donatılmış bir deconvolution, floresan mikroskop kullanılarak toplandı. Dahili mekanik panjurlar ve düşük uyarma maruz kalma ve numunelerin photobleaching için izin motorlu filtre tekerlekleri. Görüntüleri almak ve işlemek için uygun yazılımı kullanın. Görüntüleri deconvolve için, üretici tarafından sağlanan optik aktarım fonksiyonları istihdam.Not: Bu protokolde kullanılan mikroskop donanımları ve yazılımları hakkında ayrıntılı bilgi için malzeme tablosunabakın. Canlı hücre görüntüleri elde etmek için geleneksel bir floresan mikroskop kullanmak için mikroskop dijital veri toplar emin olun, 40X veya 60x 1,2 daha büyük sayısal diyafram (NA) hedefleri vardır ve optik seksiyonlama yapabilir.Not: Bu gereksinimler olmadan, görseller mikroskobik ölçümler ve nitel gözlemler kalitesini tehlikeye, düşük çözünürlük gösterecektir. Görüntü edinme17,18,19,20 sırasında kontrast kaybına neden olan sistematik bulanıklık hatalarını en aza indirmek ve uygun nicel analizini sağlamak için ücretsiz plug-in programları (örn., Fiji) kullanın yoğunluğu ve hücre içindeki diğer temporal ve dinamik olayların.Not: Diğer mevcut ticari deconvolution programları malzeme tablosunda bulunabilir. En iyi gözlem altında fluorophores eşleşen mikroskop filtre setleri seçin. Uyarma ve emisyon filtrelerinin floresan proteinlerin spesifik olarak algılanmasını sağlayan sağ bant geçişleri olduğundan emin olun. Örneğin, CFP sinyalini algılamak için 430/25 ve 470/30 bir uyarma ve emisyon bandı geçişi uygundur, ancak RFP floresans için değil. Çoklu zaman noktalarında görüntüleme fisyon Maya zaman en az etkili ayarlar yaklaşımı (MESA) kullanın. Başka bir deyişle, uyarılma dalga boylarını uzun süreli kullanmaktan kaçının ve kabul edilebilir, henüz ölçülebilir ve tekrarlanabilir görüntüleme verileri üreten en düşük uyarma gücü ve pozlama süresini kullanın. Mitoz veya Meiosis sırasında uzun süreli görüntüleme için, toplama zaman noktaları arasındaki aralığı 5-10 dk ‘ye sınırlandırın. % 2 agaroz pedleri 12 ila 16 h görüntüleme seanslarına dayanabilse de, agaroz buharlaşma nedeniyle hücre değiştirme olasılığı yüksektir. Bu nedenle, sırasıyla 4-6 h veya 8-10 h pencerelerde tam mitoz veya mayoz denemeleri gerçekleştirin. En az 24-48 edinme zaman noktalarından oluşan 4-8 h için görüntüleme verilerini, sırasıyla bir floresan proteini, zaman noktası başına bir z-yığını ve 60x amacı kullanılarak 0,5-μm aralıkla 13 bölümden oluşan floresan kanalı toplayın. Bu, en az 0.5-1 GB sabit disk depolama alanı gerektirir. Böylece, photobleaching ve hücre değiştirme ortadan kaldırılması yanı sıra, bilgisayar yetenekleri1,2,3dikkate alan bir iş akışı oluşturun.Not: Bu edinme parametreleri genellikle mikroskop fonksiyonlarını kontrol eden ve görüntüleri toplayan ve işleyen yazılımla ayarlanır ve değiştirilir. Daha yakın ayrıntılı olarak belirli nükleer süreçleri incelemek için, her 5-10 s görüntü edinme gerçekleştirmek, emisyon sık maruz kaldıktan sonra önemli ölçüde azalmaz sürece. Toplanan verilerin doğruluğunu artık güvenilir olan noktası belirlemek için farklı zaman aralıklarında bir ön floresan yoğunluğu Analizi yürütmek1,3. Görüntü edinme ve görüntü işleme yazılımı, dikey konumu ne olursa olsun 2B düzlemde yüksek floresan yoğunluğu ile tüm yapıları gözlemlemek için görüntü z-yığınları üzerinde maksimum yoğunluk projeksiyon kullanın1,2, 3’ ü yapın. Bu, farklı voxels içinde meydana gelen nükleer süreçlerin hızlı bir şekilde incelenmesi kolaylaştırır. Gözlem altında hücrelerin bir referans resmi oluşturmak için bir orta odak parlak alan görüntü toplayın. 5. ımageanaliz20,21 Not: Bu protokoldeki görüntü analizi Fiji kullanılarak gerçekleştirilir. Diğer analiz programları ve Fiji eklentileri için malzeme tablosunugörmek. Eklentileri menüsü altında Bio-formatları ithalatçı özelliğini seçerek bir deconvolved görüntü yükleyin. Içe aktarma seçenekleri açılır penceresinde hyperstack, varsayılan renk modu’nu seçin ve Tamam düğmesine basmadan önce Otomatik Ölçekle ‘yi işaretleyin. Görüntülenen pencerenin alt kısmındaki ilgili çubuklarda yan kaydırarak doğru sayıda floresan kanalı ve zaman çerçevesi olduğundan emin olun. Verileri sıkıştırmaz ve bilgi kaybını engelleyen bir tiff dosyası olarak kaydedin. Mikroskop yazılımı tarafından veri işleme sırasında oluşturulan bir ölçek çubuğunu içeren bir görüntüyü açın. Benzer boyutta paralel bir çizgi çizmek ve analiz menüsünden ölçü ‘i seçmek için düz çizgi aracını kullanarak ölçek çubuğunun piksel uzunluğunu belirleyin. Analiz menüsünden ölçek ayarla seçeneğini belirleyerek görüntü pikseline μm oranını ayarlayarak bir ölçek çubuğu ekleyin. Ölçeklendirmeli açılır pencerede, hesaplanan uzaklığı piksellere ve bilinen mesafeye μm cinsindengirin, piksel en boy oranını 1,0 olarak ayarlayın, mikron uzunluğu birimolarak yerleştirin ve genel kutuyu tıklatmadan önce kontrol edin Ok düğmesine basın. Ölçümseçildiğinde ölçmek için farklı parametreler seçmek üzere analiz menüsünün altındaki ölçümler ayarla seçeneğini kullanın. Bu protokol amacıyla aşağıdaki ölçümleri seçin: alan, çevre, Ortalama gri değer, medyan, Min & maksimum gri değer, entegre yoğunluk, yığın konumuve ekran etiketivardır. Toplanan verilerin hassasiyetine bağlı olarak, ondalık basamak seçeneği için 1 ‘ den fazla girin ve gerekirse bilimsel gösterim kutusunu işaretleyin. Hesaplama komutu uygulandıktan sonra, sonuçlar açılır penceresi her bir parametre için değerleri gösterecektir. Sonuçları bir istatistik programında gelecekteki analiz için. csv dosyası olarak kaydedin.Not: Bu durumda aşağıda ayrıntılı adım takip farklı renkler arasında sinyal paraziti olmadıkça, uzunluğunu belirlemek için onun kurucu floresan kanalları içine bir görüntü ayırmak için gerekli değildir. Sinyal paraziti durumunda, Görüntü menüsünden renk ve kanallar aracı ‘nı seçin ve her bir rengi ayrı olarak analiz edin. Doğrusal olmayan yapıların uzunluğunu ölçmek için, çizgi aracı ‘nı sağ tıklatın ve istenen nesneleri izlemek için bölümlenmiş çizgi veya FreeHand Line seçeneğini kullanın. Doğrusal yapılar için veya iki nokta arasındaki mesafeyi belirlemek için düz çizgi özelliğini kullanın ve analiz menüsünden Ölçü seçin. Μm cinsinden uzunluk değerleri, ölçümleri ayarla seçeneğinin altında önceden seçilen parametrelere otomatik olarak eklenir. Sinyal boyutu ve floresan yoğunluğunda yapılan değişiklikleri ölçmek için, önce bir ilgi alanı (YG) Kütüphanesi oluşturun, bu da ölçüm doğruluğunu artırır ve görüntü yığınında hızlı ölçümleri kolaylaştırır. Resim menüsünün altındaki renk ve Kanallar aracını seçin. Kanallar açılır penceresinde, yoğunluk veya alanın ölçüleceği renk kanalını kontrol edin. Görüntü menüsünün altındaki Ayarla ve eşik özelliklerini seçin. Karanlık arka plan kutusunu kontrol edin, varsayılan yöntemi seçin (toplanan veriler tarafından aksi gerekmedikçe) ve ilgi sinyallerini bindirme için kırmızı seçeneğini belirleyin.Not: Protein stabilitesi, hareketi ve lokalizasyonu ölçümü, YG kitaplıkları oluşturmak için kullanılan renk eşiğine yakından bağlıdır. 17,18olarak görselleştirilen floresan işaret sinyalinin türü için doğru eşik yöntemini seçmek önemlidir. Her ilgi yapısını vurgulamak için Değnek aracını kullanın ve seçilen YG ‘Yi açılır YG Yöneticisi penceresine eklemek için klavyede T harfini basın. Görüntü yığınındaki her dilim (zaman çerçevesi) için bu işlemi yineleyin ve daha fazla düğmeye tıklayarak ve Kaydet’ı seçerek tüm Rois deposunu saklayın. YG yöneticisini yüklemek Için sıkıştırılmış YG klasörünü açın ve sol taraftaki paneldeki her YG tanımlayıcısını tıklayın. Analiz menüsünden Ölçü seçin ve görüntü yığınının tüm dilimleri ilgi NESNELERI ölçmek için her YG tanımlayıcısı bu komutu yineleyin. Hücre değişimi bir sorun değilse ve odak düzlem yığının tüm dilimleri için aynı kalır, YG yöneticisinde Multi Measure tıklayın. Açılır pencerede, ölçümleri görüntü yığını boyunca yinelemek için, dilim başına bir satır yerine Tüm dilimleri ölçün ‘i seçin. Sonuçları bir CSV dosyası olarak kaydedin ve ölçümleri bir istatistik programında analiz edin. İlgi yapısını içeren birden fazla nükleer sinyal için, tek bir YG oluşturmak için Wand aracıyla nesneleri seçerken Shift tuşuna basın. Alternatif olarak, tüm ilgi sinyalleri kapsayacak şekilde Oval aracı ile sabit boyutta bir YG oluşturun.Not: Bu oval yaklaşım, floresan sinyalinin boyutta ve zamanla yoğunlukta değiştiği bir alan üzerinde sinyal davranışını ölçmek ve açıklamak için gerekli olabilir. Sinyal yoğunluğu, bu durumda, belirli bir alan üzerinde ortalama sinyal yoğunluğudur. İki Floresan sinyalinin ortak lokalizasyonu ile sinyal çakışan bölgenin renk değişikliğiyle niteliksel olarak belirlenir. Ancak, ortak yerelleştirme bölgesi daralır, sinyal çakışmayı ayırt etmek daha zordur. Bu durumda, aşağıda ayrıntılı adımları izleyin. 5,6 adımda açıklandığı gibi kanallar aracını kullanarak, söz konusu sinyalin üzerine düz bir çizgi çizin ve analiz menüsünün altındaki profil çizim komutunu seçin. Aynı çizilmiş satırı kullanarak söz konusu tüm renkler için bu adımı yineleyin. Her profil oluşturma adımının ardından görünen örnek açılır penceresinin grafiği , bir Çizim değerleri penceresini çağırmak için liste düğmesine basın ve her sinyal için ölçümleri bir CSV dosyası olarak kaydedin. İstatistik programında, her sinyal için gri değeri çizilen çizgi boyunca ilgili konumuna (μm cinsinden) karşı çizer bir grafik oluşturun. Sinyal profili çizimleri arasında örtüşme eksikliği genellikle Co-yerelleştirme eksikliği gösterir.Not: Sinyal Co-yerelleştirme incelemek için yansıtılmış görüntüler üzerinde Plot profil aracını kullanın. Bu, sadece bu tür bir çakışma görüntü z-yığını aracılığıyla gözlenen güvenilirdir. Zaman içinde floresan proteinlerin dinamik davranışını izlemek için analiz menüsünün altında bulunan Multi kymograph aracını kullanın. Elde edilen görüntü, tek bir zaman noktalarını temsil eden z-yığınının her dilimi içinde bir dizi yoğunlaştırılmış Snapshot aracılığıyla floresan sinyal hareketini gösterir. Kanallar aracı , doğru kanalda ilgi nesne yalıtmak için adım 5,6 açıklandığı gibi kullanın. Seçili nesne veya yapı z-yığını önemli ölçüde vardiya değil emin olun. Nesnenin üzerine düz bir çizgi veya dikdörtgen yerleştirin, analiz menüsünden Multi kymograph aracını seçin ve nesnenin üzerinde yer alan çizginin istediğiniz genişliğini girin. 5,6 adımda açıklandığı gibi kanallar aracını kullanarak ve Görüntü menüsünden yığınlar ve montaj yap araçlarını seçerek belirli bir zaman penceresinde nükleer dinamikleri gösteren görüntü panelleri oluşturun. Montaj yap açılır penceresinde, istenen sütun ve satır sayısını girin, 1,0 ölçek faktörü ayarlayın, Ilk ve son dilimleri (zaman dilimlerini) seçin ve Tamam ‘a basmadan önce kenarlık genişliğini en az 5 olarak değiştirin. Hangi görüntüleri değiştirerek göstermek için yığınında seçmek mümkündür artışları istenen sıra uyacak şekilde. Bir film oluşturmak için istenen hyperstack ‘i yükleyin, Dosya menüsünden bir avı dosyası olarak Kaydet seçin, sıkıştırmaiçin hiçbiri seçin ve 2-8 fps kare hızını girin. Görüntüyü kapsayan tüm renkleri birleştirmek veya ayırmak için Kanallar aracında kompozit alırken montaj yap komutunu seçin.Not: Bu protokolde iki avi dosyası (Movie 1-2) sağlanır. 5. adımda vurgulanan farklı özellikleri denemek için Fiji ‘de bunları kullanın. Tek bir temsili hücreyi göstermek için, görüntü menüsünden Dönüştür ve Döndür ‘ü kullanın ve döndürme derecelerini girin. Pozitif değerler nesneleri sağa döndürürken negatif sayılar nesneleri sola döndürün. Hücre uygun yönde olduğunda, z-yığını veya ilgi zaman dilimleri sırasında tüm hücreyi kapsayan bir dikdörtgen çizin ve görüntü menüsünden kırpma seçin. Adım 5,16 ve 5.16.1 bir görüntü paneli veya film oluşturmak için belirtildiği gibi devam edin. Analiz menüsünden Araçlar ve ölçek çubuğu seçerek Görüntü paneline veya filme bir ölçek çubuğu ekleyin. Ölçek çubuğu açılır penceresinde, tek hücreler veya tüm görünüm alanları için 100-250 için mikron cinsinden genişlik için 5-15 girin, renk için beyaz veya siyah ‘ı seçin ve Ölçek çubuğunu yerleştirmek için uygun bir konum seç. Film için, nükleer olaylar sırasında zaman ilerlemesi göstermek yararlıdır. Çerçeveler arasında zaman değişimi göstermek için resim’i seçin, yığınlar ‘ı tıklatın, zaman Stamper aracını kullanın, zaman serisindeki başlangıç çerçevesini belirtin ve zaman göstergesi için uygun bir konum seçin.