Caracterización a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos de una nueva proteína kinasa
Summary
Caracterizamos una nueva proteína quinasa utilizando enfoques bioquímicos robustos: análisis de Western Blot con un anticuerpo específico específico específico específico en diferentes líneas y tejidos celulares, interacciones por experimentos de coinmunoprecipitación, actividad quinasa detectada por Western Blot usando un anticuerpo fosfo-específico y por el etiquetado ATP de32P.
Abstract
La secuenciación extensa del genoma entero ha identificado muchos marcos de lectura abiertos (ORF) que proporcionan muchas proteínas potenciales. Estas proteínas pueden tener funciones importantes para la célula y pueden desentrañar nuevos procesos celulares. Entre las proteínas, las quinasas son los principales actores, ya que pertenecen a las vías de señalización celular y tienen la capacidad de activar o desactivar muchos procesos cruciales para el destino de la célula, como el crecimiento celular, la división, la diferenciación, la motilidad y la muerte.
En este estudio, nos centramos en una nueva proteína quinasa potencial, LIMK2-1. Demostramos su existencia por Western Blot usando un anticuerpo específico. Evaluamos su interacción con una proteína reguladora aguas arriba utilizando experimentos de coinmunoprecipitación. La coinmunoprecipitación es una técnica muy potente capaz de detectar la interacción entre dos proteínas diana. También se puede utilizar para detectar nuevos socios de una proteína de cebo. La proteína de cebo puede ser purificada ya sea a través de una etiqueta diseñada para su secuencia o a través de un anticuerpo dirigido específicamente a ella. Estos complejos proteicos pueden separarse por SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamidGel Gel) e identificarse mediante espectrometría de masas. El LIMK2-1 inmunoprecipitado también se utilizó para probar su actividad de quinasa in vitro mediante el etiquetado de ATP de32P. Este ensayo bien establecido puede utilizar muchos sustratos diferentes, y las versiones mutadas del cebo se pueden utilizar para evaluar el papel de residuos específicos. Los efectos de los agentes farmacológicos también pueden evaluarse ya que esta técnica es altamente sensible y cuantitativa. No obstante, el manejo de la radiactividad requiere especial precaución. La actividad de la quinasa también puede evaluarse con anticuerpos específicos dirigidos al grupo fosfo del aminoácido modificado. Este tipo de anticuerpos no están disponibles comercialmente para todos los residuos modificados fosfo.
Introduction
Durante muchas décadas, numerosas vías de señalización se han aclarado y su participación en procesos celulares cruciales como la división celular, diferenciación, motilidad, muerte celular programada, inmunidad y neurobiología, se ha demostrado. Las quinasas desempeñan un papel importante en estas vías de señalización, ya que a menudo regulan finamente su activación o inactivación y forman parte de complejos versátiles transitorios que responden a estímulos externos1,2,3. La mutación y la desregulación de las quinasas a menudo conducen a enfermedades en los seres humanos, y por lo tanto se han convertido en uno de los objetivos farmacológicos más importantes en los últimos cuarenta años4.
En este contexto, es importante ser capaz de detectar la interacción de la quinasa con sus reguladores aguas arriba o sustratos aguas abajo e identificar nuevos socios. La purificación de afinidad y la inmunoprecipitaciónson técnicas muy potentes para el aislamiento de complejos proteicos 5. La proteína de cebo o quinasa puede ser etiquetada con una secuencia de péptidos específica que permite el uso de cuentas comerciales covalentemente junto con anticuerpos dirigidos al péptido. Este material permite una alta reproducibilidad en los experimentos6,7,8. Las proteínas endógenas también pueden inmunopreciarse utilizando anticuerpos dirigidos directamente a la proteína de cebo. Los anticuerpos pueden estar reticulados a cuentas de agarosa de proteína A o proteína G o simplemente incubados con estas cuentas antes de añadir lisato. Los amortiguadores de lisis deben optimizarse para permitir la solubilización de proteínas sin perder la interacción y evitar la degradación de las proteínas. Un inconveniente importante de este enfoque es que la interacción se detecta sobre la lisis celular; por lo tanto, pueden perderse las interacciones transitorias o débiles, junto con las que requieren contexto subcelular. Otras técnicas se pueden utilizar para trabajar directamente en la célula, como el ensayo de ligadura de proximidad (PLA)9, in vivo cross-linking-assisted affinity purification (XAP)10, Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) o F-rster Resonance Energy Transferencia (FRET)11,12. Además, la inmunoprecipitación no es adecuada para determinar las constantes termodinámicas de la unión, para las que se requieren técnicas físicas como la Resonancia de Plasmón superficial, la Calorimetría de Valoración Isotérmica o la Termoresis microescala 13,14.
La actividad de la quinasa puede evaluarse utilizando múltiples técnicas. En este documento, nos centramos en los anticuerpos fosfo-específicos y el etiquetado in vitro deATP(Trifosfato de adenosina). Los anticuerpos fosfo-específicos se dirigen a la modificación fosfato de un residuo particular dentro de una proteína. Se pueden utilizar en Western Blot o ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) después de la lisis celular, para la inmunohistoquímica, y también en células intactas utilizando citometría de flujo o inmunofluorescencia. Sus inconvenientes pueden incluir su falta de especificidad, que puede ser evaluada usando una versión mutada de la proteína objetivo, y su no estar disponible comercialmente para todas las proteínas. El etiquetado ATP in vitro á[32P] es un método muy robusto, bien establecido y altamente sensible15. Se pueden utilizar proteínas inmunopreciadas o recombinantes, y se pueden probar diferentes sustratos. Los efectos de los medicamentos también pueden evaluarse ya que este método es cuantitativo. Su principal inconveniente es que la radiactividad asociada con el enfoque requiere manejo con precaución. Los métodos alternativos también son posibles basados en la medición de sustratos de péptidos fluorescentes o luminiscentes y aprovechando las propiedades fluorescentes/luminiscentes alteradas al fosforilación. Estos métodos también permiten un alto rendimiento, que es necesario, por ejemplo, en el cribado de moléculas que pueden ser inhibidores potenciales de la quinasa diana. De hecho, las quinasas representan una de las mayores clases de objetivos farmacológicos perseguidos por las compañías farmacéuticas16.
En este estudio, nos centramos en la proteína LIMK2-1 (LIMK2-1 significa Lin11, Isle1, Mec3 Kinase isoform 2-1). La proteína quinasa LIMK2 fue descrita por primera vez en 199517. Tres isoformas de LIMK2 son producidas por empalme alternativo: LIMK2a, LIMK2b y LIMK2-1. En la actualidad, LIMK2-1 sólo se ha descrito a nivel de ARNm en un solo estudio18. Aquí, caracterizamos esta nueva proteína quinasa potencial a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos. En primer lugar, demostramos que LIMK2-1 está sintetizado. Al igual que sus dos homólogos, LIMK2a y LIMK2b, interactúa con la quinasa rock (proteína quinasa asociada a Rho). Demostramos que LIMK2-1 tiene una actividad quinasa en Myelin Basic Protein (MBP), pero no en la cofilina, el sustrato canónico de las quinasas LIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este documento, hemos utilizado herramientas bioquímicas robustas para caracterizar a nivel molecular una nueva proteína, LIMK2-1, que se cree que es una quinasa basada en su secuencia y en sus homólogos, LIMK2a y LIMK2b20.
En primer lugar, demostramos la existencia de LIMK2-1 a nivel proteico utilizando el análisis de Western Blot con un anticuerpo específico. Después de esto, evaluamos su interacción con la quinasa ascendente ROCK1, que se sabe que regula LI…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por La Ligue contre le Cancer, l’Association Neurofibromatoses et Recklinghausen, y la Région Centre Val de Loire. Muchas gracias a Aurélie Cosson y Déborah Casas por los datos de citometría de flujo, y a Keyron Hickman-Lewis por la revisión exhaustiva del manuscrito.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
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