Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase
Summary
Nós caracterizamos uma proteína nova da quinase usando aproximações bioquímicas robustas: análise ocidental do borrão com um anticorpo específico dedicado em linhas e em tecidos diferentes da pilha, interações por experimentos do coimmunoprecipitação, atividade da quinase detectada por ocidental Blot usando um anticorpo fosho-específico e por γ [32P] rotulagem ATP.
Abstract
O sequenciamento do genoma inteiro extenso identificou muitos quadros de leitura abertos (ORFs) que fornecem muitas proteínas potenciais. Estas proteínas podem ter papéis importantes para a célula e podem desvendar novos processos celulares. Entre as proteínas, as cinases são atores principais como eles pertencem a vias de sinalização celular e têm a capacidade de ligar ou desligar muitos processos cruciais para o destino da célula, como o crescimento celular, divisão, diferenciação, motilidade, e morte.
Neste estudo, nós focamos em uma proteína potencial da quinase nova, LIMK2-1. Nós demonstramos sua existência por Western blot usando um anticorpo específico. Nós avaliamos sua interação com uma proteína de regulamento ascendente usando experimentos da coimunoprecipitação. A coimunoprecipitação é uma técnica muito poderosa capaz de detectar a interação entre duas proteínas alvo. Ele também pode ser usado para detectar novos parceiros de uma proteína de isca. A proteína da isca pode ser purificada quer através de uma etiqueta projetada para sua seqüência ou através de um anticorpo especificamente direcioná-lo. Estes complexos proteicos podem então ser separados por SDS-PAGE (gel de PolyAcrylamide do sulfato do Dodecyl do sódio) e identificados usando a espectrometria maciça. Immunoprecipitated LIMK2-1 foi usado igualmente para testar sua atividade da quinase in vitro pela rotulagem do ATP de γ [32P]. Este ensaio bem estabelecido pode usar muitos substratos diferentes, e versões mutadas da isca podem ser usadas para avaliar o papel de resíduos específicos. Os efeitos dos agentes farmacológicos também podem ser avaliados, uma vez que esta técnica é altamente sensível e quantitativa. No entanto, o manuseio de radioatividade requer cautela especial. A atividade da quinase pode igualmente ser avaliada com os anticorpos específicos que visam o grupo do phospho do aminoácido modificado. Estes tipos de anticorpos não estão disponíveis comercialmente para todos os resíduos de fosho modificados.
Introduction
Durante muitas décadas, inúmeras vias de sinalização foram elucidadas e seu envolvimento em processos celulares cruciais, como divisão celular, diferenciação, motilidade, morte celular programada, imunidade e neurobiologia, tem sido demonstrado. As quinases desempenham um papel significativo nessas vias de sinalização, pois muitas vezes regulam finamente sua ativação ou inativação e fazem parte de complexos versáteis transitórios que respondem a estímulos externos1,2,3. A mutação e o desregulação das quinases conduzem frequentemente às doenças nos seres humanos, e tornaram-se conseqüentemente um dos alvos os mais importantes da droga sobre os 40 anos passados4.
Neste contexto, é importante ser capaz de detectar a interação quinase com seus reguladores upstream ou substratos a jusante e identificar novos parceiros. A purificação de afinidade e a imunoprecipitação são técnicas muito poderosas para o isolamento de complexos proteicos5. A proteína ou quinase da isca pode ser etiquetada com uma seqüência específica do peptide permitindo o uso de grânulos comerciais covalentemente acoplado com os anticorpos que alvejam o peptide. Este material permite uma alta reprodutibilidade em experimentos6,7,8. As proteínas endógenas também podem ser imunoprecipitadas usando anticorpos direcionados diretamente à proteína de isca. Os anticorpos podem ser reticulados aos grânulos de agarose da proteína A ou da proteína G ou simplesmente incubado com estes grânulos antes de adicionar o lysate. Os buffers de Lise devem ser otimizados para permitir a solubilização de proteínas sem perder a interação e evitar a degradação da proteína. Uma desvantagem principal desta aproximação é que a interação está detectada em cima da lise da pilha; Conseqüentemente, as interações transientes ou fracas, junto com aquelas que exigem o contexto subcellular podem ser perdidas. Outras técnicas podem ser usadas para trabalhar diretamente na célula, como o ensaio de ligadura de proximidade (PLA)9, a purificação de afinidade assistida por ligação cruzada in vivo (xap)10, transferência de energia de ressonância de BIOLUMINESCÊNCIA (BRET) ou energia de ressonância de Förster Transferência (fret)11,12. Além disso, a imunoprecipitação não é apropriada para determinar as constantes termodinâmicas da ligação, para as quais são necessárias técnicas físicas como ressonância Plasmon superficial, Calorimetria de Titulação Isotérmica ou Termoforese em microescala 13,14.
A atividade da quinase pode ser avaliada usando várias técnicas. Nisto, nós focamos em anticorpos phospho-específicos e in vitro γ [32P] ATP (triphosphate de adenosina) que etiquetam. Os anticorpos phospho-específicos alvejar a modificação do fosfato de um resíduo particular dentro de uma proteína. Podem ser usados no borrão ocidental ou no ELISA (ensaio enzima-lig de ImmunoSorbent) após o lysis da pilha, para immunohistochemistry, e igualmente em pilhas intactas usando a citometria ou a imunofluorescência do fluxo. Suas desvantagens podem incluir sua falta de especificidade, que pode ser avaliada usando uma versão mutada da proteína alvo, e sua não estar disponível comercialmente para todas as proteínas. In vitro γ [32P] a rotulagem ATP é um método muito robusto, bem estabelecido e altamente sensível15. Proteínas imunoprecipitadas ou recombinantes podem ser usadas, e diferentes substratos podem ser testados. Os efeitos das drogas também podem ser avaliados, pois esse método é quantitativo. Sua principal desvantagem é que a radioatividade associada à abordagem requer manuseio com cautela. Os métodos alternativos são igualmente possíveis baseados na medida de substratos fluorescentes ou luminescentes do peptide e aproveitando-se de propriedades fluorescentes/luminescentes alteradas em cima do phosphorylation. Tais métodos também permitem alta taxa de transferência, o que é necessário, por exemplo, na triagem de moléculas que podem ser potenciais inibidores da quinase-alvo. De fato, as quinases representam uma das maiores classes de alvos de drogas perseguidos pelas empresas farmacêuticas16.
Neste estudo, nós focamos na proteína LIMK2-1 (LIMK2-1 significa Lin11, Isle1, Mec3 isoforma da quinase 2-1). A proteína da quinase LIMK2 foi descrita pela primeira vez em 199517. Três isoformas de LIMK2 são produzidas por splicing alternativo: LIMK2a, LIMK2b e LIMK2-1. Presentemente, LIMK2-1 foi descrito somente no nível do mRNA em um único estudo18. Nisto, nós caracterizamos esta proteína nova potencial da quinase no nível molecular usando aproximações bioquímicas robustas. Em primeiro lugar, demonstramos que LIMK2-1 é de fato sintetizado. Semelhante às suas duas contrapartes, LIMK2a e LIMK2b, interage com a quinase ascendente ROCK (proteína quinase associada a Rho). Nós mostramos LIMK2-1 tem uma atividade da quinase na proteína básica de myelin (MBP), mas não no cofilin, o substrato canônico de LIM kinases.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste documento, utilizamos ferramentas bioquímicas robustas para caracterizar no nível molecular uma nova proteína, LIMK2-1, que se acredita ser uma quinase baseada em sua seqüência e em seus homologs, LIMK2a e LIMK2b20.
Primeiramente, nós Demonstramos a existência de LIMK2-1 no nível da proteína usando a análise ocidental do borrão com um anticorpo específico. Em seguida, avaliamos sua interação com a quinase upstream ROCK1, que é conhecida por regular …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por la Ligue contre le Cancer, L’ Association neurofibromatoses et Recklinghausen, e la Région Centre Val de Loire. Muito obrigado a Aurélie Cosson e Déborah casas para dados de citometria de fluxo, e a Keyron Hickman-Lewis para revisão minuciosa do manuscrito.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
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