אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש
Summary
אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.
Abstract
רצף הגנום השלם נרחב זיהה מסגרות קריאה פתוחות רבות (ORFs) מתן חלבונים פוטנציאליים רבים. חלבונים אלה עשויים להיות תפקידים חשובים לתא ועלול לפענח תהליכים סלולריים חדשים. בין החלבונים, קינסים הם שחקנים גדולים כפי שהם שייכים לתא איתות מסלולים ויש להם את היכולת לעבור או לבטל תהליכים רבים חיוניים לגורל התא, כגון צמיחת תאים, חלוקה, בידול, תנועתיות, ומוות.
במחקר זה התמקדנו בחלבון קינאז חדש, LIMK2-1. הדגמנו את קיומו על ידי אבן החשופה המערבית באמצעות נוגדן ספציפי. הערכנו את האינטראקציה שלה עם חלבון במעלה הזרם באמצעות ניסויים coimmunoprecipitation. Coimmunoprecipitation היא טכניקה רבת עוצמה מסוגל לזהות את האינטראקציה בין שני חלבונים היעד. זה יכול לשמש גם כדי לזהות שותפים חדשים של חלבון פיתיון. ניתן לטהר את חלבון הפיתיון באמצעות תגית המיועדת לרצף שלו או באמצעות נוגדן המכוון אותו במפורש. מכלולי חלבון אלה עשויים להיות מופרדים על-ידי SDS-PAGE (נתרן Dodecyl סולפט PolyAcrylamide ג’ל) ומזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. Immunoprecipitated LIMK2-1 שימש גם כדי לבחון את פעילותה קינאז בתוך מבחנה על ידי γ [32P] ATP תיוג. שיטת מבוסס-היטב זו עשויה להשתמש במספר רב של מצעים שונים, וניתן להשתמש בגרסאות מוטציה של הפיתיון כדי להעריך את התפקיד של שאריות מסוימים. ההשפעות של סוכני תרופתי עשוי גם להיות מוערך מאז טכניקה זו הן רגישות מאוד כמותית. למרות זאת, הטיפול ברדיואקטיביות. דורש זהירות מיוחדת פעילות קינאז עשויה גם להיות מוערך עם נוגדנים ספציפיים מיקוד קבוצת פוספהו של חומצת האמינו ששונתה. סוגים אלה של נוגדנים אינם זמינים מסחרית עבור כל שאריות פוספהו שונה.
Introduction
במשך עשורים רבים, מסלולי איתות רבים כבר הובהר ואת מעורבותם בתהליכים סלולריים מכריע כגון חלוקת תאים, בידול, תנועתיות, מוות תאים מתוכנת, חסינות ונוירוביולוגיה, הוכח. קינסים לשחק תפקיד משמעותי אלה מסלולים איתות כפי שהם לעתים קרובות מווסת את ההפעלה שלהם או איון פעלה הם חלק מתחמי רב-תכליתי ארעי כי להגיב גירויים חיצוניים1,2,3. מוטציה ודיסרגולציה של קינסים לעיתים קרובות להוביל מחלות בבני אדם, ולכן הם הפכו לאחד מטרות הסמים החשובים ביותר במהלך 40 השנים האחרונות4.
בהקשר זה, חשוב להיות מסוגל לזהות את האינטראקציה של קינאז עם הרגולטורים שלהם במעלה הזרם או מצעים במורד ולזהות שותפים חדשים. טיהור וimmunoprecipitation אהדה הם טכניקות רבות עוצמה לבידוד של מכלולי חלבונים5. חלבון הפיתיון או קינאז עשוי להיות מתויג עם רצף פפטיד מסוים המאפשר שימוש בחרוזים מסחריים בשילוב עם נוגדנים מיקוד הפפטיד. החומר הזה מאפשר הזיית הגדול בניסויים6,7,8. חלבונים אנדוגני עשויים גם להיות immunoprecipitated באמצעות נוגדנים מיקוד ישירות החלבון פיתיון. הנוגדנים יכול להיות מקושרת מקושרת חלבון A או חלבון G agarose חרוזים או פשוט מודבטים עם חרוזים אלה לפני הוספת lysate. מאגרי לליזה חייב להיות ממוטב כדי לאפשר מסיסות חלבונים מבלי לאבד אינטראקציה כדי למנוע השפלה חלבון. החיסרון העיקרי של גישה זו הוא כי האינטראקציה מזוהה על הליזה תאים; לפיכך, אינטראקציות זמניות או חלשות, יחד עם אלה הדורשות הקשר משנה-תאית עלול להיות חסר. טכניקות אחרות עשויות לשמש לעבודה ישירות בתא כגון שיטת הסמיכות הקרבה (PLA)9, ב vivo חוצה קישור-בסיוע לטיהור אהדה (xap)10, ביולומיאנמינציה העברת אנרגיה העברה (ברט) או Förster אנרגיית התהודה העברה (סריג)11,12. יתרה מזאת, הimmunoprecipitation אינו מתאים לקבוע את הקבועים התרמודינמיים של הכריכה, שעליהם טכניקות פיזיות כגון משטח תהודה במשטח, איזותרמי טיטור קלורימטריה או תרמופלאזיס מיקרוסקאלה . 13,14.
פעילות קינאז עשויה להיות מוערך באמצעות טכניקות מרובות. בזאת, אנו התמקדו נוגדנים ספציפיים פוספאו γ [32P] ATP (אדנוזין triphosphate) תיוג. הנוגדנים הספציפיים של פואהו מכוונים לשינוי פוספט של שאריות מסוימים בתוך חלבון. ניתן להשתמש בהם באבן החשופה המערבית או באליסה (השיטה החיסונית המקושרת באמצעות אנזימים) לאחר פירוק תאים, עבור אימונוהיסטוכימיה, וגם על תאים שלמים באמצעות הזרמת cy, או immunofluorescence. החסרונות שלהם עשויים לכלול חוסר ספציפיות, אשר ניתן להעריך באמצעות גרסה מוטציה של חלבון היעד, ושלהם לא להיות זמין מסחרית עבור כל החלבונים. בשנת החוץ γ [32P] תיוג ATP היא חזקה מאוד, שיטה מבוססת היטב ורגישה מאוד15. חלבונים Immunoprecipitated או רקומביננטי ניתן להשתמש, ומצעים שונים עשויים להיבדק. ההשפעות של תרופות ניתן גם להעריך כמו שיטה זו היא כמותית. החיסרון העיקרי שלה הוא כי הרדיואקטיביות הקשורה הגישה דורשת טיפול בזהירות. שיטות חלופיות אפשריות גם על בסיס מדידה של מצעים הפלורסצנט או של פפטיד ומנצלים את המאפיינים של פלורסנט משתנה/זורח על זירחון. שיטות כאלה גם לאפשר תפוקה גבוהה, אשר נדרש, למשל, בהקרנה של מולקולות שעלולות להיות מעכבי פוטנציאליים של קינאז היעד. אכן, הקינסים מייצגים את אחד השיעורים הגדולים ביותר של מטרות הסמים שנרדף על ידי חברות התרופות16.
במחקר זה, אנו מתמקדים LIMK2-1 חלבון (LIMK2-1 מייצג Lin11, Isle1, Mec3 קינאז isoform 2-1). חלבון LIMK2 קינאז תואר לראשונה ב-199517. שלושה איזוצורות של LIMK2 מיוצרים על ידי שחבור חלופיים: LIMK2a, LIMK2b ו LIMK2 -1. כיום, LIMK2-1 תוארה רק ברמת mRNA במחקר אחד18. להלן, אנו מגדירים את החלבון החדש הזה של קינאז ברמה המולקולרית, תוך שימוש בגישות ביוכימיות חזקות. ראשית, אנו להדגים כי LIMK2-1 אכן מסונתז. בדומה לשני עמיתיהם, LIMK2a ו-LIMK2b, היא מקיימת אינטראקציה עם ROCK קינאז במעלה (Rho-חלבון קינאז). אנו מראים LIMK2-1 יש פעילות קינאז על חלבון המיאלין Basic (MBP), אבל לא על קופפלין, המצע קאנוני של LIM.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, השתמשנו בכלים ביוכימיים חזקים כדי לאפיין ברמה המולקולרית חלבון חדש, LIMK2-1, האמינו להיות קינאז מבוסס על הרצף שלה ועל יומני ההומויום שלה, LIMK2a ו LIMK2b20.
ראשית, הדגמנו את קיומו של LIMK2-1 ברמת החלבון באמצעות ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי. בעקבות זאת, הערכנו את ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי La ligue דשנה סרטן, l ‘ האגודה נוירופיבאטוטוסס ורקלינגהאוזן, ואת מרכז העיר וואל דה לואר. תודות לAurélie קסון ולדבוראה קסס לגבי מידע מעמיק של כתבי היד ולקיירון היקמן-לואיס.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. . The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al. Let There Be Light!. Proteomes. 4, (2016).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
