Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne
Summary
We kenmerkten een nieuwe kinase eiwit met behulp van robuuste biochemische benaderingen: Western Blot analyse met een dedicated specifieke antilichaam op verschillende cel lijnen en weefsels, interacties door coimmunoprecipitation experimenten, kinase activiteit gedetecteerd door westerse Vlek gebruikend een phospho-specifiek antilichaam en door γ [32P] ATP etikettering.
Abstract
Het uitgebreide gehele genoom rangschikken heeft vele open lezings kaders (ORFs) geïdentificeerd die vele potentiële proteïnen verstrekken. Deze eiwitten kunnen belangrijke rollen voor de cel en kunnen ontrafelen nieuwe cellulaire processen. Onder eiwitten, kinases zijn belangrijke acteurs als ze behoren tot cel signalering paden en hebben de mogelijkheid om in-of uitschakelen vele processen van cruciaal belang voor het lot van de cel, zoals celgroei, divisie, differentiatie, beweeglijkheid, en de dood.
In deze studie, concentreerden wij ons op een nieuwe potentiële kinase proteïne, LIMK2-1. Wij toonden zijn bestaan door westelijke vlek gebruikend een specifiek antilichaam aan. We evalueerden de interactie met een upstream regulerend eiwit met behulp van coimmunoprecipitation experimenten. Coimmunoprecipitation is een zeer krachtige techniek in staat om de interactie tussen twee doel eiwitten te detecteren. Het kan ook worden gebruikt om nieuwe partners van een aas proteïne te ontdekken. Het aas proteïne kan of via een markering worden gezuiverd die aan zijn opeenvolging of via een antilichaam wordt ontworpen dat specifiek het richt. Deze eiwitcomplexen kunnen vervolgens worden gescheiden door SDS-pagina (natrium dodecyl sulfaat Polyacrylamide gel) en geïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie. Immunoprecipitated LIMK2-1 werd ook gebruikt om zijn kinase activiteit in vitro te testen door γ [32P] ATP etikettering. Deze gerenommeerde assay kan gebruik maken van veel verschillende substraten, en gemuteerde versies van het aas kan worden gebruikt om de rol van specifieke residuen te beoordelen. De effecten van farmacologische agentia kunnen ook worden geëvalueerd, aangezien deze techniek zowel zeer gevoelig als kwantitatief is. Toch vereist de behandeling van radioactiviteit bijzondere voorzichtigheid. Kinase activiteit kan ook worden beoordeeld met specifieke antilichamen gericht op de phospho groep van het gemodificeerde aminozuur. Dit soort antilichamen zijn niet commercieel beschikbaar voor alle phospho gemodificeerde residuen.
Introduction
Voor vele decennia, zijn talrijke signalering trajecten opgehelderd en hun betrokkenheid bij cruciale cellulaire processen zoals celdeling, differentiatie, beweeglijkheid, geprogrammeerde celdood, immuniteit en Neurobiology, is aangetoond. Kinases spelen een belangrijke rol in deze signalering trajecten als ze vaak fijn reguleren hun activering of inactivatie en zijn onderdeel van voorbijgaande veelzijdige complexen die reageren op externe stimuli1,2,3. Mutatie en ontregeling van kinases vaak leiden tot ziekten bij de mens, en ze hebben daarom uitgegroeid tot een van de belangrijkste drug targets in de afgelopen 40 jaar4.
In deze context is het belangrijk om de kinase interactie met hun stroomopwaartse regulatoren of stroomafwaartse substraten te kunnen detecteren en nieuwe partners te identificeren. De reiniging van de affiniteit en Immunoprecipitation zijn zeer krachtige technieken voor de isolatie van eiwitcomplexen5. Het aas proteïne of kinase kan met een specifieke peptide opeenvolging worden geëtiketteerdd toestaand het gebruik van commerciële parels in combinatie met antilichamen die het peptide richten. Dit materiaal laat een hoge reproduceerbaarheid toe in experimenten6,7,8. Endogene proteïnen kunnen ook worden immunoprecipitated gebruikend antilichamen die direct het aas proteïne richten. De antilichamen kunnen cross-linked aan proteïne A of proteïne G agarose parels of eenvoudig met deze parels voorafgaand aan het toevoegen van lysate worden uitgebroed. Lysis buffers moeten worden geoptimaliseerd om proteïne oplosbaar maken te laten zonder interactie te verliezen en eiwit degradatie te vermijden. Een belangrijk nadeel van deze aanpak is dat de interactie wordt gedetecteerd op Cell Lysis; Daarom kunnen voorbijgaande of zwakke interacties, samen met die die subcellulaire context vereisen worden gemist. Andere technieken kunnen worden gebruikt om direct te werken in de cel, zoals proximity afbinding assay (PLA)9, in vivo cross-linking-Assisted affiniteit zuivering (XAP)10, bioluminescentie resonantie energieoverdracht (BRET) of Förster resonantie energie Overdracht (fret)11,12. Bovendien is Immunoprecipitation niet geschikt om de thermodynamische constanten van de binding te bepalen, waarvoor fysische technieken zoals oppervlakte Plasmon resonantie, isotherme titratie calorimetrie of Microscale Thermophoresis zijn vereist 13,14.
Kinase activiteit kan worden beoordeeld met behulp van meerdere technieken. Hierin hebben we ons geconcentreerd op phospho antilichamen en in vitro γ [32P] ATP (adenosine trifosfaat) etikettering. Phospho-specifieke antilichamen richten de fosfaat wijziging van een bepaald residu binnen een proteïne. Zij kunnen in westelijke vlek of ELISA (enzym-verbonden ImmunoSorbent assay) na cel lysis, voor Immunohistochemistry, en ook op intacte cellen worden gebruikt gebruikend Stroom Cytometry of immunofluorescentie. Hun nadelen kunnen hun gebrek aan specificiteit omvatten, die kan worden geëvalueerd gebruikend een gemuteerde versie van de doel proteïne, en hun die niet commercieel beschikbaar voor alle proteïnen zijn. In vitro γ [32P] ATP labeling is een zeer robuuste, goed gevestigde en zeer gevoelige methode15. Immunoprecipitated of recombinante eiwitten kunnen worden gebruikt, en verschillende substraten kunnen worden getest. De effecten van drugs kunnen ook worden beoordeeld als deze methode is kwantitatief. Het belangrijkste nadeel is dat de radioactiviteit in verband met de aanpak vereist behandeling met voorzichtigheid. Alternatieve methoden zijn ook mogelijk op basis van de meting van fluorescerende of lichtgevende peptide substraten en gebruik te maken van gewijzigde TL/lichtgevende eigenschappen op phosphorylation. Dergelijke methoden kunnen ook een hoge doorvoersnelheid, die nodig is, bijvoorbeeld in de screening van moleculen die kunnen worden potentiële remmers van de doelgroep kinase. Inderdaad, kinases vertegenwoordigen een van de grootste klassen van drugs doelstellingen nagestreefd door farmaceutische bedrijven16.
In deze studie concentreerden we ons op de LIMK2-1 proteïne (LIMK2-1 staat voor Lin11, Isle1, Mec3 kinase isovorm 2-1). De LIMK2 kinase proteïne werd voor het eerst beschreven in 199517. Drie isovormen van LIMK2 worden geproduceerd door alternatieve splicing: LIMK2a, LIMK2b en LIMK2-1. Momenteel, is LIMK2-1 slechts beschreven op het niveau mRNA in één enkele studie18. Hierin karakteriseren we deze potentiële nieuwe kinase proteïne op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen. Ten eerste tonen we aan dat LIMK2-1 inderdaad gesynthetiseerd is. Gelijkaardig aan zijn twee tegenhangers, LIMK2a en LIMK2b, communiceert het met de stroomopwaarts kinase rots (Rho-bijbehorend proteïne kinase). We tonen LIMK2-1 heeft een kinase activiteit op myeline Basic protein (MBP), maar niet op cofilin, de canonieke substraat van LIM kinases.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin hebben we gebruik gemaakt van krachtige biochemische instrumenten te karakteriseren op moleculair niveau een nieuw eiwit, LIMK2-1, vermoedelijk een kinase gebaseerd op de volgorde en op de homologsen, LIMK2a en LIMK2b20.
Ten eerste, toonden wij het bestaan van LIMK2-1 op het eiwit niveau gebruikend westelijke vlek analyse met een specifiek antilichaam. Na dit, evalueerden wij zijn interactie met het stroomopwaarts kinase ROCK1, dat gekend is om LIMK2a en LIMK2b, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door la Ligue contre le cancer, l’Association neurofibromatoses et Recklinghausen, en la Région Centre Val de Loire. Veel dank aan Aurélie Cosson en Déborah Casas voor flow Cytometry Data, en naar Keyron Hickman-Lewis voor grondige proeflezen van het manuscript.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. . The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al. Let There Be Light!. Proteomes. 4, (2016).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
