توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد
Summary
وصفنا بروتين كيناز جديد باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية: تحليل وصمة عار الغربية مع الأجسام المضادة مخصصة محددة على خطوط الخلايا المختلفة والأنسجة، والتفاعلات من قبل التجارب coimmunoprecipitation، نشاط كيناز الكشف عن طريق الغربية وصمة عار باستخدام الأجسام المضادة الفوسفاتية محددة وعن طريق γ [32P ] ATP وسم.
Abstract
وقد حددت تسلسل الجينوم كله واسعة النطاق العديد من إطارات القراءة المفتوحة (ORFs) توفير العديد من البروتينات المحتملة. هذه البروتينات قد يكون لها أدوار هامة للخلية، وقد تكشف عن عمليات خلوية جديدة. بين البروتينات, kinases هي الجهات الفاعلة الرئيسية لأنها تنتمي إلى مسارات إشارة الخلية ولها القدرة على تشغيل أو إيقاف العديد من العمليات الحاسمة لمصير الخلية, مثل نمو الخلايا, تقسيم, التمايز, الحركة, والموت.
في هذه الدراسة، ركزنا على بروتين كيناز محتمل جديد، LIMK2-1. لقد أثبتنا وجودها بواسطة بلوت الغربية باستخدام الأجسام المضادة محددة. قمنا بتقييم تفاعلها مع بروتين ما قبل الإنتاج المنظم باستخدام تجارب التهطال المناعية. Coimmunoprecipitation هو تقنية قوية جدا قادرة على الكشف عن التفاعل بين اثنين من البروتينات المستهدفة. ويمكن أيضا أن تستخدم للكشف عن شركاء جدد من بروتين الطعم. يمكن تنقية بروتين الطعم إما عن طريق علامة مصممة لتسلسلها أو عن طريق الأجسام المضادة التي تستهدفه على وجه التحديد. ويمكن بعد ذلك فصل هذه المجمعات البروتينية بواسطة SDS-PAGE (الصوديوم دوديكل كبريتات بولي أكريلاميد هلام) وتحديدها باستخدام الطيف الكتلي. كما تم استخدام LIMK2-1 المناعي لاختبار نشاطكيفي في المختبر عن طريق γ[32P] ATP وسم. وقد يستخدم هذا الخضوع الراسخ العديد من الركيزة المختلفة، ويمكن استخدام نسخ من الطعم المتحولة لتقييم دور المخلفات المحددة. ويمكن أيضا تقييم آثار العوامل الدوائية لأن هذه التقنية هي على حد سواء حساسة للغاية وكمية. ومع ذلك، يتطلب التعامل مع النشاط الإشعاعي الحذر بشكل خاص. ويمكن أيضا تقييم نشاط كيناز مع الأجسام المضادة محددة تستهدف مجموعة فوسفو من الأحماض الأمينية المعدلة. هذه الأنواع من الأجسام المضادة ليست متاحة تجاريا لجميع بقايا الفوسفو المعدلة.
Introduction
على مدى عقود عديدة، تم توضيح العديد من مسارات الإشارات وأظهرت مشاركتها في العمليات الخلوية الحاسمة مثل تقسيم الخلايا، والتمايز، والحركة، وموت الخلايا المبرمجة، والمناعة وعلم الأحياء العصبية. Kinases تلعب دورا هاما في هذه المسارات إشارة كما أنها غالبا ما تنظم بدقة تنشيطها أو تعطيل هات هي جزء من المجمعات متعددة الاستخدامات العابرة التي تستجيب للمحفزات الخارجية1,2,3. الطفرة وخلل التنظيم من الكيناز غالبا ما يؤدي إلى أمراض في البشر، وبالتالي فقد أصبحت واحدة من أهم أهداف المخدرات على مدى السنوات الأربعين الماضية4.
وفي هذا السياق، من المهم أن تكون قادرة على الكشف عن تفاعل الكيناز مع الجهات التنظيمية في المراحل الأولى أو الركيزة النهائية، وتحديد شركاء جدد. تنقية التقارب والمناعية هي تقنيات قوية جدا لعزل مجمعات البروتين5. قد يكون المفتاح البروتين الطعم أو كيناز الموسومة مع تسلسل الببتيد محددة مما يسمح باستخدام الخرز التجاري التكافؤ إلى جانب الأجسام المضادة التي تستهدف الببتيد. هذه المادة تسمح بتكرار عاليةفي التجارب 6،7،8. البروتينات الذاتية قد تكون أيضا ً مناعية باستخدام الأجسام المضادة التي تستهدف مباشرة بروتين الطعم. الأجسام المضادة قد تكون مرتبطة عبر البروتين A أو البروتين G أغروز الخرز أو ببساطة حاضنة مع هذه الخرز قبل إضافة lysate. يجب تحسين المخازن المؤقتة للتحلل للسماح بذوبان البروتين دون فقدان التفاعل وتجنب تدهور البروتين. ومن العيوب الرئيسية لهذا النهج أن التفاعل يتم الكشف عنه عند الخلايا اللايائية؛ ولذلك، قد غاب عن التفاعلات عابرة أو ضعيفة، جنبا إلى جنب مع تلك التي تتطلب السياق دون الخلوي. ويمكن استخدام تقنيات أخرى للعمل مباشرة في الخلية مثل ربط القرب (PLA)9، في الجسم الحي عبر ربط بمساعدة تنقية التقارب (XAP)10، الحيوي الرنين نقل الطاقة (BRET) أو فورستر الرنين الطاقة نقل (FRET)11،12. وعلاوة على ذلك، فإن الترسيب المناعي ليس مناسباً لتحديد الثوابت الديناميكية الحرارية للربط، والتي تتطلب تقنيات فيزيائية مثل “بلازمون السطح” أو قياس المعايرة الحرارية الإسمترية أو الميكرومتراتي 13,14.
ويمكن تقييم نشاط كيناز باستخدام تقنيات متعددة. هنا، ركزنا على الأجسام المضادة الفوسفو محددة وغاما في المختبر[32P] ATP (أدينوسين ثلاثي الفوسفات) وسم. تستهدف الأجسام المضادة الخاصة بالفوسفو تعديل الفوسفات لبقايا معينة داخل البروتين. ويمكن استخدامها في غرب Blot أو ELISA (اختبار المناعة المرتبطة انزيم) بعد تحليل الخلايا، للكيمياء المناعية، وأيضا على الخلايا السليمة باستخدام تدفق الخلايا أو الفلور المناعي. قد تشمل عيوبها افتقارها إلى التحديد، والتي يمكن تقييمها باستخدام نسخة متحولة من البروتين المستهدف، وعدم توافرها تجاريا لجميع البروتينات. في المختبرγ[32P] ATP وسم هو وسيلة قوية جدا، راسخة وحساسة للغاية15. ويمكن استخدام البروتينات المناعية أو المؤتلفة، ويمكن اختبار ركائز مختلفة. ويمكن أيضا تقييم آثار المخدرات لأن هذه الطريقة كمية. والعيب الرئيسي في ذلك هو أن النشاط الإشعاعي المرتبط بهذا النهج يتطلب التعامل بحذر. طرق بديلة ممكنة أيضا على أساس قياس الفلور أو الركيزة الببتيد الإنارة والاستفادة من خصائص الفلورسنت /الانارة المعدلة على الفوسفور. وتتيح هذه الأساليب أيضاً إنتاجية عالية، وهو ما هو مطلوب، على سبيل المثال، في فحص الجزيئات التي قد تكون مثبطات محتملة للكيناز المستهدف. في الواقع، تمثل الكيناز واحدة من أكبر فئات أهداف الأدوية التي تسعى شركات الأدوية16.
في هذه الدراسة، ركزنا على بروتين ليمك2-1 (ليمك2-1 لتقف على Lin11، Isle1، Mec3 Kinase isoform 2-1). تم وصف بروتين كيناز ليمك2 لأول مرة في عام 199517. يتم إنتاج ثلاثة أشكال متساوية من LIMK2 بواسطة الربط البديل: LIMK2a، LIMK2b و LIMK2-1. في الوقت الحاضر، تم وصف LIMK2-1 فقط على مستوى مرنا في دراسة واحدة18. هنا، نحن نميز هذا البروتين كيناز الجديدة المحتملة على المستوى الجزيئي باستخدام النهج البيوكيميائية قوية. أولا، نحن نبرهن على أن LIMK2-1 هو في الواقع توليفها. على غرار نظيراتها اثنين، LIMK2a وLIMK2b، فإنه يتفاعل مع كيناز المنبع روك (رو المرتبطة البروتين كيناز). نظهر LIMK2-1 لديه نشاط كيناز على البروتين الأساسي الميلين (MBP)، ولكن ليس على cofilin، الركيزة الكنسية من كيناز ليم.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، استخدمنا أدوات كيميائية حيوية قوية لوصف على المستوى الجزيئي بروتين جديد، LIMK2-1، ويعتقد أن يكون كيناز على أساس تسلسلها وعلى homologs لها، LIMK2a و LIMK2b20.
أولا، أظهرنا وجود LIMK2-1 على مستوى البروتين باستخدام تحليل وصمة عار الغربية مع الأجسام المضادة محددة. بعد ذلك، قمن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل رابطة مكافحة السرطان، ورابطة الأورام العصبية الليفية وريكلينغهاوزن، ومركز لا ريجيون فال دي لوار. شكراجزيلا لأوريلي كوسون وديبورا كاساس لبيانات قياس التدفق السيتومتري، وإلى كيرون هيكمان لويس لتنقيح المخطوطة.
Materials
| Antibody anti-actin | Sigma-Aldrich | A1978 | for Western Blot |
| Antibody anti-c-Myc | Invitrogen | MA1-21316 | for Western Blot |
| Antibody anti-cofilin | Cell signaling Technology | 3312/5175 | for Western Blot |
| Antibody anti-GFP | Santa Cruz | sc-9996 | for Western Blot |
| Antibody anti-HA | Roche Applied Science | 11687423001 | for Western Blot |
| Antibody anti-phospho-cofilin | Cell signaling Technology | 3313 | for Western Blot |
| Antibody Anti-PP1i | Eurogentec | designed for this study | for Western Blot |
| Aprotinin | Euromedex | A-162B | for lysis buffer |
| ATP | Invitrogen | PV3227 | for g[32P] labeling |
| g[32P] ATP | Perkin Elmer | NEG502A | for g[32P] labeling |
| BES buffered saline | Sigma-Aldrich | 14280 | for transfection |
| b-glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | for lysis and kinase buffer |
| b-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | for Laemmli |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3059 | for blocking buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | for Laemmli |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | for transfection |
| Centrifuge | Sigma | 111-541 | |
| Collagen R | Pan Biotech | P06-20166 | for transfection |
| Control siRNA | Ambion | AM4611 | for PP1i antibody specificity |
| Coomassie PageBlue Protein Staining Solution | Thermo-Fisher | 24620 | for gel staining |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3690 | for lysis buffer |
| Electrophoresis Unit | Biorad | Mini-Protean | for Western Blot |
| EZview Red anti-HA affinity gel | Sigma-Aldrich | E6779 | for immunoprecipitation |
| GeneSys software | Ozyme | for Western Blot acquisition | |
| GeneTolls software | Ozyme | for Western Blot quantification | |
| GFP-trap beads | Chromtek | for immunoprecipitation | |
| Glycine | Euromedex | 26-128-6405 | for transfer buffer |
| GST-cofilin | Upstate Cell signaling | 12-556 | for g[32P] labeling |
| Hamilton syringe 100 mL | Hamilton | 710 | to remove carefully supernatant from beads without aspirating them |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | for kinase buffer |
| ImageQuant TL software | GE Healthcare | for radioactivity acquisition and quantification | |
| LIMK2 siRNA | Ambion | s8191 | for PP1i antibody specificity |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | SP-04-2217 | for lysis and kinase buffer |
| MBP | Upstate Cell signaling | 13-173 | for g[32P] labeling |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | for kinase buffer |
| MnCl2 | Sigma-Aldrich | 244589 | for kinase buffer |
| NaCl | Euromedex | 1112 | for lysis and kinase buffer |
| NaF | Sigma-Aldrich | S-1504 | for lysis and kinase buffer |
| Okaidic acid | Euromedex | 0-2220 | for lysis buffer |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | for lysis and kinase buffer |
| p-nitrophenylphosphate | Euromedex | 1026 | for lysis buffer |
| PVDF membrane Immobillon-P | Merck-Millipore | IPVH00010 pore size 0,45 mm | for Western Blot |
| Rotating wheel | Labinco | for bead incubation | |
| Safe lock eppendorf | Eppendorf | 0030120.086 | for kinase assay |
| SDS | Sigma-Aldrich | 5030 | for Laemmli and migration buffer |
| Sodium orthovanadate | LC Laboratories | S8507 | for lysis and kinase buffer |
| Sodium pyrophosphate | Fluka | 71501 | for lysis buffer |
| Super Signal West Dura | Protein Biology | 34075 | for Western Blot |
| Syngene Pxi | Ozyme | for Western Blot | |
| Tissue extracts |
Biochain |
P1234035 Brain P12345152 Lung P1234149 Liver P1234188 Pancreas P1234260 Testis |
for Western Blot analysis |
| Transfer Unit | Biorad | Mini-Trans-Blot | for Western Blot |
| Tris | Euromedex | 26-128-3094 B | for lysis buffer |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949 | for blocking buffer |
| Typhoon FLA9500 | GE Healthcare | to read autoradiography | |
| Typhoon Trio | Amersham Bioscience | to read autoradiography | |
| Whatman paper | GE Healthcare | 3030-672 | for Western Blot |
References
- Manning, G., Plowman, G. D., Hunter, T., Sudarsanam, S. Evolution of protein kinase signaling from yeast to man. Trends in Biochemical Sciences. 27, 514-520 (2002).
- Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. . The protein kinase complement of the human genome. 298, 1912-1934 (2002).
- Ochoa, D., Bradley, D., Beltrao, P. Evolution, dynamics and dysregulation of kinase signalling. Current Opinion in Structural Biology. 48, 133-140 (2018).
- Bhullar, K. S., et al. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions. Molecular Cancer. 17, 48 (2018).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, 349-364 (2008).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Petersen, G. E., Pedersen, J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expression and Purification. 48, 1-13 (2006).
- Wood, D. W. New trends and affinity tag designs for recombinant protein purification. Current Opinion in Structural Biology. 26, 54-61 (2014).
- Young, C. L., Britton, Z. T., Robinson, A. S. Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications. Biotechnology Journal. 7, 620-634 (2012).
- Greenwood, C., et al. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
- Wang, X., Huang, L. Dissecting Dynamic and Heterogeneous Proteasome Complexes Using In vivo Cross-Linking-Assisted Affinity Purification and Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1844, 401-410 (2018).
- Raykova, D., et al. Let There Be Light!. Proteomes. 4, (2016).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7, 401-409 (2010).
- Podobnik, M., et al. How to Study Protein-protein Interactions. Acta Chimica Slovenica. 63, 424-439 (2016).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Peck, S. C. Analysis of protein phosphorylation: methods and strategies for studying kinases and substrates. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 45, 512-522 (2006).
- Jia, Y., Quinn, C. M., Kwak, S., Talanian, R. V. Current in vitro kinase assay technologies: the quest for a universal format. Current Drug Discovery Technologies. 5, 59-69 (2008).
- Okano, I., et al. Identification and characterization of a novel family of serine/threonine kinases containing two N-terminal LIM motifs. The Journal of Biological Chemistry. 270, 31321-31330 (1995).
- Croft, D. R., et al. p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton. Cell Research. 21, 666-682 (2011).
- Tastet, J., et al. LIMK2-1 is a Hominidae-Specific Isoform of LIMK2 Expressed in Central Nervous System and Associated with Intellectual Disability. Neuroscience. 399, 199-210 (2019).
- Vallee, B., et al. LIMK2-1, a new isoform of human LIMK2, regulates actin cytoskeleton remodeling via a different signaling pathway than that of its two homologs, LIMK2a and LIMK2b. The Biochemical Journal. 475, 3745-3761 (2018).
- Lee, Y. C., et al. Impact of Detergents on Membrane Protein Complex Isolation. Journal of Proteome Research. 17, 348-358 (2018).
