超低入力キャリア-CAGEを使用した転写開始サイトマッピング

1. キャリアの準備 インビトロ転写のためのDNAテンプレートの調製 水の41 μL、5x HFバッファーの20 μL、2.5 mM dNTPの8 μL、10 μLの10 μLの10 μLのユニークなフォワードプライマー(PCR_GN5_f1、表2;プライマーを水に溶解し、希釈する)を組み合わせて、各PCRテンプレートのPCRミックスを準備します。、合成担体遺伝子および1μLプシオンポリメラーゼを含有する2ng/μLテンプレートプラスミドの10μL。ピペッティングでPCRミックスを混ぜます。すべての10のテンプレートのためのマスターミックスは、一度に準備することができます(11の反応のために準備)。 各10 μM リバースプライマーの 10 μL に PCR ミックスの 90 μL を追加します (PCR_N6_r1-r10,表2)。ピペッティングで混ぜます。 PCRは、次のプログラムを使用してテンプレートを増幅します:60sのための98 °C、(10sのための98 °C、30sのための50 °C、30sのための72 °C)35サイクル、10分間の72 °C、4 °Cで保持します。 PCR増幅DNAテンプレートのゲル精製 1%のアガロースゲルを準備します(低溶融アガロースが推奨されます)。 体積を下げるには、低中温(30~40°C)で真空濃縮器を使用して、PCR反応混合物を100μLから20μLの総体積に濃縮します。 6倍の荷重染料の6 μLを加え、よく混ぜ、ゲルに負荷を加えます。使用済みの電気泳動タンク(5~10V/cm)に適した電圧で、1x TAEバッファで30分間電気泳動を実行します。並行して100 bpまたは1,000 bp DNAはしごを実行します。 きれいなメスを使用して、ターゲットPCR製品を含むゲルスライスを切除する。余分なアガロースゲルを避けてください。(製造元の指示に従って)ゲル抽出キットを使用してPCR製品を浄化します。注:アガロースゲルから単離されたDNAのA260/A230比は、通常低い(0.1~0.3)。期待される対象製品および副産物を図 2Aに示します。100 μL PCR反応からの期待降伏は1.2~3 μgです。 キャリア分子のインビトロ転写 製造業者の指示に従ってT7 RNAポリメラーゼを用いてインビトロでキャリアRNAを転写する。10~20 μLの反応を設定します(推奨キットは材料の表にあります)。 RNA精製キットを使用してインビトロ転写RNAを精製します。DNase Iを使用して溶液中にDNA消化を設定し、メーカーの標準的な指示に従い、50μLの水でRNAを溶出します。溶出収率を上げるには、遠心分離の前に5分間カラムに水を残します。注:カラムの最大結合容量を超えないように注意してください(材料の表に記載されているキットでは、容量は最大100 μgです)。PCRテンプレート1~10(長さ1kbp~200bp)からの期待収量は、インビトロ転写反応で10μLから25~50μgです。反応は、キャリア分子のより大きなストックを得るためにスケールアップすることができます。 インビトロ転写キャリアRNA分子のキャッピング キャッピングミックスを10倍キャッピングバッファーの2μL、10mM GTPの1μL、2mM SAMの1μL(新規希釈)、およびキャリアRNA当たりワクシナキャッピング酵素の1μLを組み合わせてキャッピングミックスを調製します。 各キャリア分子の最大10 μgを総体積の15μLに混合し、65°Cで10分間変性する。二次構造の形成を防ぐために、すぐに氷の上に置きます。 変性キャリアRNAをキャッピングミックスの5μLと混合し、37°Cで1時間インキュベートします。 RNA精製キットを使用してキャップされたRNA分子を精製する – 製造元のクリーンアッププロトコルに従ってください。水の30 μLで溶出RNA。溶出収率を上げるには、遠心分離の前に5分間カラムに水を残します。注:マイクロボリューム分光光度計を用いて濃度を測定します。期待される A260/A280 の比率は >2、A260/A230 は >2 です。一部のRNAサンプルでは、A260/A230が1.3~2の間であってもよいことに注意してください。上限なしRNAの10 μgを使用した場合の期待収率は、キャップされたRNAの9~10 μgです。 表 3に記載されている金額を組み合わせて、上限と上限なしのキャリアの組み合わせを準備します。チューブをフリックしてよく混ぜ、マイクロボリューム分光光度計を使用して濃度を測定します。注:キャリアのより高い濃度が逆転写反応に収まるように必要な場合(下記参照)、キャリアミックスは、所望の最終濃度に達するまで低中温(30〜35°C)で真空濃縮器を使用して濃縮することができる。ステップ2-14は、村田ら11によって報告された標準的なnAnT-iCAGEプロトコルから変更される 2. 逆転写 RTプライマーの1 μL(水に溶解した2.5mM TCT-N6、配列については補足表1を参照)、目的の総RNAの10ng、および低結合PCRプレート内の総体積の10μLのキャリアミックス(表3)の4,990ngngを組み合わせます。チューブをフリックして混ぜます。注:サンプルRNAが逆転転写のために希釈しすぎる場合(下記参照)、それをキャリアの適切な量と組み合わせ、真空濃縮器を使用して9μL総容積に濃縮し、RTプライマーの1 μLを追加する。キャリアアールを添加し、合計で5μgのRNAに達すると、サンプル損失を防ぎます。 ステップ2.1から65°Cで5分間加熱し、すぐに氷の上に置き、発色を防ぎます。 逆転写(RT)ミックスを調記する。 各サンプルは、水の6.1 μL(RNase-およびDNaseフリー)、5xファーストストランドバッファの7.6 μL、0.1 M DTTの1.9 μL、10mM dNtPの1μL、トレハロース/ソルビトールミックスの7.6 μL(ムラタら11のレシピを参照)、および3.8μLを組み合わせたもの(ムラタら11のレシピを参照)。6>材料のテーブル)チューブをフリックしてよく混ぜます。 RNA、キャリア、RTプライマーの10 μL(総体積38μL)を持つPCRチューブにRTミックスの28 μLを追加します。ピペッティングでよく混ぜます。注:トレハロース/ソルビトールによるミックスは粘性が高い。目に見えて均質になるまで混ぜます。 次のプログラムを使用して熱サイクラーでインキュベート:30sのための25 °C、60分間50 °C、4 °Cで保持します。 CDNAの精製:SPRI磁気ビーズを用いたRNAハイブリッド 推奨されるRNAseおよびDNaseフリーSPRIビーズの68.4 μLをRTミックスの38 μLに加えます(ビーズ対サンプル比1.8:1)。ピペッティングでよく混ぜ、室温(RT)で5分間インキュベートします。 5分間磁気スタンドのビーズを分離し、上清を捨て、70%エタノールの200 μLでビーズを2回洗います(作りたて)。注:エタノールは混合せずにビーズに添加され、チューブが磁気スタンド上にある間。添加したエタノールは直ちに除去される。それはサンプル損失につながる可能性があるため、洗い出し中にビーズを失わないように注意する必要があります。 チューブがまだ磁気スタンドにある間、エタノールの痕跡をすべて取り除きます。エタノールの液滴は、P10ピペットを使用してチューブから除去し、押し出すことができます。ビーズを乾燥させないようにしてください。 ビーズに37°Cで予熱した水の42 μLをビーズに加え、60倍上下にピペッティングしてサンプルを溶出させます。注:発泡体中のビーズ(結合サンプル)の損失を引き起こす可能性があるため、ピペッティングによって発泡を引き起こさないように注意してください。 蓋なしで37°Cで5分間インキュベートし、微量のエタノールを蒸発させてください。 磁気スタンドのビーズを5分間分離し、上清を新しいプレートに移します。注:ビーズの持ち越しを避けながら、サンプルの損失を防ぐためにすべての上清を取得してみてください。P10ピペットを使用して、最後のサンプル液滴を取得します。 3. 酸化 精製されたRT反応に1 M NaOAc(pH 4.5)の2 μLを加えます。ピペッティングで混合し、250 mM NaIO4の2 μLを追加し、再び混ぜます。 氷の上で45分間インキュベートし、光を避けるためにアルミホイルでプレートを覆います。 酸化ミックスに16μLのトリス-HCl(pH 8.5)を加えてpHを中和します。 酸化cDNA:SPRI磁気ビーズを用いてRNAハイブリッドを精製する。酸化ミックスの60 μLにSPRIビーズの108 μLを加えます(サンプル比に1.8:1ビーズ)。手順 2.6.1 ~ 2.6.6 に記載されているように、精製を繰り返します。42μLの水を用いて37°Cに予熱した溶出量。注:NaIO4の1mg当たり18.7μLの水を加えて250mM NaIO4を作り出します。NaIO4は光に敏感です。したがって、溶液はアルミ箔で覆われたチューブまたは耐光管に保管してください。 4. バイオチニル化 精製酸化試料を含むチューブに1M NaOAc(pH 6.0)の4 μLを加え、ピペッティングで混合します。 10mMビオチン溶液の4 μLを加え、ピペッティングで混合し、光を避けるために熱サイクラーで23°Cで2時間インキュベートします。注:50mgのビオチンを13.5mLのDMSOと混合してビオチン溶液を調作する。単一使用のアリコートを作り、-80 °Cで凍結します。 SPRI磁気ビーズを用いてバイオチン化cDNA:RNAハイブリッドを精製する。2プロパノールの12 μLを追加し、ピペッティングで混合します。SPRIビーズの108 μL(サンプル比に1.8:1ビーズ)を追加し、手順2.6.1-2.6.6に記載されているように精製を繰り返します。42μLの水を37°Cで予熱した水を用いて溶出する。注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルは-80 °Cで凍結します。 5. RNase I ディディステリオン 10x RNase Iバッファーの4.5 μLを各サンプルあたり0.5 μLのRNase I(10 U/μL)と混合してRNase I混合を調調します。ピペッティングで混ぜます。 各精製サンプルにミックスの5 μLを加えます(合計で45μL)。ピペッティングで混合し、37°Cで30分間インキュベートします。 6. ストレプトアビジンビーズの調製 各サンプルについて、ストレプトアビジンビーズスラリーの30μLを20mg/mL tRNAの0.38 μLと混合します。氷の上で30分間インキュベートし、チューブをフリックして5分ごとに混ぜます。注:ボトルをフリックしてピペッティングする前に、ストレプトアビジンビーズスラリーを再中断します。tRNA溶液は、村田ら11に従って調製する必要がある。 磁気スタンドのビーズを2~3分間分離し、上清を取り除きます。 15 μLのバッファーAでビーズを洗い直し、磁気スタンドのビーズを2~3分間分離し、上清を取り除きます。洗浄を繰り返し、上清を取り除きます。 ビーズをバッファーAの105μLで再中断し、tRNAの20mg/mLの0.19 μLを加える。ピペッティングでよく混ぜます。注:ビーズは、使用する前に新鮮に準備する必要があります。RNase I消化中にビーズの調製を開始します。複数のサンプルのために単一の管で一緒にビーズを準備する。 7. キャップトラップ サンプルバインディング RNase I処理試料の45μLに、調製されたストレプトアビジンビーズの105μLを添加する。ピペッティングでよく混ぜ、37°Cで30分間インキュベートし、10分ごとにピペッティングしてミックスします。 磁気スタンドのビーズを2~3分間分離し、上清を取り除きます。 ビーズの洗浄 150 μLの洗浄バッファーAを追加し、ピペッティングでビーズを再サスペンドします。磁気スタンドのビーズを2~3分間分離し、上清を取り除きます。 洗浄バッファーBの150 μLを追加し、ピペッティングによってビーズを再中断します。磁気スタンドのビーズを2~3分間分離し、上清を取り除きます。 洗浄バッファーCの150 μLを追加し、ピペッティングによってビーズを再中断します。磁気スタンドのビーズを2~3分間分離し、上清を取り除きます。注:バッファBとCは37°Cに予熱する必要があります。洗浄バッファーA、B、Cのレシピは、村田ら11に記載されている。 cDNAリリース 58.5 μL の水と 10x RNase I バッファーの 6.5 μL を混合して、1x RNase I バッファーを準備します。 1x RNase Iバッファの35 μLでビーズを再中断します。95°Cで5分間インキュベートし、cDNAの再結結を防ぐために2分間氷の上に直接移します。圧力が高まるため飛び出す可能性があるため、氷への移動中に蓋を保持します。 磁気スタンドで2~3分間ビーズを分離し、上清を新しいプレートに移します。 1x RNase Iバッファの30 μLでビーズを再中断します。磁気スタンドのビーズを2~3分間分離し、上清を以前に採取した上清に移します(eluted cDNAの総体積は約65μLでなければなりません)。 8. RNase HおよびRNase I消化によるRNA除去 サンプルごとに、水の2.4 μL、10x RNase Iバッファーの0.5 μL、RNase Hの0.1 μL、およびRNase Iの2 μLを組み合わせます。 放出されたcDNAサンプルの65 μLにミックスの5 μLを加え、ピペッティングで混合します。37°Cで15分間インキュベートし、4°Cで保持します。 SPRI磁気ビーズを用いてRNase消化ミックスからcDNAを精製します。70μLの劣化反応に126μLのSPRIビーズを加え、ピペッティングで混合します。2.6.1-2.6.6のSPRIビーズ精製について説明されているように精製手順に従ってください。記載されているように37°Cで予熱した水の42μLを用いて溶出する。 10x RNase Iバッファの4.5 μLとRNase Iの0.5 μLを組み合わせてRNase Iミックスを準備します。 精製されたcDNAサンプルの40 μLにRNaseミックスの5 μLを加えます。ピペッティングで混合し、37 °Cでインキュベートし、30分間4°Cで保持します。 SPRI磁気ビーズを使用してサンプルを浄化します。45μLの分解反応に81μLのSPRIビーズを加え、ピペッティングにより混合します。2.6.1-2.6.6のSPRIビーズ精製について説明されているように精製手順に従ってください。記載されているように42μLの水を用いて溶出する。 9. 5′ リンカーのライゲーション 真空濃縮器を使用して精製されたcDNAサンプルを4μLに濃縮します。温度は30~35°Cに保ちます。ピペットを使用してボリュームをテストします。試料が乾燥して完全性を発した場合は、4μLの水を加えて溶解する。注:サンプルの損失を防ぐために完全性に乾燥を避ける方が良いです。 濃縮サンプルを95°Cで5分間インキュベートし、直ちに氷の上に2分間置き、発光を防ぎます。圧力の蓄積により蓋が飛び出す可能性があるため、チューブを移しながら蓋を保持します。 2.5 μM 5’リンカーの4 μLを5分間5分間5分間インキュベートし、直ちに2分間氷の上に置き、発色を防ぎます。 2.5 μM 5′ リンカーの 4 μL をサンプルの 4 μL と混合します。注:5′ リンカーは、補足表2、補足表3、補足表4、および補足表 5に従って準備する必要があります。10 μM 5′ リンカーを使用前に 100 mM NaCl を使用して 2.5 μM 濃度に希釈します。 混合5’リンカーとサンプルにライゲーションプリミックスの16 μL(材料の表を参照)を追加し、ピペッティングによってよく混合します。16 °Cで16時間インキュベートします。 SPRI磁気ビーズを使用してライゲーションミックスを浄化します。SPRI ビーズの 43.2 μL を追加し、手順 2.6.1 ~ 2.6.6 に従います。42μLの水を用いて説明したように溶出する予熱は37°Cで予熱した。 転移した上清(1.8:1ビーズをサンプル比)に72μLのSPRIビーズを加えて、ステップ9.6で精製を繰り返します。注:5’リンカーには、シーケンシング前に最大8つのサンプルのプールを可能にするバーコードが含まれています(ムラタら11および補足表1に記載されているように、8つのトリヌクレオチドバーコードが利用可能です)。 10. 3′ リンカーのライゲーション ステップ9.1で説明するように真空濃縮器を使用して、精製されたサンプルを4μLに濃縮します。 濃縮サンプルを95°Cで5分間インキュベートし、直ちに氷の上に2分間置き、発光を防ぎます。圧力の蓄積のためにふたが飛び出す可能性があるため、チューブを移しながら蓋を保持します。 2.5 μM 3′ リンカーの 4 μL を 65 °C で 5 分間インキュベートし、直ちに 2 分間氷の上に置き、発色を防ぎます。 濃縮サンプルの4μLに2.5 μM 3’リンカーの4 μLを追加します。 ライゲーションプレミックスの16 μLを追加し、ピペッティングによってよく混ぜます。16 °Cで16時間インキュベートします。 SPRI磁気ビーズを使用してライゲーションミックスを浄化します。SPRI ビーズの 43.2 μL を追加し、手順 2.6.1 ~ 2.6.6 に従います。42μLの水を用いて説明したように溶出する予熱水を37°Cに予熱した。注:3′ リンカーは、補足表 6および補足表 7に従って準備する必要があります。10μM 3’リンカーを100mM NaClを使用して2.5 μM濃度に希釈します。 11. 脱リン酸化 4 μL の水、10 倍の SAP バッファーの 5 μL、および SAP 酵素の 1 μL を組み合わせて SAP ミックスを準備します。 精製されたライゲーションサンプル(総体積50μL)にSAPミックスの10 μLを加え、サーモサイクラーでインキュベートします:30分間37°C、15分間65°C、4°Cで保持します。 12. ウラシル特異的切除酵素を用いた3’リンカー上鎖の劣化 脱リン酸化サンプルに2μLのウラシル特異的切除酵素(材料表参照)を加え、次のプログラムを使用してサーモサイクラーでピペッティングしてインキュベートして混合する:30分間37°C、5分間95°C、すぐに氷の上に2分間置く断片化した上鎖の再消し止めを防ぎます。 52 μl混合物にSPRI磁気ビーズの93.6 μLを加えて反応混合物を浄化し、ピペッティングによってよく混合します。精製手順を繰り返す 2.6.1 ~ 2.6.6.記載されているように37°Cで予熱した水の42 μLを有する溶出する。 13. 第2鎖合成 10x DNAポリメラーゼ反応バッファーの5 μL、水の2 μL、10mM dNTPの1 μL、50 μM nAnT-iCAGE第2ストランドプライマーの1μL(配列は補足表1)と1μLのDを組み合わせて、第2鎖合成ミックス(サンプル当たりの容積が発現)を調製するNAエキノールクレアーゼ欠損ポリメラーゼ(材料表の推奨ポリメラーゼを参照)。 精製サンプルにミックスの10 μLを追加し、ピペッティングによってよく混合します(総体積は50μLです)。次のプログラムを使用して熱サイクラーでインキュベート:5分間95°C、5分間55°C、30分間72°C、4°Cで保持します。 14. エキノクレアーゼIを用いた第2鎖合成プライマーの劣化 第2鎖合成混合物にエキノルクレアーゼIの1μLを添加する。ピペッティングでよく混ぜ、37°Cで30分間インキュベートし、その後4°Cで保持します。 エキノクレアーゼI処理試料の51μLにSPRI磁気ビーズの91.8 μLを添加して二重鎖DNAを精製します。2.6.1~2.6.6に記載の精製手順を繰り返します。42 μLの水を予熱して37°Cに溶出する。 ステップ9.1で説明するように、真空濃縮器を使用してサンプルを15 μLに濃縮します。 15. 品質と数量管理 濃縮されたサンプルの1 μLを使用し、DNA品質分析装置で高感度DNAチップを実行します。期待されるプロファイル/数量を図 3に示します。 16. キャリア劣化の第1ラウンド 水の2μL、10倍制限酵素バッファーの2μL、I-SceIの1μL、およびI-CeuIの1μLを組み合わせて分解ミックスを調製する。 濃縮試料の14μLに分解ミックスの6μLを加え、ピペッティングにより混合します。37°Cで3時間インキュベートし、その後65°Cで20分の不活性化を行い、4°Cで保持します。 SPRI磁気ビーズを使用して分解ミックスを浄化します。5 μLの水を加えて分解ミックスの体積を増やし、SPRIビーズの45μLを加えます(サンプル比に1.8:1ビーズ)。手順 2.6.1 ~ 2.6.6 に記載されているように、精製を繰り返します。42 μLの水を37°Cに予熱して溶出します。 工程9.1で説明したように、総体積の42μLから20 μLまで、エラ出したサンプルを濃縮します。 17. 劣化レベルの制御とPCR増幅サイクル数の決定 ライブラリ全体を増幅するための qPCR ミックス (アダプター ミックス) を準備します。水の3.8 μL、qPCRプレミックスの5 μL(2x)、10 μMアダプター_f1プライマーの0.1 μL(5′-AATGATACGCGACCACCGA-3′)、および10 μMアダプター_r1プライマーの0.1 μL(推奨される各qRの推奨材料)を組み合わせます。 ステップ16.4からサンプルの1 μLとqPCRアダプタミックスの9 μLを組み合わせ、ピペッティングによってよく混合します。 キャリア(キャリアミックス)に由来するDNAを増幅するためのqPCRミックスを調調します。3.8 μL の水、5 μL の qPCR プレミックス (2x)、10 μM キャリア_f1 プライマーの 0.1 μl (5′-GCGGCAGTGTTCGCTATAACACACACACAC-3′)、および各サンプルに対して 10 μM アダプター_r1 プライマーの 0.1 μL を組み合わせます。 工程16.4からサンプルの1 μLとqPCRキャリアミックスの9 μLを組み合わせ、ピペッティングによってよく混合します。 qPCR プログラムを設定する: 95 °C 3 分間 (20 s の場合は 95 °C、20 s では 60 °C、2 分間は 72 °C) を 40 倍繰り返し、続いて計器特異的な脱退曲線 (65~ 95 °C) を繰り返し、4 °C で保持します。注:サンプルを水に置き換えて、負のコントロールを準備します。 18. ターゲットライブラリのPCR増幅 6 μL の水、10 μM アダプター_f1 プライマーの 0.5 μL、10 μM アダプター_r1 プライマーの 0.5 μL、および 25 μL の PCR プレミックス (2 倍) を組み合わせて PCR 増幅ミックスを調作成します。ピペッティングでミックスします(推奨PCRプレミックスの材料表を参照)。 ステップ16.4からサンプルの18 μLにPCRミックスの32 μLを追加します。ピペッティングで十分に混ぜます。 PCR増幅を設定する:95 °Cを3分間、(20sで98°C、15sで60°C、2分間で72°C)12~18サイクル、72°Cを2分間、72°Cを2分間、4°Cで保持します。注:PCRサイクルの正確な数はqPCR結果によって決定され、アダプタープライマーミックスで得られたCt値に対応します(PCRサイクルの数はCt値と等しい)。 増幅されたサンプルの50μLにSPRI磁気ビーズの90 μLを加えて増幅したサンプルを精製し、ピペッティングで十分に混合します。手順 2.6.1 ~ 2.6.6 で説明する精製手順を繰り返します。記載されているように42 μLの水を使用してサンプルを溶出します。 19. キャリア劣化の第2ラウンド 手順 16.1 ~ 16.3 を繰り返します。 SPRI磁気ビーズを使用して分解ミックスを浄化します。サンプルに10 μLの水を加えて体積を増やし、SPRIビーズの30μL(サンプル比に対して1:1ビーズ)と混合します。手順 2.6.1 ~ 2.6.6 に記載されているように、精製を繰り返します。記載されているように37°Cで予熱した水の42 μLで溶出する。 総体積の42μLから30μLまで、エラ出したサンプルを濃縮します。 20. ライブラリサイズの選択 ステップ19.3からサンプルの30 μLとSPRI磁気ビーズの24 μLを混合します。(0.8:1 ビーズとサンプル比)。手順 2.6.1 – 2.6.6 に記載されているように、精製手順を繰り返します。記載されているように42 μLの水でサンプルを溶出します。 ステップ 9.1 で説明するように、サンプルを約 14 μL に濃縮します。 21. 品質管理 サイズ分布の評価 高感度DNAチップ上でサンプルの1 μLを実行します。期待される結果は図 4に示されています。注:200 bp より短いフラグメントが表示されている場合 (図 4A、Cの例を参照)、短いフラグメントが削除されるまでサイズ選択 (手順 20.1 ~ 20.2) を繰り返す必要があります (図 4B、D)。通常、サイズの選択の 1 つの追加のラウンドで十分です。短いフラグメントの量が厳しい場合 (図 4Cのように)、ビーズとサンプルの比率を 0.6:1 に減らす必要があります。 キャリア劣化品質管理 手順 17.1 ~ 17.5 を繰り返します。注:HS DNA チップラン(領域解析)で推定されるライブラリの濃度に応じて、サンプルはqPCRの前に希釈する必要があります。サンプルの損失を避け、水中で100~500倍希釈するためにサンプルの0.5 μLを使用します(希釈して1-20 pg/μL最終濃度)。アダプターとキャリアミックスで得られるCt値の予想差は5~10です。 ライブラリの定量 1x TE の 980 μL と 100 mg/mL ラムダ DNA 標準の 20 μL を混合することにより、ラムダ DNA 標準の作業希釈を調用します (DNA 定量キットに提供される 20x TE を希釈して調記します)。ラムダDNAの希釈は-20°Cで保存することができる。 補足表8に従って希釈されたラムダ標準および1x TEを混合してラムダDNA標準シリアル希釈を調出す。注:精度を高めるために、すべてのチューブに1x TEバッファーの100 μLを追加し、希釈されたラムダの体積ごとに必要に応じて1x TEボリュームを除去することをお勧めします。ライブラリの 1 μL を超える値を使用しないでください。この測定のための384の井戸版の使用は推薦される。