שעתוק מיפוי אתר התחל באמצעות כלוב קלט-נמוך-Super-נמוכה
Summary
כובע ניתוח של ג’ין ביטוי (קייג ‘) היא שיטה למיפוי כמותי רחב הגנום של mRNA 5 ‘ הקצוות ללכוד RNA פולימראז II שעתוק אתרי התחלה ברזולוציה יחיד-נוקלאוטיד. עבודה זו מתארת פרוטוקול קלט-נמוך (SLIC-קייג) עבור יצירה של ספריות באיכות גבוהה באמצעות ננוגרם-כמויות של RNA כולל.
Abstract
ניתוח כובע של ביטוי גנים (קייג ‘) הוא שיטה המשמשת עבור הזיהוי היחיד נוקלאוטיד ברזולוציה של RNA פולימראז II שעתוק אתרי התחלה (TSSs). זיהוי מדויק של TSSs מגביר זיהוי וגילוי של היזמים הליבה. בנוסף, משפרי פעיל ניתן לזהות באמצעות חתימות של שעתוק התעתיק דו-כיווני. המתואר כאן הוא פרוטוקול לביצוע כלוב המוביל של קלט סופר-נמוך (SLIC-כלוב). זה הסתגלות SLIC של פרוטוקול קייג ‘ ממזער הפסדים RNA על ידי הגדלת כמות ה-RNA באמצעות שימוש של שילוב מתורבת של RNA הנושא שנוספו למדגם של עניין, ובכך מאפשר הכנה לספרייה מ nanogram כמויות של סך רנ א (כלומר, אלפי תאים). הנושא מחקה את התפלגות החלק הצפוי של ספריית ה-DNA, ובכך מבטל בדיקות שעלולות להיגרם על ידי השפע של המנשא הומוגנית. בשלבים האחרונים של הפרוטוקול, המנשא מוסר באמצעות השפלה עם הטיות באנונותים וספריית היעד מוגברת. הספרייה לדוגמה היעד מוגן מפני השפלה, כמו האתרים האיתור endonuclease ארוך (בין 18 ו 27 bp), מה שהופך את ההסתברות של קיומם של הגנום איקריוטית נמוך מאוד. התוצאה הסופית היא ספריית דנ א מוכנה לרצף הדור הבא. כל השלבים בפרוטוקול, עד לרצף, ניתן להשלים תוך 6 ימים. הכנת המנשא דורשת יום עבודה מלא; עם זאת, ניתן להכין אותו בכמויות גדולות ולשמור קפוא ב-80 ° c. לאחר הרצף, ניתן לעבד את הקריאות כדי להשיג הגנום-כולו ברזולוציה אחת-נוקלאוטיד TSSs. TSSs ניתן להשתמש עבור יזם הליבה או גילוי משפר, מתן תובנה לתוך רגולציה גנים. לאחר הצבירה של היזמים, ניתן להשתמש בנתונים גם עבור פרופיל ביטוי 5 ממוקד.
Introduction
ניתוח כובע של ביטוי גנים (קייג ‘) היא שיטה המשמשת עבור יחיד-נוקלאוטיד ברזולוציה מיפוי הגנום-רחב של RNA פולימראז II שעתוק אתרי התחלה (TSSs)1. הטבע הכמותי שלה גם מאפשר ביטוי ממוקד של 5-end פרופיל. אזורים המקיפים את tsss (כ 40 bp במעלה ובמורד הזרם) הם היזמים ליבה ולייצג את המיקום הפיזי שבו RNA פולימראז II וגורמים שעתוק כללי לאגד (נבדקו בעבר2,3). מידע על מיקומים מדויקים של TSSs ניתן להשתמש עבור גילוי הליבה מיזם ועבור ניטור הדינמיקה של היזם. בנוסף לכך, כאשר משפרי פעילות מציגה חתימות של שעתוק דו-כיווני, ניתן להשתמש בנתוני כלוב גם לגילוי ולניטור של משפר הדינמיקה4. מתודולוגיה של קייג ‘ הוגדלה לאחרונה בזכות היישום הרחב שלה ולהשתמש בפרויקטים מחקר בפרופיל גבוה כגון קידוד5, modencode6, ו פנטאום פרויקטים7. בנוסף, מידע TSS מוכיח גם להיות חשוב להבחנה רקמה בריאה וחולה, כמו TSSs ספציפי למחלות ניתן להשתמש למטרות אבחון8.
למרות מספר שיטות עבור מיפוי TSS זמינים (קייג ‘, השתוללות, STRT, nanoCAGE, nanoCAGE-XL, oligo-סגירה), אנחנו ואחרים הראו לאחרונה כי קייג ‘ היא השיטה משוחדת ביותר כדי ללכוד TSSs אמיתי עם המספר הנמוך ביותר של תוצאות חיוביות שווא9 , 10. הפרוטוקול האחרון כלוב, הסדר-icage11, הוא הפרוטוקול המשוחדת ביותר עבור פרופיל tss, כפי שהוא מונע גזירה של שברי תגים קצרים באמצעות אנזימים הגבלה ואינו משתמש הגברה PCR. מגבלה של פרוטוקול ה-, המהווה את הדרישה לכמות גדולה של חומר התחלתי (למשל, 5 μg של RNA כולל לכל מדגם). כדי לענות על ספציפי, שאלות רלוונטיות ביולוגית, לעתים קרובות אי אפשר לקבל כמויות גבוהות כאלה של חומר התחלתי (למשל, עבור תאים מיון FACS או שלבים עובריים מוקדמים). לבסוף, אם הדגם הינו מוצלח, רק 1-2 ng של חומר הספרייה DNA זמין מכל דגימה, ובכך להגביל את עומק רצף השגה.
כדי לאפשר יצירת פרופיל TSS באמצעות ננוגרמות בסך הכל RNA, פיתחנו לאחרונה מנשא כלוב קלט-נמוך מסוג10 (slic-קייג ‘, איור 1). SLIC-קייג ‘ דורש רק 10 ng של RNA סך כדי להשיג ספריות מורכבות גבוהה. הפרוטוקול שלנו מסתמך על מנשא RNA סינתטי מעוצב בקפידה הוסיף RNA של עניין כדי להשיג סך של 5 μg של חומר RNA. הנושא הסינתטי מחקה את ספריית ה-DNA היעד בהפצת האורך כדי למנוע הטיות פוטנציאליות שעלולות להיגרם על ידי מולקולות הומוגניים. רצף המוביל מבוסס על הרצף של ה-Esהאנציכיה הקולי לאוקיצ’ה-trna (שולחן 1) משתי סיבות. ראשית, כל שארית של המוביל בספרייה הסופית, גם אם רצף, לא יהיה למפות לגנום איקריוטית. שנית, כמו E. coli הוא מינים melic, הגנים שלה משק הבית ממוטבים עבור טווח הטמפרטורה המתאימה SLIC-קייג ‘. רצף הנושא מוטבע גם עם אתרי ביות הכרה endonuclease כדי לאפשר השפלה ספציפית של הדנ א נגזר מולקולות RNA הספק. היעד, הספריה הנגזרת לדוגמה נותרת שלמה, כפי שאתרי הזיהוי הנמצאים באתר הם ארוכים (I-CeuI = 27 bp; I-scei = 18 bp) ו מבחינה סטטיסטית סביר למצוא הגנום איקריוטית. לאחר השפלה ספציפית של המוביל והסרת שברי החרגת מהגודל, ספריית היעד היא ה-PCR מוגבר ומוכנה לרצף הדור הבא. בהתאם לסכום ה-RNA ההתחלתי (1-100 ng), בין 13-18 מחזורי הגברה של ה-PCR צפויים להיות נדרשים. הכמות הסופית של ה-DNA לכל מדגם נע בין 5-50 ng, מניב חומר מספיק עבור רצף עמוק מאוד. כאשר משתמשים רק 1-2 ng בסך הכל RNA, האמת TSSs ניתן לזהות; עם זאת, הספריות צפויות להיות במורכבות נמוכה יותר. לבסוף, כאשר SLIC-קייג ‘ מבוסס על פרוטוקול ה-לינה-iCAGE11, הוא מאפשר ריבוב של עד שמונה דגימות לפני הרצף.
Protocol
1. הכנת המוביל הכנת תבניות דנ א עבור תמלול והפריה חוץ גופית הכן את שילוב ה-PCR עבור כל תבנית PCR על-ידי שילוב 41 μL של מים, 20 μL של מאגר HF 5x, 8 μL של 2.5 mM dNTPs, 10 μL של 10 μM ייחודי קדימה פריימר (PCR_GN5_f1, שולחן 2; התחל מומס מדולל במים) , 10 μL של 2 ng/μL תבנית המכילה את הגן הסינתטי של המנשא ו-1 μL ‘ פוסיון פולימראז. ערבב את המיקס של ה-PCR באמצעות ליטוף. תערובת הורים לכל 10 תבניות ניתן להכין בבת אחת (להתכונן 11 תגובות). הוסף 90 μL של שילוב ה-PCR ל -10 μL של כל 10 היפוך (PCR_N6_r1-r10, שולחן 2). מערבבים באמצעות ליטוף. ה-PCR מגבירים את התבניות באמצעות התוכנית הבאה: 98 ° c עבור 60 s, (98 ° צ’ עבור 10 s, 50 ° c עבור 30, 72 ° צ’ עבור 30 s) מחזורים, 35 ° c עבור 10 דקות, להחזיק ב 4 ° c. ג’ל טיהור של תבניות דנ א מוגבר הכינו ג’ל לגיל 1% (מומלץ להמסת התכה נמוכה). כדי להקטין את עוצמת הקול, יש לרכז את תערובות התגובה של ה-PCR מ-100 μL עד 20 הנפח הכולל של μL באמצעות מרכז הוואקום בטמפרטורה נמוכה בינונית (30-40 ° c). הוסף 6 μL של צבע טעינת 6x, ערבב היטב, וטען על ג’ל. הפעל אלקטרופורזה עבור 30 דקות ב-1 x מאגר טה במתח המתאים למיכל האלקטרופורזה בשימוש (5 – 10 V/cm). במקביל להריץ 100 bp או 1,000 הסולם DNA bp. באמצעות אזמל נקי, בלו פרוסות ג’ל המכילות את מוצר ה-PCR של היעד. למנוע ג’ל מיותרים. לטהר את מוצרי ה-PCR באמצעות ערכת חילוץ ג’ל (על פי הוראות היצרן).הערה: A260/A230 יחס של דנ א מבודד ג’ל agarose הם בדרך כלל נמוך (0.1 – 0.3). מוצרים מוצר ומוצרי צד צפויים מוצגים באיור 2A. התשואות הצפויות מ-100 μL ה-PCR התגובות הם 1.2 – 3 μg. ניתן לשנות את התגובות כדי לקבל תשואה גבוהה יותר. שעתוק מחוץ למבחנה של מולקולות נושא תעתור מנשא רנ א בתוך מבחנה באמצעות T7 RNA פולימראז על פי הוראות היצרן. הגדר 10-20 μL תגובות (הערכה המומלצת היא בטבלת חומרים). לטהר את ה-RNA העתק באמצעות ערכת טיהור RNA. הגדרת העיכול DNA בפתרון באמצעות DNase אני בעקבות ההוראות הסטנדרטיות של היצרן, ו elute RNA ב 50 μL של מים. כדי להגדיל את התשואה, להשאיר את המים בטור עבור 5 דקות לפני צנטריפוגה.הערה: היזהר שלא לחרוג מקיבולת האיגוד המירבית של העמודות (בערכה שהוזכרה בטבלת החומרים, הקיבולת היא עד 100 μg). התשואה הצפויה מ-PCR תבניות 1 – 10 (1 kbp כדי 200 bp באורך) הוא 25 – 50 μg מ 10 μL התגובות תמלול מבחנה. תגובות ניתן לשנות עד כדי לקבל מלאי גדול יותר של מולקולות הספק. המשך הסגירה של מולקולות RNA של המנשא באמצעות מבחנה הכינו את ערבוב הסגירה על-ידי שילוב 2 μL של מאגר הסגירה של 10x, 1 μL של 10 מ”מ GTP, 1 μL של 2 מ”מ SAM (טרי מדולל), ו 1 μL של Vaccinia הסגירה האנזים לכל הנשא RNA. מערבבים עד 10 μg של כל מולקולה הספק ב 15 μL של נפח כולל והטמפרטורה עבור 10 דקות ב 65 ° c. הניחו על הקרח מיד כדי למנוע היווצרות מבנה משני. מערבבים את מנשא RNA עם 5 μL של תערובת הסגירה ואת הדגירה עבור 1 h ב 37 ° c. טיהור מולקולות RNA מוכתרים באמצעות ערכת טיהור של RNA — בצע את פרוטוקול הניקוי של היצרן. אליוט רנ א ב 30 μL של מים. כדי להגדיל את התשואה, להשאיר את המים בטור עבור 5 דקות לפני צנטריפוגה.הערה: מדידת ריכוז באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume. יחס צפוי של A260/A280 הוא > 2 ו-A260/A230 הוא > 2. שים לב כי עבור כמה דגימות RNA A260/A230 יכול להיות בין 1.3 – 2. התשואה הצפויה בעת שימוש 10 μg של RNA uncapped כתיר הוא 9 – 10 μg של RNA הכתיר. הכינו את התערובת של המנשא המוחלק והבלתי מושלע על ידי שילוב הסכומים המתוארים בטבלה 3. מערבבים היטב על ידי מצליף בצינור ולמדוד את הריכוז באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume.הערה: אם יש צורך בריכוז גבוה יותר של המנשא כדי להשתלב בתגובת התעתיק ההפוכה (ראה להלן), ניתן לרכז את תמהיל הנושא באמצעות מרכז הואקום בטמפרטורה נמוכה בינונית (30-35 ° c) עד להשגת הריכוז הסופי הרצוי. צעדים 2 – 14 שונו מפרוטוקול הסטנדרט-iCAGE שדווחו על ידי מוראטה ואח ’11 2. תמלול הפוכה לשלב 1 μL של התחל (2.5 mM TCT-N6 מומס במים, עבור רצף לראות את הטבלה המשלים 1), 10 ng של ה-RNA הכולל של ריבית 4,990 ng של שילוב הנושא (שולחן 3) ב 10 μl של נפח כולל בצלחת ה-PCR נמוך מחייב. מערבבים על ידי מצליף בשפופרת.הערה: אם ה-RNA לדוגמה הוא מדולל מדי עבור שעתוק הפוכה (ראה להלן), לשלב אותו עם הכמות המתאימה של המוביל, להתרכז באמצעות מרכז ואקום כדי 9 μL סה כ נפח, ולהוסיף 1 μL של הכולל RT. הוספת הרוזן המוביל, כדי להגיע 5 μg של RNA בסך הכל מונע אובדן לדוגמה. לחמם את התערובת משלב 2.1 בשעה 65 ° צ’ עבור 5 דקות, ומניחים על הקרח מיד כדי למנוע renaturation. הכינו את המיקס לתמלול (RT). עבור כל מדגם לשלב 6.1 μL של מים (RNase-and DNase-חינם), 7.6 μL של מאגר הגדיל הראשון 5x, 1.9 μL של 0.1 M DTT, 1 μL של 10 מ”מ Dnase, 7.6 μL של מיקס trehalose/sorbitol (ראה מתכון ב-Murata et al.11) ו-3.8 μl של הטרנסקריפטאז הפוכה המומלצת (ראה טבלה של חומרים). מערבבים היטב על ידי מצליף בשפופרת. הוסף 28 μL של שילוב RT לתוך הצינור ה-PCR עם 10 μL של RNA, המוביל ואת לפריימר RT (הכולל נפח 38 μL). מערבבים היטב על ידי ליטוף.הערה: התערובת היא צמיגה מאוד בשל טרהלז/סורבייול. ערבב עד הומוגנית בעליל. מודטה בציקלונט תרמית באמצעות התוכנית הבאה: 25 ° c עבור 30, 50 ° צ’ עבור 60 דקות, ולהחזיק ב 4 ° c. טיהור של cDNA: RNA היברידיות באמצעות חרוזים מגנטיים SPRI הוסף 68.4 μL של החרוזים המומלצים של RNAse-ו DNase-free SPRI (ראה טבלת חומרים) כדי 38 μl של שילוב RT (חרוזים כדי יחס לדוגמה 1.8:1). מערבבים היטב על ידי ליטוף ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הפרד את החרוזים על מעמד מגנטי במשך 5 דקות. להיפטר supernatant ולשטוף את החרוזים פעמיים עם 200 μL של 70% אתנול (טרי מוכן).הערה: האתנול מתווסף לחרוזים ללא ערבוב ובעוד הצינור הוא על המעמד המגנטי. אתנול שנוספו מוסר מיד. טיפול צריך להילקח לא לאבד את כל החרוזים במהלך השטף כפי שהוא עשוי להוביל לאובדן לדוגמה. בעוד הצינור עדיין על העמדה המגנטי, להסיר את כל העקבות של אתנול. טיפות אתנול ניתן להסיר ודחפו מתוך הצינור באמצעות P10. . אל תתנו לחרוזים להתייבש הוסף 42 μL של מים מחומם מראש ב-37 ° צ’ לחרוזים והפחת המדגם על ידי ליטוף למעלה ולמטה 60x.הערה: היזהרו לא לגרום קצף על ידי ליטוף כפי שהוא עלול לגרום לאובדן חרוזים (כלומר, כרוך לדוגמה) קצף. מודטה ב 37 ° c עבור 5 דקות ללא המכסה כדי לאפשר אידוי של כמויות מעקב של אתנול. הפרד את החרוזים על מעמד מגנטי במשך 5 דקות והעבר את הסופרנאנט לצלחת חדשה.הערה: לנסות לאחזר את כל supernatant כדי למנוע הפסד לדוגמה תוך הימנעות נושא של חרוז. השתמש בפיפטה P10 כדי לקבל את טיפות המדגם האחרון. 3. חמצון הוסף 2 μL של 1 M NaOAc (pH 4.5) לתוך התגובה RT מטוהרים. מערבבים על ידי ליטוף, להוסיף 2 μL של 250 mM NaIO4 ו לערבב שוב. דגירה על הקרח עבור 45 דקות. לכסות את הצלחת עם רדיד אלומיניום כדי למנוע אור. הוסף 16 μL של טריס-HCl (pH 8.5) לתוך תערובת חמצון כדי לנטרל את ה-pH. טיהור תחמוצת cDNA: RNA היברידיות באמצעות חרוזים מגנטיים SPRI. הוסף 108 μL של חרוזי SPRI כדי 60 μL של שילוב חמצון (1.8:1 חרוזים כדי יחס לדוגמה). חזרו על הטיהור כמתואר בצעדים 2.6.1 – 2.6.6. אליוט באמצעות 42 μL של מים מחוממים עד 37 ° c.הערה: טרי להכין 250 mM NaIO4 על ידי הוספת 18.7 μl של מים עבור 1 מ ג של naio4. NaIO4 הוא רגיש לאור; לכן, לשמור את הפתרון בצינור מכוסה רדיד אלומיניום או בצינור עמיד באור. 4. ביוטילציה הוסף 4 μL של 1 M NaOAc (pH 6.0) לתוך הצינור המכיל את דגימת תחמוצת מטוהרים ולערבב על ידי ליטוף. הוסף 4 μl של 10 מ”מ פתרון ביוטין, מערבבים על ידי ליטוף ו דגירה עבור 2 h ב 23 ° c ב ציקלייר תרמית כדי למנוע אור.הערה: להכין את הפתרון ביוטין ידי ערבוב 50 מ”ג של ביוטין עם 13.5 mL של dmso. הפוך לשימוש חד-ממדי והקפא ב-80 ° c. טיהור biotinylated cDNA: RNA היברידיות באמצעות חרוזים מגנטיים SPRI. הוסף 12 μL של 2-propanol ולערבב על ידי ליטוף. הוסף 108 μL של חרוזי SPRI (1.8:1 חרוזים ליחס מדגם) וחזור על הטיהור כפי שמתואר בשלבים 2.6.1 – 2.6.6. אליוט באמצעות 42 μL של מים מחוממים ב 37 ° c.הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן, ודגימות קפוא ב-80 ° c. 5. RNase I דעיכול הכן את RNase I לערבב על ידי ערבוב 4.5 μL של 10x RNase I מאגר עם 0.5 μL של RNase I (10 U/μL) לכל מדגם. מערבבים באמצעות ליטוף. הוסף 5 μL של התמהיל לכל מדגם מטוהר (45 μL בסך הכל). מערבבים באמצעות ליטוף ומודקון במשך 30 דקות ב 37 ° c. 6. הכנת חרוזי Streptavidin עבור כל דוגמה, לערבב 30 μL של חרוזים streptavidin ללגום עם 0.38 μL של 20 מ”ג/mL tRNA. דגירה על קרח 30 דקות ולערבב כל 5 דקות על ידי הצליף בשפופרת.הערה: השהה מחדש את החרוזים הstreptavidin היטב לפני ליטוף על ידי מצליף בבקבוק. הפתרון tRNA צריך להיות מוכן על פי מוראטה ואח ’11 הפרידו את החרוזים על המעמד המגנטי במשך 2 – 3 דקות.. הסר את הסופרנטאנט שטוף את החרוזים על ידי השעיית מחדש ב 15 μL של מאגר A. הפרד את החרוזים על המעמד המגנטי במשך 2 – 3 דקות והסר את הסופרנטאנט. חזור על השטיפה והסר את הסופרנטאנט. השהה מחדש את החרוזים ב-105 μL של מאגר A והוסף 0.19 μL של 20 מ”ג/mL של tRNA. מערבבים היטב על ידי ליטוף.הערה: החרוזים צריכים להיות מוכנים טרי לפני השימוש. התחל את הכנת החרוזים במהלך העיכול RNase. לדוגמאות מרובות מכינים את החרוזים יחד בצינורית אחת. 7. כובע-השמנה כריכת לדוגמה הוסף 105 μL של חרוזי streptavidin מוכנים ל 45 μL של המדגם המטופל RNase. מערבבים היטב על ידי ליטוף ו-דגירה ב 37 ° c עבור 30 דקות. מערבבים על ידי ליטוף כל 10 דקות. הפרידו את החרוזים על המעמד המגנטי במשך 2 – 3 דקות.. הסר את הסופרנטאנט חרוזי כביסה הוסף 150 μL של מאגר כביסה והשהה מחדש את החרוזים באמצעות ליטוף. הפרידו את החרוזים על המעמד המגנטי במשך 2 – 3 דקות והסירו את הסופרנטאנט. הוסף 150 μL של מאגר הכביסה B והשהה מחדש את החרוזים באמצעות ליטוף. הפרידו את החרוזים על המעמד המגנטי במשך 2 – 3 דקות והסירו את הסופרנטאנט. הוסף 150 μL של מאגר הכביסה C והשהה מחדש את החרוזים באמצעות ליטוף. הפרידו את החרוזים על המעמד המגנטי במשך 2 – 3 דקות והסירו את הסופרנטאנט.הערה: יש לחמם את המאגרים B ו-C עד 37 ° c. מתכונים לשטיפת מאגרים A, B ו-C מתוארים כמתואר במורטה ואח ’11 . שחרור cDNA הכינו 1 x RNase מאגר על ידי ערבוב 58.5 μL של מים עם 6.5 μL של מאגר 10x RNase. השהה מחדש את החרוזים ב-35 μL של מאגר 1x RNase I. דגירה ב 95 ° צ’ עבור 5 דקות ולהעביר ישירות על הקרח עבור 2 דקות כדי למנוע העברה מראש של cDNA. להחזיק את העפעפיים במהלך העברה לקרח כפי שהם עלולים לצוץ עקב הלחץ לבנות למעלה. הפרד את החרוזים עבור 2 – 3 דקות על מעמד מגנטי ולהעביר את הסופרנטאנט לצלחת חדשה. השהה מחדש את החרוזים ב -30 μL של מאגר 1x RNase I. הפרד את החרוזים על המעמד המגנטי עבור 2 – 3 דקות ולהעביר את supernatant עד supernatant שנאסף בעבר (הנפח הכולל של cDNA האלוטד צריך להיות על 65 μL). 8. הסרת RNA על ידי RNase H ו-RNase I העיכול לכל מדגם, לשלב 2.4 μL של מים, 0.5 μL של 10x RNase I מאגר, 0.1 μL של RNase H, ו-2 μL של RNase I. הוסף 5 μL של התמהיל ל-65 μL של דגימת cDNA ששוחררה וערבבו באמצעות ליטוף. מודקון ב 37 ° c עבור 15 דקות ולהחזיק ב 4 ° c. לטהר cDNA מתערובת העיכול RNase באמצעות חרוזים מגנטיים SPRI. הוסף 126 μL של חרוזי SPRI כדי 70 μL של תגובת השפלה ומערבבים על ידי ליטוף. בצע את צעדי הטיהור כמתואר לגבי חרוזי SPRI לטיהור ב2.6.1 – 2.6.6. אליוט באמצעות 42 μL של מים מחוממים ב 37 ° c כמתואר. הכן RNase I לערבב על ידי שילוב 4.5 μL של 10x RNase I מאגר ו 0.5 μL של RNase i. הוסף 5 μL של תמהיל RNase ל 40 μL של דגימת cDNA מטוהרים. מערבבים באמצעות ליטוף ומודקון ב-37 ° c למשך 30 דקות. המתן בארבע מעלות צלזיוס. לטהר את המדגם באמצעות חרוזים מגנטיים SPRI. הוסף 81 μL של חרוזי SPRI כדי 45 μL של תגובת השפלה ומערבבים על ידי ליטוף. בצע את צעדי הטיהור כמתואר לגבי חרוזי SPRI לטיהור ב2.6.1 – 2.6.6. אליוט באמצעות 42 μL של מים כמתואר. 9. הארכה של 5 מקשר לרכז את דגימת cDNA מטוהרים כדי 4 μL באמצעות מרכז ואקום. שמרו על טמפרטורה של 30 – 35 ° c. בדוק את עוצמת הקול באמצעות פיפטה. אם המדגם יבש לשלמות, לפזר על ידי הוספת 4 μL של מים.הערה: עדיף להימנע מייבוש לשלמות כדי למנוע אובדן דגימה. מודדת את המדגם מרוכז ב 95 ° צ’ עבור 5 דקות ומיד מקום על הקרח עבור 2 דקות כדי למנוע renaturation. להחזיק את העפעפיים תוך העברת הצינורות כמו העפעפיים עלול להתפוצץ עקב הצטברות לחץ. דגירה 4 μL של 2.5 μM 5 ‘ מקשר ב 55 ° צ’ עבור 5 דקות ומקום מיד על הקרח עבור 2 דקות כדי למנוע renaturation. מערבבים 4 μL של 2.5 μM 5 ‘ מקשר עם 4 μL של המדגם.הערה: יש להכין את 5 המקשר לפי שולחן משלים 2, טבלה משלימה 3, טבלה משלימה 4ושולחן משלים 5. לדלל את 10 μM 5 ‘ מקשר לריכוז 2.5 μM באמצעות 100 מ”מ הנאל לפני השימוש. הוסף 16 μL מראש הקשר (ראה טבלת חומרים) למקשר המעורב 5 והמדגם וערבב היטב על ידי ליטוף. מודטה ב -16 ° c עבור 16 h. לטהר את תערובת החיבור באמצעות חרוזים מגנטיים SPRI. הוסף 43.2 μL של חרוזי SPRI ובצע את השלבים 2.6.1 – 2.6.6. אלט כמתואר באמצעות 42 μL של מים מחוממים ב 37 ° c. חזור על הטיהור שנעשה בשלב 9.6 על-ידי הוספת 72 μL של חרוזי SPRI ל-supernatant המועבר (1.8:1 חרוזים ליחס דגימה).הערה: 5 ‘ לינוקרס מכילים ברקודים המאפשר אגירה של עד שמונה דגימות לפני הרצף (שמונה ברקודים trinucleotide זמינים, כפי שמתואר מוראטה ואח ’11 הטבלה המשלים 1). 10. הארכה של 3 מקשר לרכז את המדגם מטוהר כדי 4 μL באמצעות מרכז ואקום כפי שמתואר בשלב 9.1. מודדת את המדגם מרוכז ב 95 ° צ’ עבור 5 דקות ומיד מקום על הקרח עבור 2 דקות כדי למנוע renaturation. החזיקו את העפעפיים בזמן העברת הצינורות כשהעפעפיים עלולים לצוץ עקב הצטברות לחץ. דגירה 4 μL של 2.5 μM 3 ‘ מקשר ב 65 ° צ’ עבור 5 דקות ומקום מיד על הקרח עבור 2 דקות כדי למנוע renaturation. הוסף 4 μL של 2.5 μM 3 ‘ מקשר ל 4 μL של המדגם מרוכז. הוסף 16 μL של מראש הסדר וערבב היטב על ידי ליטוף. מודטה ב -16 ° c עבור 16 h. לטהר את תערובת החיבור באמצעות חרוזים מגנטיים SPRI. הוסף 43.2 μL של חרוזי SPRI ובצע את השלבים 2.6.1 – 2.6.6. Elute כפי שמתואר באמצעות 42 μL של מים מחומם מראש ל 37 ° c.הערה: יש להכין את שלושת המקשר לפי טבלאות משלימות 6 ושולחן משלים 7. לדלל את 10 μM 3 ‘ מקשר לריכוז 2.5 μM באמצעות 100 מ”מ הנאל. 11. דזילציה הכן את מיקס SAP על-ידי שילוב 4 μL של מים, 5 μL של מאגר SAP 10x ו-1 μL של אנזים SAP. הוסף 10 μL של שילוב SAP למדגם ליגאט מטוהרים (סך הכל 50 μL) ו-דגירה של הציקלונט באמצעות התוכנית הבאה: 37 ° c עבור 30 דקות, 65 ° צ’ עבור 15 דקות, ולהחזיק ב 4 ° c. 12. ירידה של 3 ‘ מקשר העליון סטרנד באמצעות Uracil אנזים כריתה ספציפי הוסף 2 μl של אנזים כריתה ספציפי של אורציל (ראה טבלת חומרים) למדגם מסיבי, לערבב על ידי ליטוף ו הדגירה בתוך התרמוטרנר באמצעות התוכנית הבאה: 37 ° c עבור 30 דקות, 95 ° צ’ עבור 5 דקות, ומיד מקום על הקרח עבור 2 דקות כדי ל למנוע ריפוי מחדש של סטרנד העליון מפוצל. לטהר את תערובת התגובה על ידי הוספת 93.6 μL של חרוזי מגנטי SPRI לתערובת 52 μl ומערבבים היטב על ידי ליטוף. חזור על שלבי הטיהור 2.6.1 – 2.6.6. אליוט עם 42 μL של מים מחוממים ב 37 ° c כמתואר. 13. הסטרנד השנייה סינתזה הכינו את התמהיל השני של סינתזה הגדיל (אמצעי האחסון מבוטא לפי מדגם) על-ידי שילוב של 5 μL של מאגר התגובות התגובה של ה-DNA, 2 μL של מים, 1 μL של 10 מ”מ dNTPs, 1 μL של 50 μM-iCAGE הגדיל השני (רצף משלים 1) ו- נא לקויה (ראה מומלץ פולימראז ברשימת חומרים). הוסף 10 μL של תערובת למדגם מטוהר ומערבבים היטב על ידי ליטוף (הנפח הכולל הוא 50 μL). מודטה בציקלונט התרמי באמצעות התוכנית הבאה: 95 ° c עבור 5 דקות, 55 ° c עבור 5 דקות, 72 ° צ’ עבור 30 דקות, ולהחזיק ב 4 ° c. 14. השפלה של השנייה מגדיל סינתזה באמצעות אקסונוקלאז אני הוסף 1 μL של אקסונוקוכר I לתערובת הסינתזה של הגדיל השני. מערבבים היטב על ידי ליטוף ו-דגירה ב 37 ° c עבור 30 דקות לאחר מכן החזקת 4 ° c. לטהר את ה-DNA נתקע כפול על ידי הוספת 91.8 μL של חרוזי מגנטי SPRI ל 51 μL של המדגם המטופל אקסונוקלאז. חזור על צעדי הטיהור המתוארים ב2.6.1 – 2.6.6. ו-elute עם 42 μL של מים מחוממים ל 37 ° צ’ כפי שמתואר. לרכז את המדגם באמצעות מרכז ואקום כדי 15 μL כפי שמתואר בשלב 9.1. 15. בקרת איכות וכמות השתמש 1 μL של דגימות מרוכז ולהפעיל שבב DNA גבוהה רגישות על מנתח איכות ה-DNA. פרופיל/כמות צפויים מוצגים באיור 3. 16. סיבוב ראשון בירידה בביצועי המוביל הכינו את תערובת ההשפלה על ידי שילוב 2 μL של מים, 2 μL של מאגר אנזים הגבלה של 10x, 1 μL של I-SceI, ו-1 μL של I-CeuI. הוסף 6 μL של תערובת השפלה כדי 14 μL של המדגם מרוכז ולערבב על ידי ליטוף. מודקון ב 37 ° צ’ עבור 3 שעות ואחריו 20 דקות ביטול הפעלת ב 65 ° צ’ ולהחזיק ב 4 ° c. לטהר את ערבוב השפלה באמצעות חרוזי מגנטי SPRI. הוסף 5 μL של מים כדי להגדיל את הנפח של ערבוב השפלה ולהוסיף 45 μL של חרוזי SPRI (1.8:1 חרוזים כדי לדגום יחס). חזור על הטיהור כמתואר בצעדים 2.6.1 – 2.6.6. ו-elute עם 42 μL של מים מחוממים ל 37 ° c. לרכז את דגימת להתחמק מ 42 μL כדי 20 μL של אמצעי האחסון הכולל כמתואר בשלב 9.1. 17. שליטה ברמת הירידה וקביעת מספר מחזורי הגברה של ה-PCR הכנת מיקס qPCR לצורך הגברה של ספריות שלמות (שילוב מתאם). לשלב 3.8 μL של מים, 5 μL של qPCR מראש x (2x), 0.1 μL של 10 μM adaptor_f1 פריימר (5 ‘-AATGATACGGCGACCACCGA-3 ‘), ו 0.1 μL של 10 μM adaptor_r1 פריימר (5 ‘-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3 ‘) עבור כל מדגם (ראה טבלת חומרים עבור qpcr מומלצים x). לשלב 9 μL של מתאם qPCR ערבוב עם 1 μL של מדגם משלב 16.4 ומערבבים היטב על ידי ליטוף. הכינו את התערובת qPCR לחיזוק ה-DNA הנגזר מהמוביל (שילוב מנשא). לשלב 3.8 μL של מים, 5 μL של qPCR מראש x (2x), 0.1 μl של 10 μM carrier_f1 פריימר (5 ‘-GCGGCAGCGTTCGCTATAAC-3 ‘), ו 0.1 μL של 10 μM adaptor_r1 פריימר עבור כל דוגמה שילוב 9 μL של שילוב מנשא qPCR עם 1 μL של המדגם משלב 16.4 ומערבבים היטב על ידי ליטוף. הגדרת התוכנית qPCR: 95 ° צ’ עבור 3 דקות (95 ° צלזיוס עבור 20 s, 60 ° צ’ עבור 20 s, 72 ° צ’ עבור 2 דקות) וחזר 40x, ואחריו עקומת הדנטורציה ספציפית למכשיר (65-95 ° c), ולהחזיק 4 ° c.הערה: הכן שליטה שלילית על-ידי החלפת המדגם במים. 18. ה-PCR הגברה של ספריית היעד להכין את תערובת ה-PCR על ידי שילוב 6 μL של מים, 0.5 μL של 10 μM adaptor_f1 פריימר, 0.5 μL של 10 μM adaptor_r1 פריימר ו 25 μL של ה-PCR מראש (2x). מערבבים באמצעות ליטוף (ראו טבלת חומרים לקבלת המוצר המומלץ של ה-PCR). הוסף 32 μL של שילוב ה-PCR עד 18 μL של המדגם משלב 16.4. מערבבים ביסודיות על ידי ליטוף. הגדר את הגברה ה-PCR: 95 ° c עבור 3 דקות, (98 ° c עבור 20, 60 ° צ’ עבור 15 s, 72 ° c עבור 2 דקות) מחזורים 12-18, 72 ° c עבור 2 דקות ולהחזיק ב 4 ° c.הערה: המספר המדויק של מחזורי ה-PCR נקבע על ידי תוצאות qPCR ומתאים לערך ה-Ct שהושג עם התמהיל המתואם (מספר מחזורי ה-PCR שווה לערך Ct). לטהר את המדגם מוגבר על ידי הוספת 90 μL של חרוזי מגנטי SPRI כדי 50 μL של המדגם מוגבר ומערבבים ביסודיות על ידי ליטוף. חזור על צעדי הטיהור המתוארים בשלבים 2.6.1 – 2.6.6. ו elute המדגם באמצעות 42 μL של מים כמתואר. 19. הסבב השני של ירידה בביצועי הספק חזור על שלבים 16.1 – 26.2. לטהר את ערבוב השפלה באמצעות חרוזי מגנטי SPRI. הוסף 10 μL של מים למדגם כדי להגדיל את עוצמת הקול ולערבב עם 30 μL של חרוזי SPRI (1:1 חרוזים ליחס המדגם). חזור על הטיהור כמתואר בצעדים 2.6.1 – 2.6.6. ו-elute עם 42 μL של מים מחוממים ב 37 ° צ’ כפי שמתואר. למקד את הדגימה להתחמק מ 42 μL כדי 30 μL של נפח כולל. 20. בחירת גודל הספרייה מערבבים 24 μL של חרוזי מגנטי SPRI עם 30 μL של המדגם משלב 19.3. (0.8:1 חרוזים ליחס דגימה). חזור על שלבי הטיהור כפי שמתואר בשלבים 2.6.1 – 2.6.6. ולשתות את המדגם ב 42 μL של מים כמתואר. לרכז את המדגם כ 14 μL כפי שמתואר בשלב 9.1. 21. בקרת איכות הערכה של גודל התפלגות רוץ 1 μL של המדגם על שבב ה-DNA רגישות גבוהה. תוצאות צפויות מוצגות באיור 4.הערה: אם חלקים קצרים יותר מ 200 bp גלויים (ראה דוגמה באיור 4a, C), בחירת גודל (שלבים 20.1-20.2) צריך לחזור עד שהקטעים הקצרים יוסרו (איור 4a, D). בדרך כלל מספיק סיבוב נוסף של בחירת גודל. אם כמות הקטעים הקצרים חמורה (כמו באיור 4C), יש להקטין את היחס בין החרוזים למדגם לבין 0.6:1. בקרת איכות לביצועי צליל הספק חזור על שלבים 17.1 – 17.5.הערה: בהתאם לריכוז הספריות המשוער ב-HS שבב ה-DNA להפעיל (ניתוח אזור), הדגימות צריך להיות מדולל לפני qPCR. השתמש 0.5 μL של המדגם כדי למנוע אובדן לדוגמה ולדלל 100-500x במים (לדלל עד 1 – 20 pg/μL הריכוז הסופי). הפרש צפוי בין ערכי Ct שהושגו עם מתאם ושילוב נושא הוא 5 – 10. קוונפיקציה של הספרייה הכן את דילול העבודה של תקן ה-DNA של למדא על ידי ערבוב 20 μL של 100 mg/mL למדא תקן DNA עם 980 μL של 1x TE (להכין על ידי דילול 20x TE המסופקים בערכת כימות ה-DNA). דילול ה-DNA של למדא ניתן לאחסן ב-20 ° c. הכינו את הדילול הסדרתי של למדא DNA על ידי ערבוב תקן למדא מדולל ו-1x TE לפי טבלת המשלים 8.הערה: לדיוק גבוה יותר, מומלץ להוסיף 100 μL של מאגר 1x TE לכל הצינורות ולהסיר את עוצמת הקול 1x כנדרש לכל אמצעי האחסון של למדא מדולל להתווסף. אל תשתמש ביותר מ-1 μL של הספריה; שימוש ב-384 לוחות הבאר עבור מדידה זו מומלץ.
Representative Results
דו ח זה מתאר את פרוטוקול SLIC-קייג מלא לקבלת ספריות ברצף מוכנות מננוגרמות של הפעלת החומר הכולל RNA (איור 1). כדי להשיג את המיקס הסינתטי של ה-RNA, הראשון, תבניות המנשא של ה-PCR צריכות להיות מוכנות ומטוהרים ג’ל לסילוק מוצרי הצד של ה-PCR (איור 2A). כל תבנית ה-PCR (10 בסך הכל) מופקת באמצעות משותף קדימה, אך היפוך שונה (טבלה 2), המוביל לאורכים שונים של תבנית ה-pcr כדי לאפשר שינויים בגודל של נושאות RNA סינתטיים. לאחר שטוהר, תבניות ה-PCR משמשות לתמלול של מולקולות הספק. מוצר מנשא RNA יחיד צפוי אם התבניות מטוהרים בעזרת ג’ל (ראה מייצג ג’ל-ניתוח באיור 2B). ניתן לערוך את הכנת המנשא בהתאם לצורך, וכאשר הוכנו, מעורבבים ומוקפאים ב-80 ° c לשימוש עתידי. באמצעות כמות מינימלית מומלצת של מדגם כולל RNA (10 ng) בשילוב עם 16-18 מחזורים של הגברה PCR, מורכבות גבוהה ספריות SLIC-קייג ‘ ניתן להשיג. מספר מחזורי ה-PCR הנדרשים להגביר את הספרייה הסופית, תלוי בכמות הסכום הכולל של RNA המשמש (מספר המחזורים הצפוי מוצג בטבלה 4). לאחר סבב ההשפלה הראשון, בתוצאות qPCR (שלב 17), ההבדל הצפוי בין ערכי Ct שהושגו באמצעות adaptor_f1 או carrier_f1 פריימר הוא 1-2, עם ערכי Ct שהושגו עם adaptor_f1 נמוך יותר מאשר עם carrier_f1. חלוקת אורכי הקטע בספרייה הסופית היא בין 200-2000 bp עם גודל הקטע הממוצע של 700-900 bp (מבוסס על ניתוח האזור באמצעות תוכנת Bioanalyzer, איור 4B, ד). קטעים קצרים יותר, כפי שהוצגו באיור 4a, C, צריכים להיות מוסרים על ידי סיבובים נוספים של החרגת גודל (שלבים 20-21). שברים קצרים אלה הם חפצי הגברה של ה-PCR ולא ספריית היעד. שים לב ששברים קצרים יותר מצרר בתאי הזרימה ברצף ועלולים לגרום לבעיות ברצף. הכמות הצפויה של חומר הספרייה שהושג לכל מדגם היא בין 5-50 ng. סכומים נמוכים באופן משמעותי מצביעים על אובדן דגימה במהלך הפרוטוקול. אם הכמות הנמוכה המתקבלת מספיקה לרצף (2-3 ng של הספריות הנמצאות במאגר נדרשת), הספריות עשויות להיות במורכבות נמוכה יותר (ראה להלן). בהתאם למכונת הרצף, ייתכן שכמות הספריה הנטענת אל תא הזרימה תצטרך להיות ממוטבת. באמצעות הארה HiSeq 2500, טעינת 8-12 pM SLIC-כלוב ספריות מעניקה בממוצע 150-200 מיליון קריאות, עם > 80% של קריאות העברת איכות ציון Q30 כמו הסף. הקריאות שהתקבלו ממופות מכן לגנום התייחסות [עבור 50 bp קריאות, Bowtie212 ניתן להשתמש עם פרמטרי ברירת מחדל המאפשרים אפס אי התאמות לכל זרע רצף (22 bp)]. יעילות מיפוי צפויה תלויה בסכום הכולל של כניסת RNA ומוצגות בטבלה 5. לאחר מכן, ניתן לטעון את הקריאות שמופו באופן ייחודי לסביבת מיחשוב ממוחשבת וסטטיסטית של13 ומעובדת באמצעות מעבד מערכת (ביומנצח). לרוב החבילה קל לעקוב ומסבירה את זרימת העבודה והעיבוד של הנתונים הממופים בפרוטרוט. שליטה ויזואלית קלה של מורכבות הספרייה היא התפלגות רוחב המקדם, כמו ספריות במורכבות נמוכה יהיו באופן מלאכותי היזמים צרים (איור 5A, הספרייה slic-קייג נגזר 1 NG של RNA הכולל, עבור פרטים ראה קודם פרסום10). עם זאת, אפילו הספריות הנמוכות מורכבות מסוג SLIC-קייג ‘ מאפשרות זיהוי של CTSSs אמיתי, עם דיוק גדול יותר מאשר שיטות חלופיות למיפוי TSS נמוך/בינוני (איור 5B, C). איור 1: צעדים בפרוטוקול SLIC-קייג ‘. לדוגמה RNA מעורבב עם המנשא RNA לערבב כדי להשיג 5 μg של חומר RNA כולל. cDNA הוא הסנתז באמצעות תמלול הפוכה הכובע הוא תחמוצת באמצעות קרום הדרך הנתרן. חמצון מאפשר חיבור של ביוטין לכובע באמצעות ביוטין הידרזידה. Biotin מקבל מחובר ל-mRNA של 3 ′ סוף, כפי שהוא גם תחמוצת באמצעות קרום הזמן של נתרן. כדי למנוע ביוטין מ-mrna: cdna ההיברידים עם מסונתז לחלוטין cdna ו מ 3 ′ קצוות של mrna, הדגימות מטופלות עם rnase I. cdna שהגיעו 5 ′ סוף mrna הוא נבחר על ידי טיהור אהדה על חרוזים streptavidin מגנטיים ( לכידת כובע). לאחר שחרורו של cDNA, 5 ′ ו 3 ′ לינקרס הם ליגבים. מולקולות הספרייה שמקורן המוביל הם מושפל באמצעות I-SceI ו-I-CeuI ביות מונודיטיות והשברים מוסרים באמצעות חרוזים מגנטיים SPRI. הספרייה היא אז הוגדל ה-PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: מיצג ג’ל-ניתוח של תבניות ה-PCR ומוביל בתעתיקים. (א) הספק המוביל תבניות לפני ג’ל טיהור: הבאר הראשונה מכילה את סמן ה-kbp, ולאחר מכן על ידי תבניות ה-pcr של הספק 1, 1-10. (ב) המוביל בתעתיקים מחוץ למבחנה: הבאר הראשונה מכילה את הסמן 1 kbp, ואחריו תעתיקים המוביל 1-10. התעתיקים של המנשא הינם מחוממים במשך 5 דקות ב-95 מעלות צלזיוס לפני הטעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: באיכות ה-Dna נציג (הרגישות גבוהה שבב dna) עקבות של SLIC-כלוב לפני סיבוב ראשון של השפלה המוביל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: איכות ה-dna מייצגת (הרגישות גבוהה שבב dna) עקבות של ספריות SLIC-קייג לאחר הגברה PCR. (א) ספריית “סליג-קייג ‘” הדורשת בחירת גודל נוספת להסרת קטעים קצרים. (ב) הספרייה SLIC-קייג ‘ לאחר בחירת גודל באמצעות 0.6 x spri חרוזים ליחס המדגם. (ג) ספריית slic-קייג ‘ של סכום הפלט התחתון המחייב בחירת גודל להסרת שבר קצר. (ד) הספרייה SLIC-קייג ‘ של כמות תפוקה נמוכה לאחר בחירת גודל באמצעות 0.6:1 חרוזי spri ליחס המדגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: אימות של ספריות SLIC-קייג ‘. (א) התפלגות מצרר באשכול התגים בספריות SLIC-קייג ‘ המוכנות מ 1, 5, או 10 ng של ה-rna הכולל של s. cerevisiae ס , ובספריית הסדר-icage המוכן 5 Μg של ה- rna סה כ. כמות גבוהה של אשכולות תגים צרים בספריית SLIC-קייג 1 מציינת את המורכבות הנמוכה שלה. (ב) רוק עקומות לזיהוי CTSS ב- S. cerevisiae ס ספריות כלוב. כל שנות ה-S. שימשו כקבוצה אמיתית (ג) רוק עקומות עבור זיהוי CTSS ב -S. cerevisiae ס ספריות nanocage. כל שנות ה-S. שימשו כקבוצה אמיתית השוואה של עקומות ROC מראה כי SLIC-כלוב בחוזקה מבצעת nanoCAGE בזיהוי CTSS. נתונים מ-ArrayExpress E-MTAB-6519 שימשו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. טבלה 1: רצף של הגן הסינתטי המוביל. אתרי i-SceI הם מודגשים ונטויים בסגול, ואתרי האינטרנט של I-CeuI הם ירוקים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. נושא פריימר הפוכה 5 ‘ -3 ‘ אורך המוצר-PCR 1 PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT 1034 2 PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC 966 3 PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG 889 4 PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT 821 מיכל 5 PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC 744 6 PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA 676 7 PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC 599 8 PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC 531 9 PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG 454 10 PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA 386 * פריימר לפנים זהה עבור כל תבניות הספק. מסומן בקו תחתון הוא רצף המקדם T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA טבלה 2: צבעי יסוד להגברה של תבנית הספק. הצבע הקדמי הוא זהה עבור כל תבניות הספק. מסומן בקו תחתון הוא רצף המקדם T7. PCR_GN5_f1: TaאטקgלGNNNNNCAGCGTTCGCTA באמצעות תחל שונות הפוכה, תבניות PCR ולכן RNAs המוביל של אורך שונות מיוצרים. נושא אורך לא מוכתרים/μg כדור משחק 1 1034 3.96 0.45 2 966 8.36 0.95 3 889 4.4 0.5 4 821 6.6 0.75 מיכל 5 744 4.4 0.5 6 676 3.08 0.35 7 599 4.4 0.5 8 531 3.96 0.45 9 454 2.64 0.3 10 386 2.2 0.25 שולחן 3: שילוב מנשא RNA. בסך הכל 49 μg של שילוב נשא 0.3-1 kbp: uncapped כתיר = 44 μg, הכתיר = 5 μg. סה כ קלט RNA/ng מחזורי PCR מיכל בן-שינג 18 מיכל השני 17 מיכל ב, 5 16 10 מטרים 15-16 בת 25 14-15 50 13-15 100 12-14 שולחן 4: המספר הצפוי של מחזורי ה-PCR בתלות של קלט RNA כולל לדוגמה. המספר המשוער של מחזורים מבוסס על ניסויים שבוצעו באמצעות סכולוסים cerevisiae ס, דרוסופילה מלאנוסטר, ו-RNA מוסקולוס סה כ. סה כ קלט RNA/ng % כולל ממופה % ממופה באופן ייחודי % מוביל מיכל בן-שינג 30 20-30 30 מיכל השני 60 20-50 10 מיכל ב, 5 60-70 40-60 5-10 10 מטרים 60-70 40-60 5-10 בת 25 65-80 40-70 0-5 50 65-80 40-70 0-3 100 70-85 40-70 0-2 טבלה 5: יעילות מיפוי צפוי ובתלות של סכום כולל של קלט RNA. מספרים משוערים מוצגים ומבוססים על ניסויים שבוצעו באמצעות סכביסים cerevisiae ס ו Mus מוסקולוס סך RNA.
Discussion
עבור ההכנות המוצלח של הספרייה SLIC-קייג ‘, זה קריטי להשתמש בטיפים וצינורות מחייב נמוך כדי למנוע אובדן לדוגמה בשל adsorption דגימה. בכל השלבים הכרוכים באחזור הסופרנטאנט, מומלץ לשחזר את עוצמת הקול המנטדגימה. מאחר שלפרוטוקול יש שלבים מרובים, אובדן מדגם רציף יוביל לספריות שנכשלו.
אם קייג ‘ (לינה-iCAGE) לא בוצעה באופן שגרתי, מומלץ לבדוק SLIC-קייג עם כמויות קלט שונות (10 ng, 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng) של מדגם ה-RNA הכולל אותו ולהשוות לספריות של ליטליגיל המוכנים באמצעות 5 μg של RNA כולל. אם הספריה של הדגם לא הצליחה (פחות מ-0.5-1 מתוך ספריית ה-DNA המתקבלת לכל מדגם), SLIC-קייג ‘ אינו סביר לעבודה, והפסד לדוגמה צריך להיות ממוזער.
צעד קריטי כדי להבטיח ספריות באיכות גבוהה נטול RNA או rRNA שאינם מוכתרים, הוא השמנה המתוארת בסעיף 7. חשוב מאוד כי חרוזים streptavidin הם מחדש ביסודיות מאגרי כביסה וכי מאגרי כביסה יוסרו לפני המשך לשלב הבא לשטוף או הימנעות cDNA.
אם התוצאה של ה-qPCR לאחר הסיבוב הראשון של השפלה בנושא אינה מראה הבדל בין השימוש ב-adaptor_f1 ו carrier_f1 התחל, המשך הפרוטוקול עדיין מומלץ. אם לאחר הסיבוב השני של השפלה בנושא, ההפרש בערכי ה-Ct הוא פחות מחמישה, מומלץ לעבור סבב שלישי של השפלה בנושא. מעולם לא מצאנו סיבוב שלישי של השפלה הכרחי, ואם זה קורה, מומלץ להחליף את המניות הביות endonuclease.
ניתן להוסיף סיבובים נוספים של הגברה של ה-PCR לפרוטוקול אם הסכום הסופי של הספריה שהתקבל אינו מספיק לרצף. הגברה של ה-PCR יכולה להיות מוגדרת עם מספר מינימלי של מחזורי הגברה הדרושים כדי להניב מספיק חומר לרצף, לקיחת בחשבון אובדן לדוגמה כי לא ניתן להימנע בחירת גודל. טיהור או בחירת גודל באמצעות חרוזים מגנטיים SPRI צריך להתבצע עד כל קטן (< 200 bp) שברי מוסרים (אם יש צורך, להשתמש 0.6:1 חרוזים ליחס דגימה), ואת הספרייה צריך להיות כימות באמצעות Picogreen.
ניתן לרצף ספריות במצב חד-ממדי או משויך לקצה. שימוש ברצף מזווג, מידע אודות התמליל ניתן להשיג. בנוסף, כאשר שעתוק הפוכה מבוצעת באמצעות פריימר אקראי (TCT-N6, n6 להיות h, החשבון האקראי), מידע מן הרצף 3 ‘-end יכול לשמש מזהים מולקולריים ייחודיים (UMI) כדי לכווץ כפילויות PCR. כמספר מתון של מחזורי הגברה של PCR משמש (עד 18), השימוש ב-UMIs נמצא בעבר מיותר להיות מיותרים.
כאשר גרעין הפרוטוקול מסתמך על הסדר-iCAGE11, slic-קייג ‘ משתמש בשמונה ברקודים. לכן, ריבוב של יותר משמונה דגימות אינו נתמך כעת. בנוסף, שניהם SLIC-כלוב ו-הכללה-iCAGE אינם מתאימים ללכידת RNAs קצר יותר מ 200 bp, כמו הפרוטוקולים נועדו להסיר את הליקרס ואת חפצי ה-PCR באמצעות גודל הדרה עם חרוזי AMPure XP.
SLIC-קייג ‘ הוא היחיד משוחדת נמוך קלט בודד שיטה ברזולוציה למיפוי שעתוק באתרי התחלה באמצעות ננוגרמות של חומר RNA כולל. שיטות חלופיות להסתמך על פעילות מיתוג התבנית של ההמרה הפוכה כדי ברקוד RNA הכתיר במקום לכידת כובע (למשל, NanoCAGE15 ו NanoPARE16). עקב החלפת תבניות, שיטות אלה מציגים הטיות ספציפיות לרצף ב-tsss זיהוי, המוביל למספר מוגבר של tsss חיובי שווא ומספר מופחת של האמת tsss9,10.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענק אמון ברוכים הA652 (106954) הוענק ל B. L. ומועצת המחקר הרפואי (MRC) מימון ליבה (MC–5QA10). נ. ג. נתמך על ידי האחווה לטווח ארוך EMBO (EMBO ALTF 1279-2016); א. פ. הייתה נתמכת בידי מועצת המחקר הרפואית בריטניה; ב. ל. נתמך על ידי מועצת המחקר הרפואי בריטניה (MC UP 1102/1).
Materials
| 2-propanol, Bioultra, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 59304-100ML-F | Used in RNAclean XP purification. |
| 3' linkers | Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3'linkers is described in the supplementary of this protocol. | ||
| 5' linkers | Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5'linkers is described in the supplementary of this protocol. | ||
| Agencourt AMPure XP, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Purification of DNA |
| Agencourt RNAClean XP Kit | Beckman Coulter | A63987 | Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps. |
| Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips | Axygen (available through Corning) | PCR-0208-CP-C | Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes). |
| Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps | Axygen (available through Corning) | PCR-02CP-C | Caps for PCR plates. |
| Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube | Axygen (available through Corning) | MCT-150-L-C | Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration. |
| Axygen 96 well no skirt PCR microplate | Axygen (available through Corning) | PCR-96-C | Low-binding PCR plates – have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples |
| Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits | Agilent | To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used) | |
| Biotin (Long Arm) Hydrazide | Vector laboratories | SP-1100 | Biotinylation/tagging |
| Cutsmart buffer | NEB | Restriction enzyme buffer | |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | NEB | M0259S | Second strand synthesis |
| DNA Ligation Kit, Mighty Mix | Takara | 6023 | Used for 5' and 3'-linker ligation |
| dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR) |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Invitrogen | 65305 | Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used. |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12321D | Magnetic stand for 1.5 ml tubes – used to prepare Streptavidin beads. |
| DynaMag-96 Side Skirted Magnet | ThermoFisher Scientific | 12027 | Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) – used with cut plates to contain 2 x 8 wells. |
| Ethanol, BioUltra, for molecular biology, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 51976-500ML-F | Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used. |
| Exonuclease I (E. coli) | NEB | M0293S | Leftover primer degradation |
| Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS | NEB | B7025S | agarose gel loading dye |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | Kit for carrier in vitro transcription |
| Horizontal electrophoresis apparatus | purification of carrier DNA templates from agarose gels | ||
| I-Ceu | NEB | R0699S | Homing endonuclease used for carrier degradation. |
| I-SceI | NEB | R0694S | Homing endonuclease used for carrier degradation. |
| KAPA HiFi HS ReadyMix (2x) | Kapa Biosystems (Supplied by Roche) | KK2601 | PCR mix for target library amplification |
| KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x | Kapa Biosystems (Supplied by Roche) | KK4600 | qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles |
| Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 µl, 1-20 µl, 20-200 µ) | Gilson | Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss. | |
| Microplate reader | For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste. | ||
| nuclease free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | Or any nuclease (DNase and RNase) free water |
| PCR thermal cycler | incubation steps and PCR amplficication | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F530S | DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase) |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Purification of carrier PCR templates from agarose gels. |
| qPCR machine | determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | ThermoFisher Scientific | P11495 | Used to measure final library concentration – recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit. |
| Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder | NEB | N0551S | DNA ladder |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N0550S | DNA ladder |
| Ribonuclease H | Takara | 2150A | Digestion of RNA after cap-trapping. |
| RNase ONE Ribonuclease | Promega | M4261 | Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription. |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping |
| Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free | VWR | AAJ63669-AK | Or any nuclease (DNase and RNase) free solution |
| Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free | Or any nuclease (DNase and RNase) free solution | ||
| Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | Oxidation of vicinal diols |
| Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 μL, Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719390-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
| Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719463-1000EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
| Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719412-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
| Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719447-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
| SpeedVac Vacuum Concentrator | concentrating samples in various steps to lower volume | ||
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | Used for reverse transcription (1st CAGE step) |
| Trehalose/sorbitol solution | Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
| Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5 | 1 M solution, DNase and RNase free | ||
| tRNA (20 mg/mL) | tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
| UltraPure Low Melting Point Agarose | ThermoFisher Scientific | 16520050 | Or any suitable pure low-melt agarose. |
| USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) | Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific) | 78390500UN | |
| USER Enzyme | NEB | M5505S | Degradation of 3'linker's upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme |
| Vaccinia Capping System | NEB | M2080S | Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules |
| Wash buffer A | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
| Wash buffer B | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
| Wash buffer C | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. |
References
- Shiraki, T., et al. Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).
- Haberle, V., Lenhard, B. Promoter architectures and developmental gene regulation. Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).
- Haberle, V., Stark, A. Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).
- Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Celniker, S. E., et al. Unlocking the secrets of the genome. Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).
- Consortium, F., et al. A promoter-level mammalian expression atlas. Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).
- Boyd, M., et al. Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies. Nature Communications. 9 (1), 1661 (2018).
- Adiconis, X., et al. Comprehensive comparative analysis of 5′-end RNA-sequencing methods. Nature Methods. , (2018).
- Cvetesic, N., et al. SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA. Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).
- Murata, M., et al. Detecting expressed genes using CAGE. Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357 (2012).
- A language and environment for statistical computing. Available from: https://www.R-project.org/ (2017)
- Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses. Nucleic Acids Research. 43 (8), e51 (2015).
- Poulain, S., et al. NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5′-Capped Transcriptomes. Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).
- Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. NanoPARE: parallel analysis of RNA 5′ ends from low-input RNA. Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).
Cite This Article
Cvetesic, N., Pahita, E., Lenhard, B. Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE. J. Vis. Exp. (148), e59805, doi:10.3791/59805 (2019).