النسخ بدء تعيين الموقع باستخدام فائقة منخفضة الإدخال الناقل-CAGE
Summary
تحليل كاب للتعبير الجيني (CAGE) هو طريقة لرسم الخرائط الكمية على نطاق الجينوم من mRNA 5’ends لالتقاط RNA البوليميراز الثاني النسخ المواقع بداية في قرار نيوكليوتيد واحد. يصف هذا العمل بروتوكول منخفض الإدخال (SLIC-CAGE) لتوليد مكتبات عالية الجودة باستخدام كميات نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي.
Abstract
تحليل كاب التعبير الجيني (CAGE) هو طريقة تستخدم للكشف عن دقة النيوكليوتيد واحد من RNA البوليميراز الثاني النسخ المواقع بداية (TSS). الكشف الدقيق عن TSSs يعزز تحديد واكتشاف المروجين الأساسية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الكشف عن أجهزة محسنة نشطة من خلال توقيعات بدء النسخ ثنائي الاتجاه. ويرد هنا بروتوكول لأداء فائقة منخفضة المدخلات الناقل-CAGE (SLIC-CAGE). يقلل هذا التكييف SLIC من بروتوكول CAGE خسائر الجيش الملكي النيبالي عن طريق زيادة مصطنعة كمية الجيش الملكي النيبالي من خلال استخدام مزيج الناقل RNA في المختبر التي تضاف إلى عينة من الفائدة، وبالتالي تمكين إعداد مكتبة من نانوغرام كميات من المجموع الجيش الملكي النيبالي (أي الآلاف من الخلايا). وتحاكي الناقلة التوزيع المتوقع لطول جزء من مكتبة الحمض النووي، مما يزيل التحيزات التي يمكن أن تنجم عن وفرة الناقل المتجانس. في المراحل الأخيرة من البروتوكول، يتم إزالة الناقل من خلال التدهور مع الهوابينغ endonucleases ويتم تضخيم المكتبة المستهدفة. وتحمي مكتبة العينات المستهدفة من التدهور، حيث أن مواقع التعرف على الإندوكليز طويلة (بين 18 و27 نقطة أساس)، مما يجعل احتمال وجودها في الجينوم اتويافيمنخفض جداً. والنتيجة النهائية هي مكتبة الحمض النووي جاهزة لتسلسل الجيل التالي. يمكن إكمال جميع الخطوات في البروتوكول، حتى التسلسل، في غضون 6 أيام. ويقتضي إعداد الناقل يوم عمل كامل؛ ومع ذلك، يمكن أن تكون مستعدة بكميات كبيرة وأبقى المجمدة في -80 درجة مئوية. وبمجرد تسلسلها، يمكن معالجة القراءات للحصول على دقة النيوكليوتيد الواحد على نطاق الجينوم TSSs. يمكن استخدام هذه القراءات في اكتشاف المروج أو محسن الأساسية، مما يوفر نظرة ثاقبة على تنظيم الجينات. وبمجرد تجميعها للمروجين، يمكن أيضا ً استخدام البيانات لتحديد سمات التعبير التي تركز على 5′.
Introduction
تحليل كاب التعبير الجيني (CAGE) هو طريقة تستخدم لدقة واحدة النيوكليوتيد رسم الخرائط على نطاق الجينوم من RNA البوليميراز الثاني النسخ المواقع بداية (TSS)1. كما أن طبيعته الكمية تسمح بتنميط التعبير المركز 5′-end. المناطق المحيطة TSSs (حوالي 40 bp المنبع والمصب) هي المروجين الأساسية وتمثل الموقع المادي حيث RNA بوليميراز الثاني وعوامل النسخ العامة ملزمة (تمت مراجعتهسابقا2،3). ويمكن استخدام المعلومات المتعلقة بالمواقع الدقيقة للخدمات والخدمات والخدمات الخاصة لاكتشاف المروج الأساسي ولرصد ديناميات المروج. وبالإضافة إلى ذلك، حيث أن المُعزّرين النشطين يعرضون توقيعات النسخ ثنائي الاتجاه، يمكن أيضاً استخدام بيانات CAGE في اكتشاف محسن ومراقبة ديناميكيات محسن4. وقد زادت مؤخرا CAGE منهجية شعبية نظرا لتطبيقها واسعة واستخدامها في مشاريع البحوث رفيعة المستوى مثل ترميز5، modEncode6، ومشاريع FANTOM7. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معلومات خدمات الخدمات والخدمات والخدمات التي تثبت أيضا ً أنها مهمة لتمييز الأنسجة الصحية والمريضة، حيث يمكن استخدام هذه الفحوصات لأغراض التشخيص8.
على الرغم من أن عدة طرق لرسم الخرائط TSS متوفرة (CAGE، RAMPAGE، STRT، nanoCAGE، nanoCAGE-XL، oligo-capping)، وقد أظهرت لنا وآخرون مؤخرا أن CAGE هو الأسلوب الأكثر غير متحيزة لالتقاط TSSS صحيح مع أقل عدد من الإيجابيات كاذبة9 , 10.البروتوكول قفص الأخيرة, nAnT-iCAGE11, هو البروتوكول الأكثر غير متحيزة لالتنميط TSS, كما أنه يتجنب قطع شظايا إلى علامات قصيرة باستخدام الإنزيمات تقييد ولا يستخدم PCR تضخيم. وثمة قيد على بروتوكول nAnT-iCAGE هو اشتراط كمية كبيرة من مواد البداية (على سبيل المثال، 5 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي لكل عينة). وللإجابة على أسئلة محددة ذات صلة بيولوجياً، غالباً ما يستحيل الحصول على كميات عالية من المواد الأولية (مثلاً بالنسبة للخلايا التي تم فرزها من قبل الخلايا المسلحة في مرحلة مراقبة الأصول أو المراحل الجنينية المبكرة). وأخيراً، إذا نجحت nAnT-iCAGE، فإن 1-2 نانوغرام فقط من مواد مكتبة الحمض النووي متوفرة من كل عينة، مما يحد من عمق التسلسل القابل للتحقيق.
لتمكين التنميط TSS باستخدام نانوغرام فقط من مجموع الجيش الملكي النيبالي، قمنا مؤخرا بتطوير فائقة منخفضة الإدخال الناقل-CAGE10 (SLIC-CAGE، الشكل 1). يتطلب SLIC-CAGE فقط 10 نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي للحصول على مكتبات عالية التعقيد. يعتمد بروتوكولنا على الناقل RNA الاصطناعية مصممة بعناية وأضاف إلى الجيش الملكي النيبالي من الفائدة لتحقيق ما مجموعه 5 ميكروغرام من المواد RNA. الناقل الاصطناعية يحاكي مكتبة الحمض النووي المستهدفة في توزيع الطول لتجنب التحيزات المحتملة التي يمكن أن تسببها جزيئات متجانسة في الزائدة. ويستند تسلسل الناقل على تسلسل الجين الإشريكية القولونية الكريات البيضاء-tRNAsynthetase (الجدول 1) لسببين. أولا، أي بقايا الناقل في المكتبة النهائية، حتى لو تسلسل، لن خريطة إلى جينوم eukaryotic. ثانيا، كما E. القولونية هو نوع المتوسطة، يتم تحسين الجينات التدبير المنزلي لنطاق درجة الحرارة المناسبة لSLIC-CAGE. كما أن تسلسل الحامل مضمّن مع مواقع التعرف على الإندوكليز للسماح بتحلل معين للحمض النووي المشتق من جزيئات الحمض النووي الريبي الناقل. يبقى الهدف, مكتبة [تمد-سيند] مصونة, بما أنّ ال [هووينغ] [إيندونكلس] تمييز موقعات طويلة ([إي-كوي] = 27 [بب]; I-SceI + 18 نقطة أساس) ومن غير المرجح إحصائيا أن تكون موجودة في الجينوم eukaryotic. بعد تدهور محدد للناقل وإزالة الشظايا حسب استبعاد الحجم، يتم تضخيم المكتبة المستهدفة لـ PCR وجاهزة لتسلسل الجيل التالي. اعتمادا ً على كمية RNA البداية (1-100 نانوغرام)، بين 13-18 من المتوقع أن تكون هناك حاجة دورات التضخيم PCR. وتتراوح الكمية النهائية من الحمض النووي لكل عينة بين 5-50 نانوغرام، مما ينتج عنه ما يكفي من المواد لتسلسل عميق جداً. عند استخدام 1-2 نانوغرام فقط من مجموع الحمض النووي الريبي، يمكن الكشف عن TSS صحيح; ومع ذلك، من المتوقع أن تكون المكتبات أقل تعقيدا. وأخيراً، بما أن SLIC-CAGE يستند إلى بروتوكول nAnT-iCAGE11،فإنه يتيح تعدد الإرسال من ما يصل إلى ثمانية عينات قبل التسلسل.
Protocol
1- إعداد الناقل إعداد نماذج الحمض النووي للنسخ في المختبر إعداد مزيج PCR لكل قالب PCR عن طريق الجمع بين 41 μL من الماء، 20 μL من 5x HF العازلة، 8 μL من 2.5 m dNTPs، 10 μL من 10 ميكرومتر التمهيدي الأمامي فريدة من نوعها (PCR_GN5_f1، الجدول2؛ يتم حل التمهيديات وتضعف في الماء) ، 10 μL من 2 نانوغرام / لتر قالب البلازميد التي تحتوي على الجين الناقل الاصطناعية و 1 ميكرون البوثيون البلميراز. اخلطي مزيج PCR عن طريق الأنابيب. يمكن إعداد مزيج رئيسي لجميع القوالب 10 في وقت واحد (إعداد ل ردود الفعل 11). أضف 90 ميكرولتر من مزيج PCR إلى 10 ميكرولتر لكل 10 ميكرومتر من البورال العكسي (PCR_N6_r1-r10، الجدول2). مزيج عن طريق الأنابيب. PCR تضخيم القوالب باستخدام البرنامج التالي: 98 درجة مئوية لمدة 60 ق، (98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 50 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية لمدة 30 ق) 35 دورات، 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، عقد في 4 درجة مئوية. جل تنقية من PCR تضخيم قوالب الحمض النووي إعداد جل أجاروز 1% (يوصى بذوبان الـ aagarose منخفض الذوبان). لتقليل حجم، تركيز مخاليط تفاعل PCR من 100 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر الحجم الكلي باستخدام المكثف فراغ في درجة حرارة منخفضة متوسطة (30-40 درجة مئوية). إضافة 6 μL من 6X تحميل صبغ، ومزيج جيدا، وتحميل على هلام. تشغيل الكهربائي لمدة 30 دقيقة في 1X العازلة تاي في الجهد المناسب للخزان الكهربائي المستخدمة (5-10 V / سم). في تشغيل بالتوازي 100 bp أو 1000 BP سلم الحمض النووي. باستخدام مشرط نظيف، قم بتقطيع شرائح الجل التي تحتوي على منتج PCR المستهدف. تجنب يُجنب يُجنب الجل الأجاروز. تنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة استخراج هلام (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة).ملاحظة: نسبة الحمض النووي A260/A230 المعزول من الهلام الأجاروز عادة ما تكون منخفضة (0.1-0.3). يتم عرض المنتجات المستهدفة المتوقعة والمنتجات الجانبية في الشكل 2A. الغلة المتوقعة من ردود الفعل PCR 100 ميكرولتر هي 1.2-3 ميكروغرام. النسخ في المختبر من جزيئات الناقل نسخ الناقل RNA في المختبر باستخدام البوليميراز RNA T7 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. إعداد ردود الفعل 10-20 ميكرولتر (مجموعة الموصى بها في جدول المواد). تنقية الحمض النووي الريبي في المختبر باستخدام عدة تنقية الجيش الملكي النيبالي. إعداد هضم الحمض النووي في الحل باستخدام DNase أنا اتباع تعليمات الشركة المصنعة القياسية، وإلت في الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولتر من الماء. لزيادة الغلة الإنقلاطي، اترك الماء في العمود لمدة 5 دقائق قبل التمركز.ملاحظة: يجب الحرص على عدم تجاوز الحد الأقصى من قدرة الربط للأعمدة (في مجموعة المذكورة في جدول المواد، والسعة تصل إلى 100 ميكروغرام). الإنتاجية المتوقعة من قوالب PCR 1-10 (1 kbp إلى 200 bp في الطول) هو 25-50 ميكروغرام من 10 μL في ردود الفعل النسخ في المختبر. يمكن توسيع ردود الفعل للحصول على مخزون أكبر من جزيئات الناقل. تغطية جزيئات RNA الناقل في المختبر إعداد مزيج التغطية من خلال الجمع بين 2 μL من 10X العازلة متوجا، 1 μL من 10 M GTP، 1 μL من 2 سم سام (مخففة حديثا) ، و 1 μL من Vaccinia الإنزيم متوجا لكل الناقل RNA. اخلط ما يصل إلى 10 ميكروغرام من كل جزيء ناقل في 15 ميكرولتر من الحجم الكلي والتشويه لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية. وضع على الجليد على الفور لمنع تشكيل هيكل الثانوية. اخلط الناقل المنزوع ة RNA مع 5 ميكرولتر من مزيج التغطية واحتضان لمدة ساعة في 37 درجة مئوية. تنقية جزيئات RNA المتوجة باستخدام عدة تنقية RNA — اتبع بروتوكول تنظيف الشركة المصنعة. الـ (إيلوت) في 30 ميكرولتر من الماء لزيادة الغلة الإنقلاطي، اترك الماء في العمود لمدة 5 دقائق قبل التمركز.ملاحظة: قياس التركيز باستخدام مطياف الميكروفولومتر. من المتوقع A260/A280 نسبة >2 و A260/A230 هو >2. لاحظ أن بعض عينات الحمض النووي الريبي A260/A230 قد تكون بين 1.3-2. الغلة المتوقعة عند استخدام 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي غير المغطى هو 9-10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المغطى. إعداد مزيج من الناقل توج وغير مغلّف بالجمع بين المبالغ الموصوفة في الجدول 3. اخلط جيدا ً عن طريق النقر على الأنبوب وقياس التركيز باستخدام مطياف الميكروفولومتر.ملاحظة: إذا كان هناك حاجة إلى تركيز أعلى من الناقل لتناسب في رد فعل النسخ العكسي (انظر أدناه)، يمكن تركيز مزيج الناقل باستخدام المكثف فراغ في درجة حرارة منخفضة متوسطة (30-35 درجة مئوية) حتى تصل إلى التركيز النهائي المطلوب. يتم تعديل الخطوات 2-14 من بروتوكول nAnT-iCAGE القياسي الذي أبلغ عنه موراتا وآخرون11 2. النسخ العكسي الجمع بين 1 μL من التمهيدي RT (2.5 m TCT-N6 المذاب في الماء، لتسلسل انظر الجدول التكميلي1)، 10 نانوغرام من مجموع الحمض النووي الريبي من الفائدة و 4990 نانوغرام من مزيج الناقل (الجدول3)في 10 μL من الحجم الكلي في لوحة PCR منخفضة الربط. مزيج عن طريق النقر على أنبوب.ملاحظة: إذا تم تخفيف عينة الحمض النووي الريبي للنسخ العكسي (انظر أدناه)، والجمع بين ذلك مع كمية مناسبة من الناقل، والتركيز باستخدام المكثف فراغ إلى حجم إجمالي 9 ميكرولتر، وإضافة 1 μL من التمهيدي RT. إضافة إيرل الناقل، للوصول إلى 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في المجموع يمنع فقدان العينة. سخني المزيج من الخطوة 2.1 عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ويوضع على الثلج على الفور لمنع إعادة الدمج. إعداد النسخ العكسي (RT) مزيج. لكل عينة الجمع بين 6.1 μL من المياه (RNase- وDNase خالية)، 7.6 μL من 5x العازلة حبلا الأولى، 1.9 لتر من 0.1 M DTT، 1 μL من 10 m dNTPs، 7.6 μL من مزيج تريهالوز/السوربيتول (انظر وصفة في موراتا وآخرون11)و 3.8 μL من النسخ العكسي الموصى به (انظر c 6> جدولالمواد). مزيج جيدا عن طريق النقر على أنبوب. إضافة 28 μL من مزيج RT في أنبوب PCR مع 10 ميكرولتر من الجيش الملكي النيبالي، الناقل والتمهيدي RT (إجمالي حجم 38 μL). تخلط جيدا عن طريق الأنابيب.ملاحظة: هذا المزيج هو لزج للغاية بسبب تريهالوز / السوربيتول. يُخلط المزيج حتى يصبح متجانساً بشكل واضح. احتضان في دورة الحرارية باستخدام البرنامج التالي: 25 درجة مئوية لمدة 30 s، 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، وعقد في 4 درجة مئوية. تنقية cDNA: RNA الهجينة باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI إضافة 68.4 μL من RNAse الموصى بها- وDNase خالية من SPRI الخرز (انظر جدولالمواد) إلى 38 μL من مزيج RT (الخرز إلى نسبة عينة 1.8:1). اخلطي جيداً عن طريق الأنابيب واحتضانلمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). فصل الخرز على موقف المغناطيسي لمدة 5 دقيقة.ملاحظة: يضاف الإيثانول إلى الخرز دون خلط وبينما الأنبوب على موقف المغناطيسي. يتم إزالة الإيثانول المضافة على الفور. وينبغي الحرص على عدم فقدان أي حبات أثناء البلل كما قد يؤدي إلى فقدان العينة. في حين أن الأنبوب لا يزال على الموقف المغناطيسي، وإزالة جميع آثار الإيثانول. يمكن إزالة قطرات الإيثانول ودفعه من الأنبوب باستخدام ماصة P10. لا تدع الخرز الجافة. إضافة 42 μL من المياه السخنة في 37 درجة مئوية إلى الخرز وelute العينة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 60X.ملاحظة: يجب الحرص على عدم التسبب في رغوة عن طريق الأنابيب كما أنه قد يسبب فقدان الخرز (أي.عينة ملزمة) في الرغوة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق دون غطاء للسماح تبخر كميات ضئيلة من الإيثانول. فصل الخرز على موقف المغناطيسي لمدة 5 دقائق ونقل supernatant إلى لوحة جديدة.ملاحظة: في محاولة لاسترداد كل supernatant لمنع فقدان العينة مع تجنب حمل حبة. استخدام ماصة P10 للحصول على قطرات عينة الماضي. 3. الأكسدة أضف 2 ميكرولتر من 1 M NaOAc (درجة البكسل 4.5) في رد فعل RT المنقى. مزيج بواسطة الأنابيب، إضافة 2 μL من 250 mM NaIO4 ومزيج مرة أخرى. يُغطّى الطبق بورق الألومنيوم لتجنب الضوء. إضافة 16 ميكرولتر من ثلاثي ةيفي (درجة البكسل 8.5) في مزيج الأكسدة لتحييد درجة الزبالة. تنقية cDNA أكسدة: RNA الهجينة باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI. إضافة 108 μL من الخرز SPRI إلى 60 μL من مزيج الأكسدة (1.8:1 الخرز إلى نسبة العينة). كرر تنقية كما هو موضح في الخطوات 2.6.1-2.6.6. العود باستخدام 42 μL من الماء السخن ة إلى 37 درجة مئوية.ملاحظة: إعداد حديثا 250 m NaIO4 عن طريق إضافة 18.7 ميكرولتر من الماء لكل 1 ملغ من NaIO4. NaIO4 حساسة للضوء. لذلك، والحفاظ على الحل في أنبوب مغطى رقائق الألومنيوم أو في أنبوب مقاومة للضوء. 4. البائية أضف 4 ميكرولتر من 1 M NaOAc (الرقم البوذي برقم 6.0) في الأنبوب الذي يحتوي على عينة مؤكسدة نقية وتخلط بواسطة الأنابيب. أضف 4 ميكرولتر من محلول البيوتين 10 مللي أمبير، ويخلط عن طريق التنغيم واحتضان لمدة 2 ساعة عند 23 درجة مئوية في دورة حرارية لتجنب الضوء.ملاحظة: إعداد محلول البيوتين عن طريق خلط 50 ملغ من البيوتين مع 13.5 مل من DMSO. جعل استخدام واحد aliquots وتجميد في -80 درجة مئوية. تنقية cDNA تنقية biotinylated: RNA الهجينة باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI. إضافة 12 ميكرولتر من 2-بروبانول ومزيج عن طريق الأنابيب. أضف 108 ميكرولتر من خرز SPRI (1.8:1 الخرز إلى نسبة العينة) وكرر التنقية كما هو موضح في الخطوات 2.6.1-2.6.6. العود باستخدام 42 μL من الماء السخن ة في 37 درجة مئوية.ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا، وعينات مجمدة عند -80 درجة مئوية. 5. RNase I عسر الهضم إعداد مزيج RNase I عن طريق خلط 4.5 μL من 10x RNase I العازلة مع 0.5 ميكرولتر من RNase I (10 U / لتر) لكل عينة. مزيج عن طريق الأنابيب. أضف 5 ميكرولتر من المزيج إلى كل عينة نقية (45 ميكرولتر في المجموع). اخلطي هابين واحتضان لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. 6. إعداد الخرز العقدي لكل عينة، مزيج 30 μL من الطين الخرز العقدي مع 0.38 ميكرولتر من 20 ملغ / مل tRNA. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة وتخلط كل 5 دقائق عن طريق النقر على أنبوب.ملاحظة: إعادة تعليق الطين الخرز العقدي جيدا قبل الأنابيب عن طريق النقر على الزجاجة. يجب أن يتم إعداد حل tRNA وفقا لموراتا وآخرون11 افصل الخرز على الحامل المغناطيسي لمدة 2-3 دقائق. اغسل الخرز عن طريق إعادة تعليق في 15 μL من العازلة A. فصل الخرز على موقف المغناطيسي لمدة 2-3 دقيقة وإزالة supernatant. كرر الغسيل وإزالة supernatant. قم بتعليق حبات في 105 μL من العازلة A وإضافة 0.19 ميكرولتر من 20 ملغ / مل من tRNA. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب.ملاحظة: يجب أن تكون جاهزة الخرز الطازجة قبل الاستخدام. بدء التحضير للخرز خلال RNase أنا الهضم. لعينات متعددة إعداد الخرز معا في أنبوب واحد. 7. كاب– فخ ربط العينة إضافة 105 μL من الخرز الستربتين أعدت إلى 45 μL من عينة RNase I-المعالجة. اخلطي جيداً عن طريق التمطي واحتضان هُنا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. افصل الخرز على الحامل المغناطيسي لمدة 2-3 دقائق. غسل الخرز إضافة 150 μL من العازلة غسيل A وإعادة تعليق الخرز عن طريق الأنابيب. افصل الخرز على الحامل المغناطيسي لمدة 2-3 دقائق وقم بإزالة النواهي. إضافة 150 μL من العازلة غسيل B وإعادة تعليق الخرز عن طريق الأنابيب. افصل الخرز على الحامل المغناطيسي لمدة 2-3 دقائق وقم بإزالة النواهي. إضافة 150 μL من العازلة غسيل C وإعادة تعليق الخرز عن طريق الأنابيب. افصل الخرز على الحامل المغناطيسي لمدة 2-3 دقائق وقم بإزالة النواهي.ملاحظة: وينبغي أن تكون المخازن المؤقتة B و C مسخنة إلى 37 درجة مئوية. وصفات للمخازن المؤقتة للغسيل A و B و C كما هو موضح في موراتا وآخرون11 الإفراج عن cDNA إعداد 1X RNase I العازلة عن طريق خلط 58.5 μL من الماء مع 6.5 ميكرولتر من 10X RNase I العازلة. إعادة تعليق الخرز في 35 μL من 1X RNase I العازلة. احتضان في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ونقل مباشرة على الجليد لمدة 2 دقيقة لمنع إعادة تكوين cDNA. عقد الأغطية أثناء نقل إلى الجليد لأنها قد البوب قبالة بسبب تراكم الضغط. افصل الخرز لمدة 2-3 دقائق على حامل مغناطيسي ونقل الفوقإلى لوحة جديدة. إعادة تعليق الخرز في 30 μL من 1X RNase I العازلة. فصل الخرز على الحامل المغناطيسي لمدة 2-3 دقيقة ونقل supernatant إلى supernatant التي تم جمعها سابقا (يجب أن يكون الحجم الإجمالي للcDNA الإلبيتة حوالي 65 μL). 8. إزالة الجيش الملكي النيبالي بواسطة H رناز وRNase أنا الهضم لكل عينة، والجمع بين 2.4 ميكرولتر من الماء، 0.5 ميكرولتر من 10x RNase I العازلة، 0.1 ميكرولتر من RNase H، و 2 μL من RNase I. إضافة 5 μL من هذا المزيج إلى 65 μL من عينة cDNA صدر ومزيج عن طريق الأنابيب. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وعقد في 4 درجة مئوية. تنقية cDNA من مزيج الهضم RNase باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI. إضافة 126 μL من الخرز SPRI إلى 70 μL من رد فعل التدهور ومزيج من قبل الأنابيب. اتبع خطوات التنقية كما هو موضح لتنقية خرز SPRI في 2.6.1-2.6.6. العود باستخدام 42 μL من الماء السخن ة في 37 درجة مئوية كما هو موضح. إعداد RNase أنا مزيج من خلال الجمع بين 4.5 ميكرولتر من 10X RNase I العازلة و 0.5 ميكرولتر من RNase I. إضافة 5 μL من مزيج RNase إلى 40 ميكرولتر من عينة cDNA تنقية. اخلطي هاكب الأنابيب واحتضانه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تنقية العينة باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI. إضافة 81 μL من الخرز SPRI إلى 45 μL من رد فعل التدهور ومزيج من قبل الأنابيب. اتبع خطوات التنقية كما هو موضح لتنقية خرز SPRI في 2.6.1-2.6.6. العود باستخدام 42 ميكرولتر من الماء كما هو موضح. 9. ربط 5 ‘ لينكر تركيز عينة cDNA تنقية إلى 4 μL باستخدام المكثف فراغ. الحفاظ على درجة الحرارة في 30-35 درجة مئوية. اختبار مستوى الصوت باستخدام ماصة. إذا كانت العينة قد جفت إلى اكتمال، تذوب عن طريق إضافة 4 μL من الماء.ملاحظة: فمن الأفضل لتجنب التجفيف إلى اكتمال لمنع فقدان العينة. تحضن العينة المركزة عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتوضع على الجليد على الفور لمدة 2 دقيقة لمنع إعادة الدمج. عقد الأغطية أثناء نقل الأنابيب كما الأغطية قد تنفجر بسبب تراكم الضغط. احتضان 4 ميكرولتر من 2.5 μM 5 ‘ linker في 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ووضع فورا على الجليد لمدة 2 دقيقة لمنع إعادة الناطور. امزج 4 ميكرولتر من وصلة 2.5 ميكرومتر 5 مع 4 ميكرولتر من العينة.ملاحظة: وينبغي إعداد الرابط 5 ‘وفقا للجدول التكميلي2، والجدول التكميلي3، والجدول التكميلي4، والجدول 5التكميلي. تملي الوصلة الـ 10 μM 5’ إلى تركيز 2.5 ميكرومتر باستخدام 100 مل من كلوريد الصوديوم قبل الاستخدام. إضافة 16 μL من الربط المسبق (انظر جدولالمواد) إلى linker 5 ‘مختلطة وعينة وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب. احتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. تنقية مزيج الربط باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI. أضف 43.2 ميكرولتر من خرز SPRI واتبع الخطوات 2.6.1–2.6.6. العود كما هو موضح باستخدام 42 μL من الماء السخن ة في 37 درجة مئوية. كرر تنقية القيام به في الخطوة 9.6 عن طريق إضافة 72 μL من الخرز SPRI إلى supernatant نقل (1.8:1 الخرز إلى نسبة العينة).ملاحظة: تحتوي الوصلات 5 على رموز شريطية تسمح بتجميع ما يصل إلى ثماني عينات قبل التسلسل (تتوفر ثمانية رموز بارتوكلي ثلاثية النوكليوتيد، كما هو موضح في موراتا وآخرون11 والجدول التكميلي1). 10. ربط 3’ لندر تركيز العينة النقية إلى 4 μL باستخدام المكثف فراغ كما هو موضح في الخطوة 9.1. تحضن العينة المركزة عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتوضع على الجليد على الفور لمدة 2 دقيقة لمنع إعادة الدمج. عقد الأغطية أثناء نقل الأنابيب كما الأغطية قد تنفجر بسبب تراكم الضغط. احتضان 4 ميكرولتر من 2.5 μM 3 ‘ linker في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ووضع فورا على الجليد لمدة 2 دقيقة لمنع إعادة الناطور. أضف 4 ميكرولتر من وصلة الـ 2.5 μM 3’ إلى 4 ميكرولتر من العينة المركزة. إضافة 16 μL من الربط المسبق وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب. احتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. تنقية مزيج الربط باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI. أضف 43.2 ميكرولتر من خرز SPRI واتبع الخطوات 2.6.1–2.6.6. العود كما هو موضح باستخدام 42 μL من الماء السخنة إلى 37 درجة مئوية.ملاحظة: وينبغي إعداد الرابط 3 ‘وفقا للجداول التكميلية 6 والجدول التكميلي 7. تمييع الوصلة الـ 10 μM 3’ إلى تركيز 2.5 ميكرومتر باستخدام 100 مل من كلوريد الصوديوم. 11. إزالة الفوسفور إعداد مزيج SAP عن طريق الجمع بين 4 μL من الماء، 5 μL من 10X SAP العازلة، و 1 μL من انزيم SAP. إضافة 10 μL من مزيج SAP إلى عينة تنقية الليغاتيد (الحجم الإجمالي 50 μL) واحتضان في thermocycler باستخدام البرنامج التالي: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وعقد في 4 درجة مئوية. 12. تدهور 3 ‘ حبلا العلوي Linker باستخدام الإنزيم ختان محددة Uracil إضافة 2 μL من الإنزيم ختان محددة (انظر جدولالمواد) إلى عينة dephosphorylated، مزيج عن طريق الأنابيب واحتضان في thermocycler باستخدام البرنامج التالي: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ووضع على الفور على الجليد لمدة 2 دقيقة إلى منع reannealing من حبلا العليا مجزأة. تنقية خليط التفاعل عن طريق إضافة 93.6 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي SPRI إلى خليط 52 ميكرولتر وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب. كرر خطوات التنقية 2.6.1-2.6.6. العود مع 42 μL من الماء السخنة في 37 درجة مئوية كما هو موضح. 13. التوليف حبلا الثانية إعداد مزيج توليف الخفيب الثاني (يتم التعبير عن الكميات لكل عينة) عن طريق الجمع بين 5 ميكرولتر من 10x الحمض النووي بولميراز رد فعل العازلة، 2 ميكرولتر من الماء، 1 μL من 10 m dNTPs، 1 μL من 50 μM nAnT-iCAGE التمهيدي حبلا الثانية (تسلسل هو في الجدول التكميلي1) و 1 μL من D NA exonuclease-نقص البلمرات (انظر البلميراز الموصى بها في جدولالمواد). إضافة 10 μL من المزيج إلى عينة تنقية وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب (إجمالي حجم 50 μL). احتضان في دورة الحرارية باستخدام البرنامج التالي: 95 ° C لمدة 5 دقيقة، 55 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وعقد في 4 درجة مئوية. 14. تدهور الثاني التوليف حبلا التمهيدي باستخدام Exonuclease 1 إضافة 1 μL من Exonuclease I إلى خليط توليف حبلا الثاني. اخلطي جيداً عن طريق التجريف واحتضان 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تليها الإمساك عند 4 درجات مئوية. تنقية الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل عن طريق إضافة 91.8 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي SPRI إلى 51 ميكرولتر من عينة إكسونوكليز I-المعالجة. كرر خطوات التنقية الموصوفة في 2.6.1-2.6.6. وelute مع 42 μL من الماء السخنة إلى 37 درجة مئوية كما هو موضح. تركيز العينة باستخدام المكثف فراغ إلى 15 μL كما هو موضح في الخطوة 9.1. 15. مراقبة الجودة والكمية استخدم 1 ميكرولتر من العينات المركزة وتشغيل رقاقة الحمض النووي عالية الحساسية على محلل جودة الحمض النووي. ويرد الشكل 3للملف/الكمية المتوقعة. 16- الجولة الأولى من تدهور الناقل إعداد مزيج التحلل عن طريق الجمع بين 2 ميكرولتر من الماء، 2 ميكرولتر من العازلة الإنزيم تقييد 10X، 1 ميكرولتر من I-SceI، و 1 μL من I-CeuI. إضافة 6 μL من مزيج التحلل إلى 14 μL من العينة المركزة ومزيج عن طريق الأنابيب. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعة تليها 20 دقيقة التعطيل عند 65 درجة مئوية وعقد في 4 درجة مئوية. تنقية مزيج التحلل باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI. إضافة 5 μL من الماء لزيادة حجم مزيج التدهور وإضافة 45 μL من الخرز SPRI (1.8:1 الخرز إلى نسبة العينة). كرر التنقية كما هو موضح في الخطوات 2.6.1-2.6.6. وelute مع 42 μL من الماء السخنة إلى 37 درجة مئوية. تركيز العينة المُشار إليها من 42 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر من الحجم الإجمالي كما هو موضح في الخطوة 9-1. 17. التحكم في مستوى التدهور وتحديد عدد دورات تضخيم PCR إعداد مزيج qPCR لتضخيم المكتبات بأكملها (مزيج محول). الجمع بين 3.8 ميكرولتر من الماء، 5 μL من قبل كبسر (2x)، 0.1 ميكرولتر من 10 μM محول-f1 التمهيدي (5′-AATGATACGGCGACCACCGA-3′)، و 0.1 μL من 10 μM محول_r1 التمهيدي (5′-CAAGCAGAGACGAGA-3′) لكل عينة (انظر جدول المواد لpremix qPCR الموصى بها). الجمع بين 9 μL من المزيج محول qPCR مع 1 μL من عينة من الخطوة 16.4 وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب. إعداد مزيج qPCR لتضخيم الحمض النووي المستمدة من الناقل (مزيج الناقل). الجمع بين 3.8 ميكرولتر من الماء، 5 μL من قبل المزيج المسبق qPCR (2x)، 0.1 ميكرولتر من 10 μM carrier_f1 التمهيدي (5′-GCGGCAGCGTGCTATAAC-3’)، و 0.1 μL من 10 μM محول_r1 التمهيدي لكل عينة الجمع بين 9 μL من الناقل qPCR مزيج مع 1 μL من العينة من الخطوة 16.4 وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب. تعيين برنامج qPCR: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (95 درجة مئوية لمدة 20 ق، 60 درجة مئوية لمدة 20 ق، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة) وكرر 40X، تليها منحنى تشوه صك محدد (65-95 درجة مئوية)، وعقد في 4 درجة مئوية.ملاحظة: إعداد التحكم السلبي عن طريق استبدال العينة بالماء. 18. PCR تضخيم المكتبة المستهدفة إعداد مزيج التضخيم PCR عن طريق الجمع بين 6 μL من الماء، 0.5 ميكرولتر من 10 μM محوّل 10، 0.5 ميكرولتر من 10 μM محول_r1 التمهيدي و 25 μL من PCR premix (2x). مزيج بواسطة الأنابيب (انظر جدول المواد لPCR premix الموصى بها). إضافة 32 μL من مزيج PCR إلى 18 μL من العينة من الخطوة 16.4. اخلطي جيداً عن طريق الأنابيب. تعيين التضخيم PCR: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقيقة، (98 درجة مئوية لمدة 20 ق، 60 درجة مئوية لمدة 15 ق، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة) دورات 12-18، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وعقد في 4 درجة مئوية.ملاحظة: يتم تحديد العدد الدقيق لدورات PCR من خلال نتائج qPCR ويتوافق مع قيمة Ct التي تم الحصول عليها مع مزيج التمهيدي المُكيّف (عدد دورات PCR يساوي قيمة Ct). تنقية العينة تضخيم بإضافة 90 μL من الخرز المغناطيسي SPRI إلى 50 ميكرولتر من عينة تضخيم ومزيج جيدا عن طريق الأنابيب. كرر خطوات تنقية الموضحة في الخطوات 2.6.1-2.6.6. وإلتال العينة باستخدام 42 ميكرولتر من الماء كما هو موضح. 19- الجولة الثانية من تدهور الناقل كرر الخطوات 16.1-16.3. تنقية مزيج التحلل باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI. إضافة 10 μL من الماء إلى العينة لزيادة حجم ومزيج مع 30 μL من الخرز SPRI (1:1 الخرز إلى نسبة العينة). كرر التنقية كما هو موضح في الخطوات 2.6.1-2.6.6. وelute مع 42 μL من الماء السخنة في 37 درجة مئوية كما هو موضح. تركيز العينة المُشار إليها من 42 ميكرولتر إلى 30 ميكرولتر من الحجم الإجمالي. 20. اختيار حجم المكتبة امزج 24 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي SPRI مع 30 ميكرولتر من العينة من الخطوة 19.3. (0.8:1 الخرز إلى نسبة العينة). كرر خطوات تنقية كما هو موضح في الخطوات 2.6.1-2.6.6. وإلتال العينة في 42 ميكرولتر من الماء كما هو موضح. تركيز العينة إلى حوالي 14 μL كما هو موضح في الخطوة 9.1. 21. مراقبة الجودة تقييم حجم التوزيع تشغيل 1 μL من العينة على رقاقة الحمض النووي عالية الحساسية. وترد النتائج المتوقعة في الشكل4.ملاحظة: إذا كانت الأجزاء أقصر من 200 نقطة أساس مرئية (انظر المثال في الشكل 4A,C)،يجب تكرار تحديد الحجم (الخطوات 20.1-20.2) حتى تتم إزالة الأجزاء القصيرة (الشكل4B,D). عادة واحدة [رووند] إضافيّة من حجم إنتقاء كافي. إذا كانت كمية الشظايا القصيرة شديدة (كما هو الحال في الشكل 4C)،ينبغي أن تنخفض نسبة الخرز إلى العينة إلى 0.6:1. مراقبة جودة التدهور في الناقل كرر الخطوات 17.1-17.5.ملاحظة: اعتمادا على تركيز المكتبات المقدرة في HS DNA رقاقة تشغيل (تحليل المنطقة)، والعينات تحتاج إلى تخفيف قبل qPCR. استخدم 0.5 ميكرولتر من العينة لتجنب فقدان العينة والتخفيف من 100 إلى 500 ضعف في الماء (تمييع إلى التركيز النهائي 1-20 pg/μL). الفرق المتوقع بين قيم Ct التي تم الحصول عليها مع المحول ومزيج الناقل هو 5-10. التكميم الكمي للمكتبة إعداد تخفيف العمل من معيار الحمض النووي لامدا عن طريق خلط 20 ميكرولتر من 100 ملغ / مل لامدا الحمض النووي القياسية مع 980 ميكرولتر من 1X TE (إعداد عن طريق تخفيف 20X TE المقدمة في مجموعة قياس كمية الحمض النووي). يمكن تخزين تخفيف الحمض النووي لامدا في -20 درجة مئوية. إعداد المخففات لامدا الحمض النووي التسلسلي القياسية عن طريق خلط معيار لامدا المخفف و 1X TE وفقا للجدول التكميلي 8.ملاحظة: للحصول على دقة أعلى، يوصى بإضافة 100 ميكرولتر من العازل الـ 1 أضعاف الـ TE إلى جميع الأنابيب وإزالة حجم 1x TE حسب الحاجة لكل حجم من اللامدا المخفف ليتم إضافتها. لا تستخدم أكثر من 1 ميكرولتر من المكتبة؛ استخدام 384 لوحات الآبار لهذا القياس ينصح.
Representative Results
يصف هذا التقرير البروتوكول الكامل لـ SLIC-CAGE للحصول على مكتبات جاهزة للتسلسلمن نانوغرام من مواد RNA الكلية (الشكل 1). للحصول على مزيج الناقل الجيش الملكي النيبالي الاصطناعية، أولا، قوالب الناقل PCR تحتاج إلى أن تكون مستعدة وهلام تنقية للقضاء على المنتجات الجانبية PCR (الشكل2A). يتم إنتاج كل قالب PCR (عشرة في المجموع) باستخدام مشترك إلىالأمام، ولكن التمهيدي العكسي مختلفة (الجدول 2)، مما يؤدي إلى أطوال مختلفة من قالب PCR لتمكين تقلب حجم الناقلين RNA الاصطناعية. مرة واحدة تنقية، وتستخدم قوالب PCR للنسخ في المختبر من جزيئات الناقل. ومن المتوقع منتج حامل RNA واحد إذا كانت القوالب هي هلام تنقية (انظر ممثل هلام التحليل في الشكل 2B). ويمكن رفع مستوى إعداد الناقل اعتمادا على الحاجة، وعند إعداده، مختلطة ومجمدة في -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل. باستخدام الحد الأدنى الموصى به من عينة مجموع الحمض النووي الريبي (10 نانوغرام) جنبا إلى جنب مع دورات 16-18 من تضخيم PCR، يمكن تحقيق عالية التعقيد SLIC-CAGE المكتبات. ويعتمد عدد دورات PCR المطلوبة لتضخيم المكتبة النهائية إلى حد كبير على كمية إجمالي المدخلات التي يستخدمها الجيش الملكي النيبالي (يعرض العدد المتوقع للدورات في الجدول4). بعد الجولة الأولى من التدهور، في نتائج qPCR (الخطوة 17)، الفرق المتوقع بين القيم Ct التي تم الحصول عليها باستخدام adaptor_f1 أو التمهيدي carrier_f1 هو 1-2، مع قيم Ct التي تم الحصول عليها مع adaptor_f1 أقل من مع carrier_f1. توزيع أطوال جزء في المكتبة النهائية بين 200-2،000 نقطة أساس مع حجم جزء متوسط من 700-900 نقطة أساس (استنادا إلى تحليل المنطقة باستخدام Bioanalyzer البرمجيات، الشكل 4B، D). شظايا أقصر، كما هو معروض في الشكل 4A، C، يجب إزالتها بجولات إضافية من استبعاد الحجم (الخطوات 20-21). هذه الأجزاء القصيرة هي قطع أثرية تضخيم PCR وليس المكتبة المستهدفة. لاحظ أن أجزاء أقصر الكتلة بشكل أفضل على تسلسل تدفق الخلايا وقد يسبب مشاكل التسلسل. والكمية المتوقعة من مواد المكتبة التي يتم الحصول عليها لكل عينة تتراوح بين 5-50 نانوغرام. وتدل المبالغ الأقل بكثير على فقدان العينة أثناء البروتوكول. إذا كانت الكمية المنخفضة التي تم الحصول عليها كافية للتسلسل (2-3 ng من المكتبات المجمعة مطلوبة)، قد تكون المكتبات أقل تعقيداً (انظر أدناه). اعتماداً على آلة التسلسل، قد تحتاج كمية المكتبة المحملة على خلية التدفق إلى تحسين. باستخدام Illumina HiSeq 2500، تحميل 8-12 pM SLIC-CAGE يعطي المكتبات في المتوسط 150-200 مليون يقرأ، مع > 80٪ من يقرأ تمرير درجة الجودة Q30 كعتبة. ثم يتم تعيين القراءات التي تم الحصول عليها إلى الجينوم المرجعي [لقراءات 50 نقطة ب المائة، يمكن استخدام Bowtie212 مع المعلمات الافتراضية التي تسمح بعدم تطابق صفر لكل تسلسل البذور (22 نقطة أساس)]. وتعتمد الكفاءات المتوقعة في رسم الخرائط على إجمالي كمية مدخلات الحمض النووي الريبي، وهي معروضة في الجدول5. ويمكن بعد ذلك تحميل القراءات المعينة بشكل فريد في بيئة الحوسبة الرسومية والإحصائيةR 13 ومعالجتها باستخدام CAGEr (حزمة الموصلات الحيوية14). يسهل اتباع المقالة المصغرة للحزمة وتشرح سير العمل ومعالجة البيانات المعينة بالتفصيل. وسهولة التحكم البصري في تعقيد المكتبة هو توزيع عرض المروج، حيث أن المكتبات ذات التعقيدات المنخفضة سيكون لها مروجون ضيقون بشكل مصطنع (الشكل5A،مكتبة SLIC-CAGE المستمدة من 1 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي، للحصول على التفاصيل انظر السابقة 10ةيلاب ةيلاب ةيلاب ومع ذلك، حتى المكتبات SLIC-CAGE منخفضة التعقيد تسمح بتحديد CTSS صحيح، مع دقة أكبر من الأساليب البديلة لرسم الخرائط TSS منخفضة/ متوسطة الدخل (الشكل5B،C). الشكل 1: الخطوات في بروتوكول SLIC-CAGE. يتم خلط عينة الجيش الملكي النيبالي مع مزيج الناقل RNA لتحقيق 5 ميكروغرام من مجموع المواد RNA. يتم توليف cDNA من خلال النسخ العكسي ويتم أكسدة الغطاء باستخدام الصوديوم periodate. يسمح الأكسدة بإرفاق البيوتين بالغطاء باستخدام البيوتين هيدرازيد. البيوتين يحصل تعلق على نهاية MRNA 3′, كما أنها أكسدة أيضا باستخدام الصوديوم periodate. للقضاء على البيوتين من مرنا: cDNA الهجينة مع cDNA توليفها بشكل غير كامل ومن 3′ نهايات من مرنا, يتم التعامل مع العينات مع RNase I. cDNA التي وصلت إلى نهاية 5′ من مرنا ثم يتم اختيارها عن طريق تنقية التقارب على الخرز المغناطيسي streptavidin ( كاب- فخ). بعد إطلاق ال [كدنا], 5′- و [3-لينكرس] [لبيتد]. وتتدهور جزيئات المكتبة التي تنشأ من الناقل باستخدام I-SceI وI-CeuI homing endonucleases ويتم إزالة الشظايا باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI. ثم يتم تضخيم المكتبة PCR. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: تحليل الجل التمثيلي لقوالب الناقل PCR والنسخ المستعملة في المختبر. (أ) قوالب الناقل PCR قبل تنقية هلام: البئر الأول يحتوي على علامة 1 كيلوبت في الثانية، تليها الناقل PCR قوالب 1، 1-10. (ب) الناقل في النصوص في المختبر: البئر الأول يحتوي على علامة 1 كيلوبت في الثانية، تليها نسخ الناقل 1-10. وقد تم تشويه نسخ الناقل عن طريق التدفئة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية قبل التحميل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: تتبع SLIC-CAGE قبل الجولة الأولى من تدهور الناقل ة من نوع الحمض النووي (رقاقة الحمض النووي عالية الحساسية). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: آثار نوعية الحمض النووي التمثيلي (رقاقة الحمض النووي عالية الحساسية) لمكتبات SLIC-CAGE بعد تضخيم PCR. (A) مكتبة SLIC-CAGE التي تتطلب اختيار حجم إضافية لإزالة أجزاء قصيرة. (ب) SLIC-CAGE مكتبة بعد حجم اختيار باستخدام 0.6x SPRI الخرز إلى نسبة العينة. (C) مكتبة SLIC-CAGE من كمية الإخراج أقل التي تتطلب تحديد حجم لإزالة جزء قصير. (د) SLIC-CAGE مكتبة أقل كمية الإخراج بعد حجم اختيار باستخدام 0.6:1 SPRI الخرز إلى نسبة العينة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: التحقق من صحة مكتبات SLIC-CAGE. (أ) توزيع عرض علامة الكتلة بين الجوانتيل في مكتبات SLIC-CAGE التي أعدت من 1 أو 5 أو 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي الكلي S. cerevisiae، وفي مكتبة nAnT-iCAGE التي أعدت من 5 ميكروغرام من S. سيريفيسياي مجموع الجيش الملكي النيبالي. يشير مقدار كبير من الكتل العلامات الضيقة في مكتبة SLIC-CAGE 1 ng إلى تعقيدها المنخفض. (B) منحنيات ROC لتعريف CTSS في مكتبات S. cerevisiae SLIC-CAGE. جميع S. cerevisiae nAnT-iCAGE CTSSs كانت تستخدم كمجموعة حقيقية. (C) منحنيات ROC لتحديد CTSS في مكتبات S. cerevisiae nanoCAGE. جميع S. cerevisiae nAnT-iCAGE CTSSs كانت تستخدم كمجموعة حقيقية. مقارنة منحنيات ROC تبين أن SLIC-CAGE يتفوق بقوة nanoCAGE في تحديد CTSS. تم استخدام البيانات من صفيف Express E-MTAB-6519. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الجدول 1: تسلسل المورّثة الاصطناعية الناقل. مواقع I-SceI جريئة ومائلة باللون الأرجواني، ومواقع التعرف على I-CeuI خضراء. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف. الناقل عكس التمهيدي 5′-3′ طول المنتج PCR / bp 1 PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGGAGAATT 1034 2 PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGTGTGTGAGGC 966 3 PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGATCTCTTTACG 889 4 PCR_N6_r4: NNNNNNNNGCCGTCGATAACTGTGTGT 821 5 PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGGCGCGTTC 744 6 PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAGAAGAATGTGTCCCA 676 7 PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGCCTCCAGTCATAAC 599 8 PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGGTGTGTCGTAC 531 9 PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG 454 10 PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTCAGCA 386 * التمهيدي إلى الأمام هو نفسه لجميع قوالب الناقل. يتم وضع خط تحت تسلسل المروج T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNCAGCGTCGCTA الجدول 2: القوالب الأولية لتضخيم قالب الحامل. التمهيدي إلى الأمام هو نفسه لجميع قوالب الناقل. يتم وضع خط تحت تسلسل المروج T7. PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTCGCTA. باستخدام التمهيديات العكسية المختلفة، يتم إنتاج قوالب PCR وبالتالي RNA الناقل من طول مختلفة. الناقل طول غير مغلّف/ميكروغرام متوج / ميكروغرام 1 1034 3.96 0.45 2 966 8.36 0.95 3 889 4.4 0.5 4 821 6.6 0.75 5 744 4.4 0.5 6 676 3.08 0.35 7 599 4.4 0.5 8 531 3.96 0.45 9 454 2.64 0.3 10 386 2-2 0.25 الجدول 3: مزيج الناقل RNA. في المجموع 49 ميكروغرام من مزيج الناقل 0.3-1 كيلو بت في الثانية: غير محدد = 44 ميكروغرام، توج = 5 ميكروغرام. إجمالي المدخلات RNA / NG دورات PCR 1 نانوغرام 18 2 نانوغرام 17 5 نانوغرام 16 10 نانوغرام 15-16 25 نانوغرام 14-15 50 نانوغرام 13-15 100 نانوغرام 12-14 الجدول 4: العدد المتوقع من دورات PCR في الاعتماد على عينة من مجموع المدخلات RNA. ويستند عدد تقريبي من دورات على التجارب التي أجريت باستخدام سكريروميسيس سيريفيسياي, Drosophila الميلانوجاستر, وMUS MUS MUSCULUS مجموع الجيش الملكي النيبالي. مجموع المدخلات في الحمض النووي الريبي/ng النسبة المئوية الإجمالية للتعيين % تعيين فريد النسبة المئوية للناقل 1 نانوغرام 30 20-30 30 2 نانوغرام 60 20-50 10 5 نانوغرام 60-70 40-60 5-10 10 نانوغرام 60-70 40-60 5-10 25 نانوغرام 65-80 40-70 0-5 50 نانوغرام 65-80 40-70 0-3 100 نانوغرام 70-85 40-70 0-2 الجدول 5: الكفاءة المتوقعة لرسم الخرائط واعتماد إجمالي كمية المدخلات في الجيش الملكي النيبالي. يتم تقديم الأرقام التقريبية وتستند إلى التجارب التي أجريت باستخدام Saccharomyces سيريفيسياي وMus musculus مجموع الجيش الملكي النيبالي.
Discussion
من المهم جداً استخدام النصائح والأنابيب المنخفضة الربط لمنع فقدان العينات بسبب الامتصاص. في جميع الخطوات التي تنطوي على استرجاع supernatant، فمن المستحسن لاسترداد حجم العينة بأكمله. بما أن البروتوكول له عدة خطوات، فإن فقدان العينة المستمر يؤدي إلى مكتبات غير ناجحة.
إذا لم يتم تنفيذ CAGE (nAnT-iCAGE) بشكل روتيني، فمن الأفضل اختبار SLIC-CAGE بكميات مدخلات مختلفة (10 نانوغرام، 20 نانوغرام، 50 نانوغرام، 100 نانوغرام، 200 نانوغرام) من نفس عينة الحمض النووي الريبي الإجمالي ومقارنة المكتبات nAnT-iCAGE التي يتم إعدادها باستخدام 5 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي. إذا كانت مكتبة nAnT-iCAGE غير ناجحة (أقل من 0.5-1 نانوغرام من مكتبة DNA التي تم الحصول عليها لكل عينة)، من غير المحتمل أن يعمل SLIC-CAGE، ويلزم تقليل فقدان العينة.
وثمة خطوة حاسمة لضمان وجود مكتبات عالية الجودة خالية من الحمض النووي الريبي المتردي أو RRNA غير المغطى هو تحديد الغطاء الموصوف في القسم 7. من المهم جدا أن يتم إعادة تعليق الخرز ستربتينين تماما في المخازن المؤقتة غسل وأن تتم إزالة المخازن العازلة غسل قبل الاستمرار في الخطوة التالية غسل أو الإلتواء من cDNA.
إذا كانت النتائج من qPCR بعد الجولة الأولى من تدهور الناقل لا تظهر أي فرق بين استخدام التمهيديات adaptor_f1 وcarrier_f1، لا يزال يوصى بمواصلة البروتوكول. إذا كان الفرق في قيم Ct أقل من خمسة بعد الجولة الثانية من تدهور الناقل، يوصى بإجراء جولة ثالثة من تدهور الناقل. لم نجد أبدا جولة ثالثة من التدهور اللازمة، وإذا حدث ذلك، فمن المستحسن أن تحل محل الأسهم ايندونوكلليز.
قد يتم إضافة جولات إضافية من تضخيم PCR إلى البروتوكول إذا كان المبلغ النهائي للمكتبة التي تم الحصول عليها غير كافية للتسلسل. ويمكن بعد ذلك تعيين تضخيم PCR بعدد ضئيل من دورات التضخيم اللازمة لإنتاج ما يكفي من المواد للتسلسل، مع الأخذ بعين الاعتبار فقدان العينة التي لا يمكن تجنبها في تحديد الحجم. ثم ينبغي إجراء تنقية أو اختيار الحجم باستخدام الخرز المغناطيسي SPRI حتى تتم إزالة جميع الشظايا الصغيرة (<200 bp) (إذا لزم الأمر، استخدم 0.6:1 حبة إلى نسبة العينة)، وينبغي تحديد حجم المكتبة باستخدام بيكوغرين.
يمكن تسلسل المكتبات في وضع أحادي الطرف أو في وضع مزدوج. باستخدام تسلسل المقترنة نهاية، يمكن الحصول على معلومات حول isoforms النص. وبالإضافة إلى ذلك، كما يتم إجراء النسخ العكسي باستخدام التمهيدي عشوائي (TCT-N6، N6 كونها hexamer عشوائي)، يمكن استخدام المعلومات من 3′-end متسلسلة كمعرفات جزيئية فريدة (UMI) لانهيار مكررة PCR. كما يستخدم عدد معتدل من دورات تضخيم PCR (تصل إلى 18)، وقد وجد سابقا استخدام UMIs أن تكون غير ضرورية.
كما أن جوهر البروتوكول يعتمد على nAnT-iCAGE11، يستخدم SLIC-CAGE ثمانية الباركود. لذلك، تعدد النماذج أكثر من ثمانية حاليا ً غير معتمد. وبالإضافة إلى ذلك، كل من SLIC-CAGE وnAnT-iCAGE ليست مناسبة لالتقاط RNAs أقصر من 200 نقطة أساس، كما تم تصميم البروتوكولات لإزالة الروابط والتحف PCR من خلال حجم الاستبعاد مع حبات AMPure XP.
SLIC-CAGE هو الأسلوب الوحيد غير المتحيز منخفض الإدخال أحادي النواة لخرائط مواقع بدء بدء النسخ باستخدام نانوغرام من مجموع مادة الحمض النووي الريبي. تعتمد الطرق البديلة على نشاط التحويل للقالب من النسخ العكسي إلى الرمز الشريطي المغطى RNA بدلاً من غطاء التراكب (على سبيل المثال، NanoCAGE15 و NanoPARE16). بسبب تبديل القالب، تعرض هذه الأساليب تحيزات خاصة بالتسلسل في الكشف عن نظام الخدمة الذاتية، مما يؤدي إلى زيادة أعداد TSSs الإيجابية الكاذبة وانخفاض أعداد TSSs 9و10.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة Wellcome Trust (106954) التي منحت لـ B. L. ولمجلس البحوث الطبية (MRC) التمويل الأساسي (MC-A652-5QA10). (ج) دعم ت. وقد تلقى E. P. الدعم من قبل مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة. B. L. كان مدعوما من قبل مجلس البحوث الطبية في المملكة المتحدة (MC UP 1102/1).
Materials
| 2-propanol, Bioultra, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 59304-100ML-F | Used in RNAclean XP purification. |
| 3' linkers | Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 3'linkers is described in the supplementary of this protocol. | ||
| 5' linkers | Sequences are described in Murata et al 2014 and Supplementary Table 1 of this manuscript. Annealing of strands to produce 5'linkers is described in the supplementary of this protocol. | ||
| Agencourt AMPure XP, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Purification of DNA |
| Agencourt RNAClean XP Kit | Beckman Coulter | A63987 | Purification of RNA and RNA:cDNA hybrids in CAGE steps. |
| Axygen 0.2 mL Polypropylene PCR Tube Strips and Domed Cap Strips | Axygen (available through Corning) | PCR-0208-CP-C | Or any 8-tube PCR strips (used only for water and mixes). |
| Axygen 1 x 8 strip domed PCR caps | Axygen (available through Corning) | PCR-02CP-C | Caps for PCR plates. |
| Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube | Axygen (available through Corning) | MCT-150-L-C | Low-binding 1.5 ml tubes, used for enzyme mixes or sample concentration. |
| Axygen 96 well no skirt PCR microplate | Axygen (available through Corning) | PCR-96-C | Low-binding PCR plates – have to be used for all steps in the protocol. Note that plates should be cut to contain 2 x 8 wells for easier visibility of the samples |
| Bioanalyzer (or Tapestation): RNA nano and HS DNA kits | Agilent | To determine quality of RNA, efficient size selection and final quality of the library (Tapestation can also be used) | |
| Biotin (Long Arm) Hydrazide | Vector laboratories | SP-1100 | Biotinylation/tagging |
| Cutsmart buffer | NEB | Restriction enzyme buffer | |
| Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | NEB | M0259S | Second strand synthesis |
| DNA Ligation Kit, Mighty Mix | Takara | 6023 | Used for 5' and 3'-linker ligation |
| dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | dNTP mix for production of carrier templates (or any dNTPs suitable for PCR) |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Invitrogen | 65305 | Cap-trapping. Do not use other beads as these are optimised with the buffers used. |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12321D | Magnetic stand for 1.5 ml tubes – used to prepare Streptavidin beads. |
| DynaMag-96 Side Skirted Magnet | ThermoFisher Scientific | 12027 | Magnetic stand for PCR plates (96 well-plates) – used with cut plates to contain 2 x 8 wells. |
| Ethanol, BioUltra, for molecular biology, ≥99.8% | Sigma-Aldrich | 51976-500ML-F | Used in AMPure washes. Any molecular biology suitable ethanol can be used. |
| Exonuclease I (E. coli) | NEB | M0293S | Leftover primer degradation |
| Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS | NEB | B7025S | agarose gel loading dye |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | Kit for carrier in vitro transcription |
| Horizontal electrophoresis apparatus | purification of carrier DNA templates from agarose gels | ||
| I-Ceu | NEB | R0699S | Homing endonuclease used for carrier degradation. |
| I-SceI | NEB | R0694S | Homing endonuclease used for carrier degradation. |
| KAPA HiFi HS ReadyMix (2x) | Kapa Biosystems (Supplied by Roche) | KK2601 | PCR mix for target library amplification |
| KAPA SYBR FAST qPCR kit (Universal) 2x | Kapa Biosystems (Supplied by Roche) | KK4600 | qPCR mix to assess degradation efficiency and requiered number of PCR amplification cycles |
| Micropipettes and multichannel micropipettes (0.1-10 µl, 1-20 µl, 20-200 µ) | Gilson | Use of Gilson with the low-binding Sorenson tips is recommended. Other micropippetes might not be compatible.. Different brand low-binding tips may not be of equal quality and may increase sample loss. | |
| Microplate reader | For Picogreen concentration measurement of the final library. Microplates are used to allow small volume measurement and reduce sample waste. | ||
| nuclease free water | ThermoFisher Scientific | AM9937 | Or any nuclease (DNase and RNase) free water |
| PCR thermal cycler | incubation steps and PCR amplficication | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F530S | DNA polymerase for amplification of carrier templates (or any high fidelity polymerase) |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Purification of carrier PCR templates from agarose gels. |
| qPCR machine | determining PCR amplification cyle number and degree of carrier degradation | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | ThermoFisher Scientific | P11495 | Used to measure final library concentration – recommended as, in our hands, it is more accurate and reproducible than Qubit. |
| Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder | NEB | N0551S | DNA ladder |
| Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N0550S | DNA ladder |
| Ribonuclease H | Takara | 2150A | Digestion of RNA after cap-trapping. |
| RNase ONE Ribonuclease | Promega | M4261 | Degradation of single stranded RNA not protected by cDNA. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Removal of carrier DNA templates after in vitro transcription. |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For cleanup of carrier RNA from in vitro transcription or capping |
| Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 4.5 RNAse free | VWR | AAJ63669-AK | Or any nuclease (DNase and RNase) free solution |
| Sodium acetate, 1 M, aq.soln, pH 6.0 RNAse free | Or any nuclease (DNase and RNase) free solution | ||
| Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | Oxidation of vicinal diols |
| Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, volume range 10 μL, Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719390-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
| Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 1000 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719463-1000EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
| Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 20 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719412-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
| Sorenson low binding aerosol barrier tips, MultiGuard, volume range 200 μL , Graduated | Sorenson (available through SIGMA-ALDRICH) | Z719447-960EA | Low-binding tips – recommended use throughout the protocol to minimise sample loss. |
| SpeedVac Vacuum Concentrator | concentrating samples in various steps to lower volume | ||
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | Used for reverse transcription (1st CAGE step) |
| Trehalose/sorbitol solution | Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
| Tris-HCl, 1M aq.soln, pH 8.5 | 1 M solution, DNase and RNase free | ||
| tRNA (20 mg/mL) | tRNA solution. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
| UltraPure Low Melting Point Agarose | ThermoFisher Scientific | 16520050 | Or any suitable pure low-melt agarose. |
| USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) | Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific) | 78390500UN | |
| USER Enzyme | NEB | M5505S | Degradation of 3'linker's upper strand, Uracil Specific Excision Reagent/Enzyme |
| Vaccinia Capping System | NEB | M2080S | Enzymatic kit for in vitro capping of carrier molecules |
| Wash buffer A | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
| Wash buffer B | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. | ||
| Wash buffer C | Cap trapping washes. Preparation is described in Murata et al 2014. |
References
- Shiraki, T., et al. Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).
- Haberle, V., Lenhard, B. Promoter architectures and developmental gene regulation. Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).
- Haberle, V., Stark, A. Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).
- Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
- Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Celniker, S. E., et al. Unlocking the secrets of the genome. Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).
- Consortium, F., et al. A promoter-level mammalian expression atlas. Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).
- Boyd, M., et al. Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies. Nature Communications. 9 (1), 1661 (2018).
- Adiconis, X., et al. Comprehensive comparative analysis of 5′-end RNA-sequencing methods. Nature Methods. , (2018).
- Cvetesic, N., et al. SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA. Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).
- Murata, M., et al. Detecting expressed genes using CAGE. Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357 (2012).
- A language and environment for statistical computing. Available from: https://www.R-project.org/ (2017)
- Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses. Nucleic Acids Research. 43 (8), e51 (2015).
- Poulain, S., et al. NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5′-Capped Transcriptomes. Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).
- Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. NanoPARE: parallel analysis of RNA 5′ ends from low-input RNA. Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).
Cite This Article
Cvetesic, N., Pahita, E., Lenhard, B. Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE. J. Vis. Exp. (148), e59805, doi:10.3791/59805 (2019).