Ince Iğne aspirasyonu ile Ekstrasovasküler Trypanosoma parazitlerin tespiti
Summary
İnce Iğne aspirasyonu bir tekniktir, bu sayede hücreler ince bir iğne kullanarak bir lezyonun veya organdan elde edilir. Aspirated malzeme bulaşmış, lekelenmiş ve tanı için bir mikroskop altında incelenmiştir veya moleküler biyoloji, sitometri veya in vitro analiz için kullanılır. Ucuz, basit, hızlı ve minimal travma neden olur.
Abstract
İnce Iğne aspirasyon (FNA) tıbbi ve veteriner uygulamaları için gerekli rutin bir tanı prosedürdür. Venöz delinme için kullanılan normal iğneye benzer ince bir iğne kullanarak, palpe kitleler, organlar veya efüzyon (Vücut boşluğunda sıvı birikimi) ile hücrelerin ve/veya mikroorganizmaların perkütan aspirasyonu oluşur. FNA tarafından toplanan malzeme genel olarak son derece hücresel, ve alınan aspirat sonra bulaşmış, hava kurutulmuş, ıslak-sabit, lekeli ve mikroskop altında gözlenen. Klinik bağlamda FNA, uygun terapötik yönetim için bir kılavuz olarak hizmet veren önemli bir tanı aracıdır. Çünkü, basit, hızlı, minimal invazif ve laboratuar ve insan kaynaklarına sınırlı yatırım gerektirir, bu yaygın veteriner uygulayıcıları tarafından, yerli çoğunlukla, aynı zamanda çiftlik hayvanlarda kullanılır. Hayvan modelleri kullanarak çalışmalarda, FNA aynı hayvan içinde tekrar tekrar yapılabilir avantajı vardır, tümör ve organlar/dokulardan hücre toplama yoluyla hastalığın seyri boyunca uzunlamasına çalışmalar sağlayan. Rutin mikroskopi ek olarak, alınan malzeme de immunsitokimya, elektron mikroskobu, biyokimyasal analiz, akış sitometri, moleküler biyoloji veya in vitro asder için kullanılabilir. Fna enfekte fareler gonadlar protozoon paraziti tripanosoma brucei tanımlamak için kullanılmıştır, sığır gelecekteki bir tanı için olasılığını açma.
Introduction
İnce Iğne aspirasyonu (FNA), hem insan hem de yerli hayvanlarda kanser ve neoplastik olmayan hastalıkların tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır. Teknik yıl içinde standardize edilmiştir ve çok sayıda ders kitapları1,2açıklanmıştır.
Büyük ölçüde, boş bir şırınga üzerine takılı ince bir iğne ile palpe kitleler, organlar veya efüzyon perkütan aspirasyon oluşur, kütle1,3hücre veya sıvı geri çekmek için negatif basınç kullanarak. İğneler genellikle 22-25 G (iğne iç çapına karşılık gelen ölçer), ve daha büyük bir delik iğne kullanımı (büyük çap, örn., 21 G) Bu aşırı kan kontaminasyonu üretebilir rağmen, selülarite artırmak için yararlıdır. İğne uzunluğu kütle derinliğine bağlı olacaktır ama 1 veya 11/2 inç yaygın yüzeysel kitleler için kullanılır. Şırınga genellikle 5 ila 10 mL, daha büyük şırıngalar daha yüksek vakum elde ile, hangi sırayla aspirat verim artar. Uzun iğneler ve görüntü kılavuzluğu (ultrasonografi) altında, palpe edilmeyen derin kitleler de aspirasyonlu olabilir. Alınan aspirat daha sonra bulaşmış olabilir, hava kurutulmuş, ıslak-sabit, lekeli ve bir tanı elde etmek için mikroskop altında gözlenen3 (Şekil 1).
Bu basit, ucuz, ağrısız ve minimal invazif bir tekniktir, ağırlıklı olarak, preoperatif ortamda, lenf nodları, tiroid, prostat ve hatta dış erkek üreme yapıları gibi, palpe kitlelere ve aynı zamanda organlar üzerinde bir tanı elde etmek için kullanılır. 1. Tanı Aracı olmanın yanı sıra, bu teknik diğer amaçlarla hücreler toplanması için de kullanılabilir, yani sitogenetik, elektron mikroskobu (Şekil 1D), akış cytometrik karakterizasyonu4,5 ,6,7, hücre kültürlerinin kurulması8. Klinik uygulamada yaygın bir örnek, in vitro fertilizasyon için sperm alımı9.
Aspirasyon birden smear elde etmek için aynı kütlede birkaç kez tekrarlanabilir. Heterojen bir lezyon, örneğin bir katı alan ve kistik bir alan durumunda, hücrelerin her bölgeden aspirasyon olması önemlidir. FNA tarafından toplanan malzeme genel olarak yüksek hücresel, çoğu durumda bir doku biyopsisi gerek kalmadan hastalıkların tanısı için izin verir. Özel lekeler, immünofluorescence. immünositoz (Şekil 1D), ve moleküler TEKNIKLER de Fna ile elde edilen smear, örneğin, bulaşıcı ajanların tanımlanması için tek başına morfoloji tarafından tanınmaz yapılabilir10. Genel uygulamalar ve FNA için gereken ekipman ve sarf malzemelere kısa bir bakış sırasıyla Tablolar 1 ve 2‘ de özetlenmiştir.
Tanı amaçlı iğne delinmesi ile ilgili ilk rapor Arap tıbbının erken yazılarında açıklanmıştır, ancak 20. yüzyılın başlarında modern iğne aspirasyon teknikleri11‘ de uygulanmıştır. Özellikle, bulaşıcı hastalıkların tanısı için FNA kullanımını öneren ilk rapor 1904 bir çalışma oldu, nerede Grieg ve Gray uyku hastalığı olan hastalarda lenf nodlarının iğne arzları bildirildi motil tripanosomes ortaya12 . Yazarlar, hem erken hem de gelişmiş olgularda tripanosomların varlığını bildirdi ve kan smear, bu sıklıkla nadir olaylar12görülme daha yüksek bir yoğunlukta.
Sığır trypanosomiasis mevcut tanısı kan, lenf veya immünotanı teknikleri13,14,15parazitlerin doğrudan gözlem dayanır. Biz daha önce göstermiştir ki deneysel Trypanosoma enfeksiyonları fare, tripanosoma brucei (T. brucei) yağ dokusu16 ve ayrıca bazı dış erkek üreme yapıları için dikkat çekici bir tropizm vardır, Yani epididim17. Parazitler bu dokuların stroma büyük sayılar16birikir.
Aşağıda tasvir edilen protokol, dış erkek üreme yapılarında (testis, epididymis ve epididimal yağ) bulunan tripanosomların aspirasyonu amaçlı canlı farelerde Fna için ayrıntılı bir adım adım teknik prosedür açıklar, ardından spesifik parazit proteinleri için Konvansiyonel sitoloji ve immünostasyon (VSG)16,17. Aspirasyon, deneysel hayvanların rutin olarak işlenmesi için yaygın olarak kurulan enfeksiyon ve güvenlik prosedürlerinden 6 gün sonra yapılmıştır. Ek önlemler bağışıklık eksiklikleri olan hayvanlar için gereklidir (bir buhar sterilize elbise giyen, maske, saç kaputu, steril eldiven, ve her zaman aseptik tekniği sağlayarak) fırsatçı patojenlere kazara maruz kalma azaltmak için.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnce Iğne aspirasyonu (FNA) insan ve yerli hayvanlarda hastalığı teşhis etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Tekniği uzun yıllar üzerinde standardize edilmiştir1,2, hangi bir küçük-delik iğne kullanan hücreler veya sıvı bir palpe kütle veya organ1,3Aspire. Aspirat daha sonra genellikle bir cam kaydırağa bulaşmış ve bir tanı elde etmek için mikroskobik gözlem için lekelenmiş, ancak tekniği de diğer amaçlar için hücreleri almak için kullanılabilir4,5,6, 7 , 8 , 9‘ a kadar.
Prosedür hızlı (< 5 dakika fare başına, deneyimli bir araştırmacı için) ve komplikasyonlar riski minimal, basit venöz delinme geçiren kaynaklanan risk benzer. Bu nedenle, palpe edilmiş kitlelerin Fna için, anestezi sadece hassas anatomik yerlerde ya da hayvan ve istikrar organ veya kütle iyi bir immobilizasyon optimum sonuçlar için son derece önemlidir aspirasyon için gereklidir. Bu küçük laboratuar hayvanları için sık, bir elle küçük bir kemirgen güvenli ve etkili bir kısıtlama olarak diğer elle aspirasyon için bölgeye en iyi erişim sağlarken, anestezi olmadan elde etmek zordur. Kısa vadeli anestezi çoğu durumda yeterli, yine de gerekli, fare iyi bir FNA için. İyi bir immobilizasyon, lezyonun hücresel bileşenlerinin temsilcisi olan ve aynı zamanda negatif basınç uygulandığında iğne ucunu dışa olasılığını en aza indirir bir Aspire elde etme şansını maksimize eder.
Prosedürün kendisi çok basit olsa da, koordineli uygulama ve vakum serbest bırakılması en kritik adımlardan biridir. İğne yerleştirdikten sonra, şırınga piston kontrollü bir vakum (emme) elde etmek için geri çekiliyor, ve iğne sadece pistonun gitmesine izin vererek negatif basıncı bırakmadan sonra kütle kaldırılabilir (Şekil 2); Aksi takdirde aspirat şırınga varil içine emdi ve daha sonra kurtarmak için çok zordur. Bir diğer çok önemli adım yüksek kaliteli smear hazırlanması. Bir smear yapmak için çeşitli yöntemler vardır ama yöntemin ne olursa olsun, smear malzeme cam üzerine yerleştirildikten hemen sonra hazırlanmalıdır. Biyolojik malzeme hafifçe hücre ezmek eserler önlemek için yayılmalıdır. Bir lamel magazini olarak serpme bu eserler önlemeye yardımcı olabilir kullanın. Ancak, smear yaparken çok fazla kuvvet uygulaması coverslip kıracak. İyi bir kalite smear genellikle ışık iletebilir böylece tek tabakalı olarak dağıtılan hücre nüfusun çoğu vardır. Hücresel malzeme aşırı kan pıhtısı sıkışmış olmamalıdır.
Bir FNA amacı bir kitle, doku veya organ hücreleri toplamak için. Büyük delik iğneler kullanımı, selülarite artırmak için yararlıdır, ancak daha az bol malzeme, daha küçük iğneler ile örnekleme daha yüksek kalitede verirken, aşırı kan kontaminasyonu ile ilişkili olabilir. Bizim durumumuzda, T. bruceiile deneysel olarak enfekte farelerde dış erkek üreme yapıların perkütan aspirasyonu, 5 mL şırıngaya bağlı 22-Gauge iğneler ile yapılmıştır. Fareler anesteziydi, testis bir el ve delinme ve aspirasyon güdümlü ve diğer el ile gerçekleştirilen ile stabilize edildi. Mikrop hücreleriyle, spermatozoa, epitelyal hücreler ve stromal hücrelerle birlikte, parazitlerin yüzey proteinlerine (VSG) bulaşmış ve immunostik olan sayısız tripanosomları aldık (Şekil 4).
Belirli bir lezyonun birden fazla alanı birden çok kez örneklenmesine rağmen, negatif sonuçlar veren aspiratlar içinde her zaman potansiyel örnekleme hatası vardır, bu biz iğne ucu ve hedef organ veya kitle görselleştirmek yok kör bir aspirasyon olduğunu. Bu, şüpheli bir lezyonun olumsuzunun daha fazla soruşturmaya neden olmadığı bir klinik ortamda son derece ilgilidir, ancak hastalığın hayvan modellerinde o kadar alakalı değildir. Böylece, genel sınırlamalar esas olarak yanlış negatif sonuçlar ve daha az sıklıkta yanlış pozitif sonuçlar (örneğin, kan kontaminasyonu), ancak hayvan deneyinin ayarında en önemli sınırlama doku hakkında bilgi eksikliği içerir mimari17, gibi histopatoloji ile, örneğin parazitler dağıtım deseni, bağışıklık hücrelerinin, ve hücre-hücre etkileşimi özellikleri. Yine de, avantajları FNA bir olmayan-Terminal prosedürü aynı hayvan üzerinde tekrarlanan örnekleme için izin zaman ve her zaman daha iyi korunmuş hücresel morfoloji için izin verir (Şekil 5). Ev sahibi hücreler, bağışıklık hücreleri veya mikroorganizmaların bir fare her zaman hasat için FNA için alternatifler her zaman kitle veya ilgi organları toplamak için fare ötenize güveniyor.
Bizim bilginiz için, küçük laboratuar hayvanlarında FNA kullanımı ile ilgili sadece birkaç rapor vardır, biri 1949 hematopoez okumak için 22 G iğne ile kemik iliği aspirasyonuna karşılık gelen18, ve akış sitometri ile birlikte diğer tüm tümör ile ilişkili inflamatuar hücreleri veya endotel hücrelerini ölçmek7,19,20. Çalışmalarımız, bu tekniğin enfeksiyöz hastalık modellerinin tanısı ve incelenmesi için uzatılabilir ve sitolojinin immünositokimya veya elektron mikroskobu gibi tekniklerle birleştirilebilir olduğunu gösterir. Deneysel hayvanlarda yöntemin önemli avantajlarından ikisi şunlardır: (1) Bu prosedür Terminal değil, yani canlı farelerde gerçekleştirilebilir; ve (2) onun hafif şiddeti nedeniyle aynı hayvan seri arzları sağlar. Bu nedenle her çalışma için daha az fareler gereklidir ve klinik hastalığın ilerlemesi ile bir hastalığın ve/veya mikroorganizmanın hücresel ve moleküler özelliklerinin gelişmesi arasındaki korelasyon kolayca gerçekleştirilebilir, böylece uzunlamasına çalışmalar yapılabilir.
Belki de bir bulaşıcı hastalıklar teşhis için FNA kullanımı ile ilgili ilk rapor Grieg ve Gray tarafından 1904 bir çalışmada, uyku hastalığı olan hastalarda lenf nodlarının iğne arzları raporları, motil tripanosomes12ortaya. Eğer laboratuvar fareler bizim bulguları sığır, yani, Eğer Trypanosoma kolayca dış erkek üreme YAPıLARıNDAN Fna tarafından örneklenen olabilir, bir çeviri bulmak, bir bu tekniğin hayvan teşhis için veteriner veterinerler için yararlı olacağını bekleyebilirsiniz tripanosomiasis in-çiftlik, Hayvancılık.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) tarafından Fundos do Orçamento de Estado (Ref.: ID/BıM/50005/2019) ile finanse edilmiştir. LMF, Fundação para a Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014) araştırmacısı ve laboratuar ERC (FatTryp, ref. 771714) tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışmanın yayınlanması aynı zamanda Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) tarafından finanse edilen UID/BıM/50005/2019 projesi tarafından finanse edildi Fundos do Orçamento de Estado. Biz uzman elektron mikroskobu yardım için ımm Histoloji ve karşılaştırmalı patoloji laboratuvarı andreia Pinto teşekkür ve Sandra Trindade, Tiago Rebelo ve Henrique Machado (ımm) enfekte fareler doku paylaşımı için.
Materials
| Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Anesthesia reversal |
| Cover slips (24 x 60 No.1) | VWR | 631-0664 | Smear making |
| DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemistry |
| Entellan (500 mL) | VWR | 1.07961.0500 | Mounting media |
| Envision Flex antibody diluent | Dako | 8006 | Immunocytochemistry |
| EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) | Dako | K4010 | Immunocytochemistry |
| Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemistry |
| Giemsa stain | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Smear staining |
| Glass slides (Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Smear making |
| Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemistry |
| Hydrogen Peroxidase solution | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemistry |
| Hypodermic needles Microlance 3 (23G) | Henry Schein | 902-8001 | Aspiration technique |
| Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Anesthesia |
| Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Anesthesia |
| Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Smear fixative |
| Pap pen | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemistry |
| Protein Block Serum free | Dako | X0909 | Immunocytochemistry |
| Syringes (5 mL, 10 mL) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Aspiration technique |
References
- Leopold, G., Koss, M. R. M. . Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. , (2006).
- Raskin, R. E., Meyer, D. J. . Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. , (2016).
- Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185 (3), 819-824 (1992).
- Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107 (33), 14524-14529 (2010).
- Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
- Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40 (4), 307-319 (1998).
- Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
- Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43 (6), 985-990 (1999).
- Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63 (5), 1038-1042 (1995).
- Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120 (3), 351-367 (1998).
- Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47 (2), 191-197 (2009).
- Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1 (2265), 1252 (1904).
- Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47 (6), 727-734 (1972).
- Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. , 1-15 (2009).
- Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12 (2), 186-194 (2012).
- Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19 (6), 837-848 (2016).
- Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), 1-15 (2018).
- Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (2013).
- Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13 (3), 251-258 (2010).
- Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21 (7), 648-661 (2013).
