細針吸引による血管外トリパノノーマ寄生虫の検出
Summary
ファインニードル吸引は、細胞が薄い針を使用して病変または器官から得られる技術である。吸引材料は、診断のために顕微鏡下で塗りつぶされ、染色され、検査されるか、分子生物学、サイトメトリーまたはインビトロ分析に使用されます。それは安く、簡単で、速く、最低の外傷を引き起こす。
Abstract
ファインニードル吸引(FNA)は、医療および獣医の両方のプラクティスに不可欠な日常的な診断手順です。これは、静脈穿刺に使用される通常の針に似た細い針を使用して、触知可能な塊、器官または滲出物(体腔内の流体蓄積)からの細胞および/または微生物の経皮的な吸引で構成される。FNAによって収集された材料は、一般的に非常に細胞細胞であり、取り出された吸引は、その後、塗りつぶされ、空気乾燥、湿った固定、染色され、顕微鏡下で観察されます。臨床文脈では、FNAは適切な治療管理へのガイドとして機能する重要な診断ツールである。それは簡単で、速く、最小限に侵略的であり、実験室および人的資源への限られた投資を要求するので、それは主に国内で、また家畜で獣医の専門家によって広く使用される。動物モデルを用く研究では、FNAは同じ動物で繰り返し行うことができるという利点があり、疾患の過程で腫瘍や臓器/組織からの細胞の収集を通じて縦方向の研究を可能にする。日常的な顕微鏡検査に加えて、取得した材料は、免疫細胞化学、電子顕微鏡、生化学分析、フローサイトメトリー、分子生物学またはインビトロアッセイにも使用できます。FNAは、感染したマウスの生殖腺中の原虫寄生虫トリパノソマブルーサイを同定するために使用され、牛の将来の診断の可能性を開いた。
Introduction
ファインニードル吸引(FNA)は、ヒトおよび家畜の両方で、癌および非腫瘍性疾患の診断に広く使用されている。この技術は長年にわたって標準化され、多数の教科書1、2に記載されています。
それは主に、空の注射器に取り付けられた薄い針を持つ触知可能な塊、器官または滲出物の触皮的吸引で構成され、質量1、3から細胞または流体を引き出すために負圧を使用する。針は、典型的には22~25G(針内径に対応するゲージ)であり、より大きなボア針(大口径、例えば、21G)の使用は、細胞性を高めるために有用であるが、これは過度の血液汚染を引き起こす可能性がある。針の長さは質量の深さに依存しますが、1または11/2インチは表面質量に一般的に使用されます。注射器は通常5~10mLで、より大きな注射器でより高い真空を達成し、吸引収率を増加させます。触知不能な深い塊は、より長い針と画像ガイダンス(超音波検査)で、吸引することもできます。取り出した吸引は、その後、塗りつぶし、空気乾燥、湿式固定、染色し、顕微鏡下で観察され、診断3を達成することができる(図1)。
これは、触知可能な塊の診断を達成するために、また、リンパ節、甲状腺、前立腺、あるいは外部の男性の生殖構造のような器官のために、主に術前の設定で使用される、シンプルで安価で、痛みのない、最小限の侵襲的な技術です。1.診断ツールであることに加えて、この技術は、他の目的のために細胞の収集に使用することができ、すなわち、細胞遺伝学、電子顕微鏡(図1D)、フローサイトメトリック特性測定4、5 ,6,7, 細胞培養の確立8.臨床実践における一般的な例は、体外受精9のための精子検索である。
吸引は、複数の塗りつぶしを得るために同じ質量で数回繰り返すことができます。不均一な病変の場合には、例えば、固体領域および嚢胞空間は、細胞が各領域から吸引されることが重要である。FNAによって収集された材料は、一般的に非常に細胞細胞であり、ほとんどの場合、組織生検を必要とせずに疾患の診断を可能にします。特殊な汚れ、免疫蛍光。免疫細胞化学(図1D)、および分子技術は、FNAを介して得られたスミアにおいても、例えば、形態単独で認識できない場合に感染性薬剤の同定のために10を行うことができる。FNAに必要な一般的なアプリケーションと機器と備品の概要を表1および2にまとめます。
診断目的での針穿刺の使用に関する最初の報告書は、アラブ医学の初期の文章に記載されていますが、現代の針吸引技術が実装されたのは20世紀初頭です 11.特に、おそらく感染症の診断のためのFNAの使用を示唆する最初の報告は、グリーグとグレーが睡眠病患者からのリンパ節の針吸引を報告した1904年の研究であり、モチルトリパノソーム12を明らかにしました。.著者らは、初期および高度な症例の両方でトリパノソームの存在を報告し、血液汚れで見られるものよりも高密度で、これらはしばしばまれな事象12である。
牛におけるトリパノソーマ症の現在の診断は、血液、リンパまたは免疫診断技術13、14、15における寄生虫の直接観察に依存する。我々は以前に、マウスにおける実験的なトリパノーソーマ感染症において、トリパノソーマ・ブルーセイ(T.brucei)が脂肪組織16および外部男性の生殖構造の一部に顕著な栄養を有することを示した。すなわちエピディミズム17.寄生虫は、これらの組織の間質に多数16で蓄積する。
以下に示すプロトコルは、生きているマウスにおけるFNAの詳細なステップバイステップの技術的手順を説明し、外部の男性生殖構造(精巣、精巣、上体脂肪)に存在するトリパノソームの吸引を目的とし、続いて特定の寄生虫タンパク質(VSG)16,17に対する従来の細胞学および免疫染色。吸引は、適用される感染および安全手順の6日後に行われ、実験動物の日常的な取り扱いのために一般的に確立されたものである。免疫不全(蒸気殺菌ガウン、マスク、ヘアボンネット、滅菌手袋を着用し、常に無菌技術を確保する)を有する動物には、日和見病原体への偶発的な暴露を軽減するための追加の措置が必要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ファインニードル吸引(FNA)は、ヒトおよび家畜の疾患を診断するために広く使用される方法である。この技術は長年にわたって標準化されてきた1、2、小さな穴の針を利用して、触知可能な質量または器官1、3から細胞または流体を吸引する。吸引体は、通常、ガラススライドに塗りつぶされ、診断を達成するために顕微鏡観察のために染色されますが、この技術は、他の目的のために細胞を取り出すためにも使用することができます 4,5,6 ,7,8,9.
この手順は、マウスあたり迅速(<5分、経験豊富な研究者向け)であり、合併症のリスクは最小限であり、単純な静脈穿刺を受けた場合に発生するリスクと同様です。このため、触知可能な質量のFNAの場合、麻酔は敏感な解剖学的位置のためにのみ必要とされるか、または動物の良好な固定化および吸引される器官または質量の安定化が最適な結果のために非常に重要である場合。これは、小さな実験動物のために頻繁に、片手で小さなげっ歯類の安全かつ効果的な拘束として、他方の手で吸引のための領域への最良のアクセスを確保しながら、麻酔なしで達成することは困難です。短期麻酔は、ほとんどの場合、マウスの良好なFNAのために必要であり、それにもかかわらず必要である。良好な固定化は、病変の細胞成分を代表する吸引を得る可能性を最大化し、負圧が加えられながら針の先端を外部化する可能性を最小限に抑えます。
手順自体は非常に簡単ですが、真空の調整されたアプリケーションとリリースが最も重要なステップです。針の挿入後、シリンジのプランジャーは制御された真空(吸引)を達成するために引き込まれ、プランジャーを手放すことによって負圧を放出した後にのみ針を質量から取り出すことができます(図2)。それ以外の場合、吸引は注射器のバレルに吸い込まれ、その後回復することは非常に困難です。もう一つの非常に重要なステップは、高品質の汚れの調製です。スミアを作る方法はさまじいが、方法にかかわらず、材料をガラスの上に置いた直後にスミアを準備する必要があります。生体材料は、細胞クラッシュアーティファクトを避けるために穏やかに広げる必要があります。カバースリップを拡散機として使用すると、これらのアーティファクトを防ぐことができます。しかし、スミアを作っている間にあまりにも多くの力の適用は、カバースリップを壊します。良質のスミアは、通常、光を容易に透過できるように、単層として分布する細胞集団のほとんどを持っています。細胞材料は、血栓に過度に閉じ込められてはなりません.
FNAの目標は、質量、組織または臓器から細胞を収集することです。より大きなボア針の使用は、細胞性を高めるために有用であるが、より小さな針でサンプリングすると、より少ない豊富な材料が、より高い品質をもたらす一方で、過度の血液汚染に関連付けることができます。我々の場合、T.bruceiに実験的に感染したマウスにおける外皮性男性生殖構造の皮下吸引は、5mL注射器に結合された22ゲージ針で行った。マウスを麻酔し、精巣を片手で安定させ、穿刺と吸引を導き、もう一方の手で行った。生殖細胞、精子、上皮細胞および間質細胞を混合した多数のトリパノソームを回収し、寄生虫の表面タンパク質(VSG)に塗りつぶして免疫染色した(図4)。
特定の病変の複数の領域を複数回サンプリングすることはできますが、これは針先と標的臓器または質量を視覚化しない盲目の吸引であるため、アスピシンには常に潜在的なサンプリング誤差があります。これは、疑わしい病変の負のFNAがさらなる調査を観察しない臨床現場では非常に関連していますが、疾患の動物モデルにはそれほど関連していません。したがって、一般的な制限は、主に偽陰性の結果を含み、より少ない頻度の偽陽性結果(例えば、血液汚染から)が、動物実験の設定における最も重要な制限は、組織に関する情報の欠如であるアーキテクチャ17は、我々がヒスト病理学と同様に、例えば寄生虫の分布パターン、免疫細胞、および細胞間相互作用特徴である。それにもかかわらず、FNAは、同じ動物の時間を超えて繰り返しサンプリングを可能にする非終端手順であり、常により良い保存された細胞形態を可能にするという利点があります(図5)。宿主細胞、免疫細胞またはマウスからの微生物を収穫するためのFNAの代替は、常に目的の質量または器官を収集するためにマウスを安楽死させることに依存しています。
私たちの知る限りでは、小さな実験動物におけるFNAの使用に関する報告はほんのわずかであり、1949年からは、22G針で骨髄の吸引に対応し、18を研究するための骨髄の吸引に対応し、その他すべてのフローサイトメトリーと組み合わせて腫瘍関連炎症細胞または内皮細胞のいずれも定量化7,19,20.我々の研究は、この技術が感染症モデルの診断と研究に拡張することができ、細胞学と免疫細胞化学や電子顕微鏡のような技術を組み合わせることができることを示しています。実験動物における方法の主な利点の2つは、(1)この手順が末端ではない、すなわち、生きたマウスで行うことができる。そして(2)軽度の重症度のために、それは同じ動物の連続的な吸引を可能にする。したがって、各研究に必要なマウスの数が少なく、臨床疾患の進行と疾患および/または微生物の細胞および分子特徴の進化との相関関係が容易に行うことができ、縦方向の研究が可能になります。
おそらく、感染症を診断するためのFNAの使用に関する最初の報告は、1904年のグリーグとグレイによる研究で、睡眠病患者からのリンパ節の針吸引を報告し、モチルトリパノソーム12を明らかにした。実験室のマウスの知見が牛への翻訳、すなわち、トリパノソマが外部の男性の生殖構造からFNAによって容易にサンプリングできれば、この技術が動物の診断に役立つことを期待できる。家畜の農場でトリパノソーマ症。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、フンダサン・パラ・ア・シエンシア・エ・テノロジア(FCT)/ミニステリオ・ダ・シエンシア、テクノロジア・エ・エンシノ・スーペリア(MCTES)から、ファンドス・ド・オルサメント・デ・エスタド(ref.:ID/BIM/50005/2019)によって資金提供されました。LMFは、ファンダサン・パラ・ア・シエンシア・エ・テクノロジア(IF/01050/2014)の研究者であり、研究室はERC(FatTryp,ref.771714)によって資金提供されています。この作品の出版はまた、フンダサン・パラ・ア・シエンシア・エ・テノロジア(FCT)/ミニステリオ・ダ・シエンシア、テクノロジア・エ・エンシノ・スーペリア(MCTES)がファンドス・ド・オルサメント・デ・エスタドを通じて資金提供したUID/BIM/50005/2019プロジェクトにも資金を提供しました。私たちは、iMMの組織学と比較病理学研究所のアンドレア・ピントに対し、感染したマウスの組織を共有するためのサンドラ・トリンダーデ、ティアゴ・レベロ、ヘンリク・マチャド(iMM)に感謝します。
Materials
| Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Anesthesia reversal |
| Cover slips (24 x 60 No.1) | VWR | 631-0664 | Smear making |
| DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemistry |
| Entellan (500 mL) | VWR | 1.07961.0500 | Mounting media |
| Envision Flex antibody diluent | Dako | 8006 | Immunocytochemistry |
| EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) | Dako | K4010 | Immunocytochemistry |
| Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemistry |
| Giemsa stain | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Smear staining |
| Glass slides (Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Smear making |
| Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemistry |
| Hydrogen Peroxidase solution | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemistry |
| Hypodermic needles Microlance 3 (23G) | Henry Schein | 902-8001 | Aspiration technique |
| Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Anesthesia |
| Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Anesthesia |
| Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Smear fixative |
| Pap pen | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemistry |
| Protein Block Serum free | Dako | X0909 | Immunocytochemistry |
| Syringes (5 mL, 10 mL) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Aspiration technique |
References
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