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Immunology and Infection

Rilevamento di parassiti di Trypanosoma Extravascolari da parte dell'aspirazione dell'ago fine

Published: August 07, 2019
doi:
10.3791/59798
, ,
1Comparative Pathology Unit,Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa, 2Biology of Parasitism Laboratory,Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa

Summary

Fine Needle Aspiration è una tecnica, per cui le cellule sono ottenute da una lesione o un organo utilizzando un ago sottile. Il materiale aspirato viene spalmato, colorato ed esaminato al microscopio per la diagnosi o utilizzato per la biologia molecolare, la citometria o l’analisi in vitro. È economico, semplice, veloce e provoca un trauma minimo.

Abstract

Fine Needle Aspiration (FNA) è una procedura diagnostica di routine essenziale sia per le pratiche mediche che veterinarie. Consiste nell’aspirazione percutanea di cellule e/o microrganismi da masse palpabili, organi o effusioni (accumulo di liquidi in una cavità del corpo) utilizzando un ago sottile simile all’ago normale utilizzato per la puntura venosa. Il materiale raccolto dalla FNA è in generale altamente cellulare, e l’aspirato recuperato viene poi spalmato, essiccato all’aria, fissato in umido, macchiato e osservato al microscopio. Nel contesto clinico, La FNA è un importante strumento diagnostico che funge da guida per l’appropriata gestione terapeutica. Poiché è semplice, veloce, minimamente invasivo e richiede investimenti limitati nel laboratorio e nelle risorse umane, è ampiamente utilizzato dai professionisti veterinari, per lo più domestici, ma anche negli animali da allevamento. Negli studi che utilizzano modelli animali, FNA ha il vantaggio che può essere eseguita ripetutamente nello stesso animale, consentendo studi longitudinali attraverso la raccolta di cellule da tumori e organi / tessuti nel corso della malattia. Oltre alla microscopia di routine, il materiale recuperato può essere utilizzato anche per l’immunocitochimica, la microscopia elettronica, l’analisi biochimica, la citometria di flusso, la biologia molecolare o i saggi in vitro. FNA è stato utilizzato per identificare il parassita protozoo Trypanosoma brucei nelle gonadi di topi infetti, aprendo la possibilità per una diagnosi futura nel bestiame.

Introduction

Fine Needle Aspiration (FNA) è ampiamente utilizzato nella diagnosi di cancro e malattie non neoplastiche, sia in animali umani che domestici. La tecnica è stata standardizzata nel corso degli anni ed è descritta in numerosi libri di testo1,2.

Consiste in gran parte dell’aspirazione percutanea di masse palpabili, organi o effusioni con un ago sottile montato su una siringa vuota, utilizzando la pressione negativa per ritirare le cellule o il fluido dalla massa1,3. Gli aghi sono tipicamente da 22 a 25 G (gauge corrispondente all’ago di diametro interno), e l’uso di un ago di foro più grande (grande diametro, ad esempio, 21 G) è utile per aumentare la cellularità, anche se questo può produrre una contaminazione eccessiva del sangue. La lunghezza dell’ago dipenderà dalla profondità della massa, ma 1 o 1 1/2 pollice è comunemente usato per masse superficiali. Le siringhe sono tipicamente da 5 a 10 mL, con siringhe più grandi che raggiungono un vuoto più elevato, che a sua volta aumenta la resa aspira.Yyringes are typically 5 to 10 mL, with larger yyringes achieving higher vacuum, which in turn increases aspir. Possono anche essere aspirate masse non palpabili, con aghi più lunghi e sotto guida dell’immagine (ultrasonografia). L’aspirato recuperato può quindi essere imbrattato, asciugato all’aria, fissato in bagnato, macchiato e osservato al microscopio per ottenere una diagnosi3 (Figura 1).

Si tratta di una tecnica semplice, economica, indolore e minimamente invasiva utilizzata principalmente nell’impostazione preoperatoria per ottenere una diagnosi su masse palpabili e anche per organi, come linfonodi, tiroide, prostata o anche le strutture riproduttive maschili esterne 1.Oltre ad essere uno strumento diagnostico, questa tecnica può essere utilizzata per la raccolta di cellule anche per altri scopi, vale a dire citogenetica, microscopia elettronica (Figura1D), caratterizzazione citometrica del flusso4,5 ,6,7, creazione di impostazioni cultura cellulari8. Un esempio comune nella pratica clinica è il recupero dello sperma per la fecondazione in vitro9.

L’aspirazione può essere ripetuta più volte nella stessa massa per ottenere più strisci. In caso di lesione eterogenea, ad esempio un’area solida e uno spazio cistico, è importante che le cellule siano aspirate da ogni regione. Il materiale raccolto dalla FNA è in generale altamente cellulare, che nella maggior parte dei casi consente la diagnosi di malattie senza la necessità di una biopsia tissutale. Macchie speciali, immunofluorescenza. l’immunocitochimica (Figura 1D) e le tecniche molecolari possono essere eseguite anche in strisci ottenuti attraverso FNA, ad esempio, per l’identificazione di agenti infettivi quando non riconoscibili dalla sola morfologia10. Una breve panoramica delle applicazioni generali e delle attrezzature e forniture necessarie per la FNA sono riassunte nelle tabelle 1 e 2, rispettivamente.

Il primo rapporto sull’uso della puntura dell’ago per scopi diagnostici è descritto nelle prime scritture della medicina araba, ma è all’inizio del XX secolo che sono state implementate le moderne tecniche di aspirazione dell’ago11. In particolare, forse la prima relazione che suggerisce l’uso della FNA per la diagnosi di malattie infettive è stato uno studio nel 1904, in cui Grieg e Gray hanno riportato aspirazioni di ago dei linfonodi da pazienti con malattia del sonno ha rivelato tripanosomo motile12 . Gli autori hanno riferito la presenza di trypanosomes sia nei casi iniziali che in quelli avanzati, e ad una densità superiore a quella osservata negli strisci di sangue, dove questi sono spesso eventi rari12.

La diagnosi attuale di trypanosomiasi nei bovini si basa sull’osservazione diretta dei parassiti nel sangue, nella linfa o nelle tecniche immunodiagnostiche13,14,15. Abbiamo dimostrato in precedenza che nelle infezioni sperimentali di Trypanosoma nel topo, Trypanosoma brucei (T. brucei) ha un notevole tropismo per adiposo il tessuto16 e anche per alcune delle strutture riproduttive maschili esterne, vale a dire epididymis17. I parassiti si accumulano nello stroma di questi tessuti in gran numero16.

Il protocollo descritto di seguito descrive una procedura tecnica dettagliata passo-passo per FNA in topi vivi, finalizzata all’aspirazione di trypanosomes presenti nelle strutture riproduttive maschili esterne (testis, epididymis e grasso epidiziale), seguito da citologia convenzionale e immunostaining per specifiche proteine parassitarie (VSG)16,17. L’aspirazione è stata eseguita 6 giorni dopo le procedure di infezione e sicurezza che si applicano sono quelle comunemente stabilite per la manipolazione di routine di animali sperimentali. Sono necessarie misure aggiuntive per gli animali che hanno carenze immunitarie (indossando un abito sterilizzato a vapore, maschera, cofano per capelli, guanti sterili e garantire la tecnica asettica in ogni momento) per mitigare l’esposizione accidentale a patogeni opportunistici.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali in questo protocollo sono stati effettuati secondo le normative dell’UE e approvati dal Comitato Etico animale dell’Instituto de Medicina Molecular (iMM), (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). La struttura animale di iMM è conforme alla legge portoghese per l’uso di animali da laboratorio (Decreto-legge 113/2013) e segue la direttiva europea 2010/63/EU e le linee guida FELASA (Federazione delle associazioni europee di scienze animali di laboratorio) e le linee guida FELASA (Federazione delle associazioni europee di scienze animali di laboratorio) e raccomandazioni riguardanti il benessere degli animali da laboratorio. 1. Aspirazione dei parassiti dagli organi riproduttivi maschi esterni del topo NOT:</ L’aspirazione dell’ago fine (FNA) è stata eseguita in topi maschi di tipo selvaggio C57BL/6J, di età da 6 a 10 settimane, infettati da T. brucei attraverso l’iniezione intraperitoneale di 200 – L di salina con 2.000 parassiti come descritto in precedenza16. Per la FNA degli organi riproduttivi maschili esterni, posizionare il topo in un cappuccio a flusso laminare, ansetizzare l’animale con un’iniezione intraperitoneale di 200 -L di una miscela di 75 mg/kg di Ketamina – 1 mg/kg di Medetomidina in salina. Confermare l’anestesizzazione con il metodo del pizzico di dita dei dei i mpi’. Quando il riflesso della retrazione della gamba è assente, posizionare il mouse nella recumbency dorsale (Figura 2A). Palpare con attenzione i testicoli, valutando le dimensioni e la distanza dalla pelle sovrastante. Ritirare l’organo tra l’indice e il dito medio o tra l’indice e il pollice. Allungare la pelle sovrastante lungo la massa per immobilizzare ulteriormente il bersaglio. Pulire la superficie con salviette alcoliche (Figura 2A). Tenere l’ago assemblato da 22 G e la siringa da 5 mL e inserire la punta dell’ago nel bersaglio, sempre con lo stantuffo nello stato di riposo (Figura 2B-C). Applicare l’aspirazione retraendo lo stantuffo della siringa al segno da 4 mL a 5 mL 2-3 volte. Reindirizzare l’ago all’interno dell’organo in linea retta o lungo diverse tangenti per aumentare la probabilità di un campione rappresentativo e di indirizzare strutture più piccole come l’epididymis. Assicurarsi che questa procedura sia delicata, per ridurre al minimo il danno ai tessuti (Figura 2C-D). Rilasciare l’aspirazione e quindi ritirare l’ago. Non ridisegnare l’ago con lo stantuffo retratto in quanto questo porterà all’aspirazione dell’aspirato nella canna della siringa e impedende il suo recupero (Figura 2E). Dopo il ritiro dell’ago, controllare qualsiasi sanguinamento applicando pressione con una spugna di garza sterilizzata nel sito di puntura. Scollegare la siringa dall’ago, riempirla con aria, ricollegare l’ago ed espellere delicatamente il contenuto dell’ago su un vetrino. Posizionare la punta dell’ago molto vicino o anche sul vetrino per evitare schizzi (Figura 2F-I). Eseguire almeno un’aspirazione aggiuntiva per organo/animale per garantire il campionamento di replica. Ripristinare l’anestesia con un’iniezione sottocutanea di 200 -L di 1 mg/kg di Atipamezolo in salina e riportare gli animali alla loro gabbia di casa per il recupero e osservare fino al pieno recupero. 2. Preparazione dello striscio dal materiale aspirato NOT:</ Utilizzare i guanti durante la procedura e garantire lo smaltimento sicuro di aghi e siringhe. Metodo di pull a due passi Raccogliere la diapositiva che ha la goccia dell’aspirato utilizzando la mano non dominante e pizzicare l’estremità smerigliata tra il pollice e l’indice (Figura 3A). Raccogliere una seconda diapositiva pulita, lo scivolo spalmatore, con la mano dominante e portarla attraverso la prima diapositiva con la goccia dell’aspirato. Posizionare il bordo liscio e pulito del vetrino sul vetrino del provino solo sulla parte superiore della goccia con un angolo di circa 30 gradi (Figura 3B). Scivolare in avanti la diapositiva con un movimento leggero, continuo e costante per ottenere una pellicola sottile (Figura 3C). Riposare il vetrino e consentire l’essiccazione completa e veloce dell’aria del materiale (Figura 3D). Non riscaldare. Etichettare il bordo smerigliato della diapositiva con una matita. NOT:</ Il protocollo può essere messo in pausa in questa fase e gli strisci possono essere conservati a tempo indeterminato fino a quando non sono pronti per essere macchiati. 3. Colorazione delle smedele NOT:</ Utilizzare i guanti durante la procedura e assicurarsi che i passaggi 3.1.4 e 3.2.9 vengano eseguiti all’interno di un cofano. Protocollo di colorazione Giemsa Fissare gli strisci essiccati all’aria immergendo i vetrini in un barattolo Coplin contenente metanolo al 100% per 5 min (Figura 3E). Trasferire la diapositiva in un barattolo Coplin contenente 20% soluzione Giemsa (diluito a 1/5 in acqua distillata) per 30 min, o 10% Giemsa per 10 min (Figura 3F). Risciacquare in acqua del rubinetto e asciugare accuratamente utilizzando carta velina per tamponare. Tenere la diapositiva orizzontalmente e applicare una goccia del supporto di montaggio non acquoso sullo striscio. Posizionare il bordo di un vetro di copertura sul vetrino, abbassarlo e premere delicatamente per rimuovere eventuali bolle d’aria. Immunocitochimica negli strisci fNA Fissare strisci essiccati all’aria in metanolo al 100% a temperatura ambiente per 10 min. Lavare il vetrino per 5 min in un barattolo Coplin con 1x fosfato tampone (PBS), ripetendo questo passaggio 3 volte utilizzando fresco 1x PBS ogni volta. Rimuovere la diapositiva dal barattolo Coplin, pulire il buffer in eccesso senza toccare lo striscio e disegnare un cerchio intorno allo striscio con una penna idromante (Tabella dei materiali). Tenere il vetrino orizzontalmente e applicare 150 l di soluzione anticorpale primaria diluita ad ogni striscio e incubare per 1 h a temperatura ambiente. NOT:</ Anticorpi primari ovo- usati qui è un antigene di coniglio non purificato anti-T.brucei VSG13 (cross-reattivo con molti T. brucei VSG, prodotti in-house), diluito in 1x PBS a 1:50,000. Eseguire controlli negativi sostituendo l’anticorpo primario appropriato con siero preimmune (Tabella dei materiali) per consentire la valutazione del legame non specifico dell’anticorpo secondario. Lavare il vetrino per 5 min in un barattolo Coplin con 1x PBS, ripetendo questo passaggio 3 volte utilizzando fresco 1x PBS ogni volta. Tenere la diapositiva orizzontalmente e applicare ogni striscio di perossidasi/DAB di rafano disponibile in commercio. Incubare per 30 min a temperatura ambiente (Tabella dei materiali). Lavare per 3x per 5 min in 1x PBS. Controstain immergendo gli scivoli in un barattolo Coplin contenente Harris hematoxylin. Risciacquare in acqua del rubinetto e asciugare accuratamente utilizzando la carta per tamponare. Tenere la diapositiva orizzontalmente e applicare una goccia del supporto di montaggio non acquoso sullo striscio. Posizionare il bordo di un vetro di copertura sul vetrino, abbassarlo e premere delicatamente per rimuovere eventuali bolle d’aria.

Representative Results

FNA è stato eseguito negli organi riproduttivi maschili esterni di topi infettati da T. brucei utilizzando un ago da 22 G accoppiato a una siringa da 5 mL e vetrini di vetro per la preparazione dello striscio (Figura 1A-C). Il metodo è semplice ma risultati ottimali si basano su passaggi critici: perfetta immobilizzazione del topo ottenuta attraverso l’anestesia generale e stabilizzazione degli organi durante l’intera procedura (Figura 2A-B). La aspirazione è stata applicata 2-3 volte e l’ago reindirizzato 1-2 volte per consentire il campionamento rappresentativo degli organi e dei tessuti più piccoli: epididymis e grasso epididymal. La pressione negativa è stata rilasciata prima di esternalizzare l’ago. L’aspirato contenuto nel lume e nel mozzo dell’ago (circa 20 gradi centigradi), è stato utilizzato per produrre 2 strisci (Figura 3A-C). Nei casi in cui l’ago è stato ritirato senza il rilascio dell’aspirazione, il materiale è stato risucchiato nella siringa e non è stato recuperabile. Il processo è stato ripetuto con successo due volte, uno per ogni organo accoppiato. Dopo l’essiccazione, gli strisci sono stati fissati in umido e l’immunocitochimica per le proteine della superficie di trypanososo. Uno striscio di buona qualità (Figura 4A-C) è stato caratterizzato da un monostrato di cellule con una buona densità cellulare, in cui le cellule ospiti mostrano caratteristiche morfologiche conservate, consentendo l’identificazione del loro tessuto di origine e relativo proporzione tra loro. I parassiti erano efficacemente immuno-macchiati, identificabili e numerabili (Figura 4B). È inoltre illustrato un caso di Una FNA di effusione peritoneale in un topo infetto, macchiato con Giemsa per l’osservazione diretta e la diagnosi (Figura 3D-F e Figura 4C). Un risultato FNA povero o negativo può essere dovuto a diversi motivi: (1) troppo poco materiale FNA è espresso sul vetrino ed è sottorappresentante del campione; (2) troppo materiale FNA è espresso su un singolo scivolo, facendo strisci eccessivamente spessi e compromettendo la valutazione citologica; (3) viene applicata troppa forza quando si fa lo striscio, e le cellule vengono interrotte, con conseguente un sacco di nuclei nudi e striature di DNA (artefatto schiacciato); o (4) non viene applicata una forza sufficiente quando si effettualo lo striscio e le cellule non si disaggregano, determinando uno strato stratificato che impedisce la valutazione delle caratteristiche morfologiche delle cellule (Figura 5). Quando confrontiamo la citopatologia FNA con l’istopatologia, cioè l’analisi delle cellule rispetto ai tessuti, il pugno ha il vantaggio che la morfologia cellulare è meglio conservata e le proporzioni relative e il conteggio delle cellule possono essere valutati meglio (Figura 6). Inoltre, l’immunocitochimica è più semplice, veloce e più facile da ottimizzare rispetto all’immunohistochimica, che in genere viene eseguita in tessuto fissato in formalina e incorporato in paraffina. bersaglio Applicazioni Vantaggi Limitazioni Massa palpabile Microscopia di routine, diagnosi Semplice, veloce Nessuna architettura tissutale organo Immunohistochemistry Basso Aspirazione cieca (l’ago può perdere il bersaglio tangenzialmente; l’aspirazione può colpire aree necrotiche, cistiche o emorragiche) Effusioni Citometria di flusso Campionamento da più siti Citogenetica Morfologia cellulare ben conservata Microscopia Senza complicazioni PCR, altre tecniche molecolari Alta precisione diagnostica Analisi biochimica Anestesia (per immobilizzazione) Saggi in vitro, coltura cellulare Procedura non terminale Tabella 1: Target, applicazioni generali, vantaggi e limitazione dell’aspirazione dell’ago fine. Kit FNA Archetipo di ago e siringa da aspirazione Aspirazione: Parti di ago: 1. Siringhe di plastica usa e getta (5 o 10 mL) (Figura 1B) Spotnella. La punta dell’albero dell’ago è inclinata per formare un punto, l’inclinazione è la smussatura. Solo gli aghi smussati sono adatti per aspirazioni percutanee. 3. Aghi da 22 a 25-gauge (diametro); 0,75, 1,0, 1,5 pollici di lunghezza, con bordo standard della punta dell’ago smussato (Figura 1A) Albero. Hollow porzione tubolare dell’ago la cui lunghezza può essere regolata in base alla profondità della massa. L’indicatore dell’ago corrisponde al diametro del foro, che è il diametro dell’interno dell’albero (gli aghi più piccoli hanno un indicatore più alto). L’uso di aghi di foro più grandi (meno di 22 G) è utile per aumentare la cellularità, anche se questo può produrre un’eccessiva contaminazione del sangue iatrogenico. 1. Anestesia (se necessario). Il dolore associato alla FNA è simile a quello di una puntura venosa, tuttavia, una buona aspirazione richiede una buona immobilizzazione del soggetto, particolarmente importante negli animali di piccole dimensioni e/o per piccole lesioni e organi fluttuanti. Ratti e topi soggetti a FNA devono essere adeguatamente trattenuti passivamente o, se necessario, sedati o essere sottoposti ad anestesia generale leggera. Hub. Porzione di plastica dell’ago che è attaccato alla siringa; deve essere trasparente per consentire la visualizzazione del materiale aspirato. Il materiale aspirato ottenuto durante FNA deve essere raccolto nell’albero dell’ago e l’aspirazione si ferma quando il materiale viene visto entrare nel mozzo. FNA spalmare e interpretazione: Parti di siringhe: 1. Vetrini al microscopio in vetro finale smerigliato (Figura 1C) Barile/cilindro. Parte hollow della siringa. A meno che non si tratti di lesioni cistiche o effusioni, il materiale che viene aspirato alla canna generalmente non può essere recuperato. Il volume ideale di aspirato per la cintologia FNA è di circa 5 Anni, corrispondente al volume medio di aspirato che occupa l’albero e il mozzo dell’ago. 2. macchie di tipo Romanowsky (ad es. Diff-Quik, Giemsa) Suggerimento. Fine della canna a cui è collegato il mozzo dell’ago. 3. Microscopio (campo luminoso) Lo Stantuffo. Porzione mobile della siringa che ha un disco piatto o un labbro ad un’estremità e un sigillo di gomma all’altra estremità. Si inserisce nella canna e fornisce la pressione per disegnare le cellule, fluido nell’ago. Uno stantuffo perfettamente sigillato che crea una buona pressione negativa è obbligatorio per ottenere una buona resa aspiratrice. Tabella 2: Attrezzature e forniture necessarie per l’aspirazione dell’ago sottile. Figura 1 : Strumenti e risultati per l’aspirazione dell’ago sottile. (A) Il diametro ideale dell’ago per FNA è da 22 a 25 G. (B) Il volume ideale della siringa per ottenere una buona resa aspirato è di 5 a 10 mL. (C) Pulito, asciutto, privo di vetrini di vetro grasso con area di marcatura smerigliata per la scrittura con matita e pre-rivestito (se per immunoistochimica). (D) Esempio di Trypanosomes osservato con la colorazione di Giemsa (punta di freccia nera), immunostainato per le proteine della superficie VSG (freccia bianca) e sotto microscopia elettronica a trasmissione (freccia a blocchi). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2 : schemi che mostrano l’aspirazione dell’ago sottile (FNA) degli organi riproduttivi maschili esterni (testis, epididymis e grasso epididymal) nei topi. (A) Una volta che l’animale è fissato, lo strumento di aspirazione precedentemente assemblato viene raccolto. (B-C) Inserire la punta dell’ago nell’organo bersaglio. (D) Applicare l’aspirazione retraendo lo stantuffo della siringa al segno da 1 mL a 2 mL, ripetutamente 3-4 volte. La punta dell’ago può anche essere spostata avanti e indietro all’interno del bersaglio mentre si applica l’aspirazione, per raccogliere materiale sufficiente. (E) Rilasciare l’aspirazione e solo allora ritirare l’ago. (F) Togliere l’ago dalla siringa e (G) Tirare indietro lo stantuffo. (H) Riattaccare l’ago. (I) Espellere il materiale su uno scivolo di vetro spingendo rapidamente lo stantuffo attraverso la siringa. Al fine di evitare schizzi, assicurarsi che la punta dell’ago poggia molto vicino o anche sul vetrino. La goccia di aspirato è posta a circa 1 cm dal bordo dell’area di marcatura smerigliata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : preparazione e colorazione della macchia. (A) Tenere un’estremità della diapositiva (area smerigliata) tra il pollice e l’indice. (B) Posizionare il bordo liscio e pulito di una seconda diapositiva (spalmatore) sul vetrino campione proprio di fronte alla goccia di materiale. (C) Far scorrere la diffusione in avanti una volta con velocità moderata per ottenere una pellicola sottile. (D) Lasciare asciugare all’aria lo slittino all’aria ed etichettare il bordo smerigliato dello scivolo con una matita. (E) Dopo l’essiccazione completa con metanolo per 5 min. (F) Macchia con soluzione 20% Giemsa per 30 min (o 10% Giemsa per 10 min). Risciacquare leggermente con acqua, asciugare completamente, immergere in xilene e montare con un agente di montaggio insolubile in acqua. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Microfotografie di strisci ottenuti da FNA di strutture riproduttive maschili esterne in topi infetti da T. brucei. (A) Aspetto lordo di uno striscio diretto di buona qualità: il materiale è stato espresso sul vetrino a circa 1 cm di distanza dal bordo smerigliato (punto nero), spalmato e fermato 0,5 cm prima del bordo dello scivolo (linee parallele). (B) L’immunocitochimica per le proteine superficiali del parassita (VSG) è stata eseguita per gli strisci ottenuti dalla FNA degli organi riproduttivi maschi esterni il giorno 6 dell’infezione. Numerosi parassiti (freccia) sono stati rilevati mescolati con cellule germinali del topo (freccia). DAB contrapporre l’ematossilina Harris. Ingrandimento originale: 40x (barra di scala – 50 m). (C) Giemsa-colorazione dello striscio ottenuto dopo FNA di un’effusione peritoneale il giorno 21 dell’infezione, ha mostrato numerosi parassiti (punta di freccia) mescolati con cellule ospiti (mouse), in questo caso cellule, macrofagi (freccia infiammatoria) e linfociti. Ingrandimento originale: 40x (barra di scala – 50 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5 : Sfumati FNA di scarsa qualità. (A) Sbavatura scarsamente cellulare, sotto-rappresentante della massa o dell’organo. (B) Sbavatura molto spessa. (C) Artefatto schiacciato, con cellule interrotte, nuclei nudi e striature di DNA. (D) Aggrega e stratifica gli strati delle celle. DAB contrapporre l’ematossilina Harris. Ingrandimento originale: 20x (barra di scala : 100 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 : Confronto tra citologia epidica e istologia nei topi infettati da T. brucei. (A) Microfotografie corrispondenti a uno striscio FNA e (B) a una sezione di paraffina di 4 m, allo stesso ingrandimento (20x ingrandimento originale, barra della scala 100 m), entrambi immunostasi per le proteine superficiali del parassita (VSG). Lo striscio mostrava un gran numero di parassiti (freccia) con morfologia cellulare ben conservata, mescolata con un numero moderato di cellule germinali e pochi spermatozoi (freccia). La sezione istologica mostrava un’architettura tissutale ben conservata, composta da condotti epididilici con spermatozoi intraluminali (freccia), e la presenza di un gran numero di parassiti che espandevano lo stroma epiditra (punta di freccia). DAB contrapporre l’ematossilina Harris. Ingrandimento originale: 20x (barra di scala : 100 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Fine Needle Aspiration (FNA) è un metodo ampiamente utilizzato per diagnosticare la malattia negli animali umani e domestici. La tecnica è stata standardizzata nel corso di molti anni1,2, che fa uso di un ago di piccolo foro per aspirare cellule o fluidi da una massa palpabile o organo1,3. L’aspirato viene quindi in genere spalmato su uno scivolo di vetro e macchiato per l’osservazione microscopica per ottenere una diagnosi, ma la tecnica può anche essere utilizzata per recuperare le cellule per altri scopi4,5,6, 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9.

La procedura è rapida (<5 min per topo, per un ricercatore esperto) e il rischio di complicanze è minimo, simile al rischio che si verifica quando si subisce una semplice foratura venosa. Per questo motivo, per FNA di masse palpabili, l'anestesia è necessaria solo per le posizioni anatomiche sensibili o quando una buona immobilizzazione dell'animale e la stabilizzazione dell'organo o della massa da aspirare è estremamente cruciale per risultati ottimali. Questo è frequente per i piccoli animali da laboratorio, come moderazione sicura ed efficace di un piccolo roditore con una mano, garantendo il miglior accesso alla zona per l'aspirazione con l'altra mano, è difficile da raggiungere senza anestesia. L'anestesia a breve termine è nella maggior parte dei casi sufficiente, tuttavia necessaria, per una buona FNA nel mouse. Una buona immobilizzazione massimizza le possibilità di ottenere un aspirato rappresentativo dei componenti cellulari della lesione e riduce al minimo le possibilità di esternalizzare la punta dell'ago mentre viene applicata una pressione negativa.

Anche se la procedura in sé è molto semplice, l’applicazione coordinata e il rilascio del vuoto sono i passaggi più critici. Dopo l’inserimento dell’ago, lo stantuffo della siringa viene retrattato per ottenere un vuoto controllato (aspirazione), e l’ago può essere rimosso dalla massa solo dopo aver rilasciato la pressione negativa lasciando andare lo stantuffo (Figura 2); altrimenti l’aspirato viene aspirato nella canna della siringa ed è quindi molto difficile da recuperare. Un altro passo molto importante è la preparazione di strisci di alta qualità. Ci sono vari metodi per fare uno striscio, ma indipendentemente dal metodo, gli strisci devono essere preparati immediatamente dopo che il materiale è stato posizionato sul vetro. Il materiale biologico deve essere distribuito delicatamente per evitare artefatti di schiacciamento cellulare. L’uso di un coverslip come spargimento può aiutare a prevenire questi artefatti. Tuttavia, l’applicazione di troppa forza mentre si effettua lo striscio romperà il coperchio. Uno striscio di buona qualità ha tipicamente la maggior parte della popolazione cellulare distribuita come monostrato in modo che possano trasmettere facilmente la luce. Il materiale cellulare non deve essere eccessivamente intrappolato nel coagulo di sangue.

L’obiettivo di un FNA è quello di raccogliere le cellule da una massa, tessuto o organo. L’uso di aghi di foro più grandi è utile per aumentare la cellularità, ma può essere associato a un’eccessiva contaminazione del sangue, mentre il campionamento con aghi più piccoli produce una qualità superiore, anche se il materiale meno abbondante. Nel nostro caso, l’aspirazione percutanea delle strutture riproduttive maschili esterne in topi infetti sperimentalmente da T. brucei, è stata eseguita con aghi a 22 scartato accoppiati a una siringa da 5 mL. I topi erano anestesizzati, il testicolo è stato stabilizzato con una mano e puntura e aspirazione guidati ed eseguiti con l’altra mano. Abbiamo recuperato numerosi trypanosomi mescolati con cellule germinali, spermatozoi, cellule epiteliali e cellule stromali, che sono state spalmate e immunostainse per le proteine superficiali dei parassiti (VSG) (Figura 4).

C’è sempre il potenziale errore di campionamento negli aspirati che producono risultati negativi perché anche se più aree di una data lesione possono essere campionate più volte, questa è un’aspirazione cieca in cui non visualizziamo la punta dell’ago e l’organo o la massa bersaglio. Questo è estremamente rilevante in un ambiente clinico, dove una FNA negativa di una lesione sospetta non evita ulteriori indagini, ma non è così rilevante nei modelli animali di malattia. Pertanto, le limitazioni generali includono principalmente falsi risultati negativi e meno frequentemente risultati falsi positivi (ad esempio, da contaminazione del sangue), ma la limitazione più importante nell’impostazione della sperimentazione animale è la mancanza di informazioni sui tessuti architettura17, come abbiamo fatto con la istopatologia, ad esempio il modello di distribuzione dei parassiti, delle cellule immunitarie e le caratteristiche di interazione cellula-cellula. Ciò nonostante, i vantaggi sono che la FNA è una procedura non terminale che consente il campionamento ripetuto nello stesso animale nel tempo e consente sempre una morfologia cellulare meglio conservata (Figura 5). Alternative a FNA per la raccolta di cellule ospiti, cellule immunitarie o microrganismi da un topo si basano sempre sull’eutanasia del mouse per raccogliere la massa o gli organi di interesse.

A nostra conoscenza, ci sono solo poche relazioni sull’uso della FNA in piccoli animali da laboratorio, una del 1949 corrispondente all’aspirazione del midollo osseo con 22 G ago per studiare l’ematopoiesi18, e tutte le altre in combinazione con la citometria di flusso quantificare le cellule infiammatorie associate al tumore o le cellule endoteliali7,19,20. Il nostro lavoro dimostra che questa tecnica può essere estesa alla diagnosi e allo studio di modelli di malattie infettive e può combinare la cattività con tecniche come l’immunocitochimica o la microscopia elettronica. Due dei principali vantaggi del metodo negli animali sperimentali sono: (1) questa procedura non è terminale, cioè può essere eseguita in topi vivi; e (2) a causa della sua lieve gravità consente aspirazioni seriali nello stesso animale. Quindi sono necessari meno topi per ogni studio, e la correlazione tra la progressione della malattia clinica e l’evoluzione delle caratteristiche cellulari e molecolari di una malattia e/o di un microrganismo può essere facilmente eseguita, consentendo così studi longitudinali.

Forse il primo rapporto sull’uso di FNA per la diagnosi di una malattia infettiva è uno studio di Grieg e Gray nel 1904 che riporta le aspirazioni di ago dei linfonodi da pazienti con malattia del sonno, che ha rivelato tripelli motile12. Se i nostri risultati nei topi di laboratorio trovano la traduzione al bestiame, cioè che se il Trypanosoma può essere facilmente campionato dalla FNA dalle strutture riproduttive maschili esterne, ci si può aspettare che questa tecnica sarà utile ai veterinari per la diagnosi animale trypanosomiasi in azienda, nel bestiame.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto è stato finanziato da Fundao para a Ciància e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciància, e Ensino Superior (MCTES) attraverso Fundos do Or’amento de Estado (ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF è un investigatore della Società para a Cioncia e (Se/Tecnologia/01050/2014) e il laboratorio è finanziato dal CER (FatTryp, ref.771714). La pubblicazione di questo lavoro è stata finanziata anche dal progetto UID/BIM/50005/2019 finanziato da Fundao para a Ciància e a (FCT)/ Ministério da Ciància, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) attraverso Fundos do Or’amento de Estado. Ringraziamo Andreia Pinto del Laboratorio di Istologia e Patologia Comparata dell’iMM per l’esperta assistenza alla microscopia elettronica, e Sandra Trindade, Tiago Rebelo e Henrique Machado (iMM) per aver condiviso i tessuti da topi infetti.

Materials

Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) Bio 2 7418046 Anesthesia reversal
Cover slips (24 x 60 No.1) VWR 631-0664 Smear making
DAB Dako K3468 Immunocytochemistry
Entellan (500 mL) VWR 1.07961.0500 Mounting media
Envision Flex antibody diluent Dako 8006 Immunocytochemistry
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) Dako K4010 Immunocytochemistry
Envision Flex Wash Buffer Dako K8007 Immunocytochemistry
Giemsa stain Atom Scientific Ltd RRSPSS-A Smear staining
Glass slides (Superfrost Plus) VWR 631-9483 Smear making
Harris Haematoxylin Bio-optica 05-06004E Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxidase solution Sigma H1009-500ML Immunocytochemistry
Hypodermic needles Microlance 3 (23G) Henry Schein 902-8001 Aspiration technique
Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) Bio 2 7410928 Anesthesia
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 2 7418335 Anesthesia
Methanol Merck 1.06009.2511 Smear fixative
Pap pen Merck Z377821-1EA Immunocytochemistry
Protein Block Serum free Dako X0909 Immunocytochemistry
Syringes (5 mL, 10 mL) Henry Schein 900-3311, 900-3304 Aspiration technique
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References

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Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).
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