איתור של Extravascular טריאנוסומה טפילים על ידי שאיפה מחט פיין
Summary
שאיפה מחט פיין היא טכניקה, לפיו התאים מתקבלים מפצע או איבר באמצעות מחט דקה. חומר מנושפי מרוח, מוכתם ונבדק תחת מיקרוסקופ לאבחון או משמש לביולוגיה מולקולרית, לצילנסה או לניתוח מבחנה. הוא זול, פשוט, מהיר וגורם לטראומה מינימלית.
Abstract
פיין מחט שאיפה (FNA) הוא הליך אבחון שגרתי חיוני הן מנהגים רפואיים וטרינריים. זה מורכב השאיפה הפרעורית של תאים ו/או מיקרואורגניזמים מגושים מוחשי, איברים או פליטות (הצטברות נוזלים בחלל הגוף) באמצעות מחט דקה דומה מחט רגילה המשמש לנקב הורידים. החומר שנאסף על ידי FNA הוא באופן כללי סלולרי מאוד, ואת האספירין מאוחזרים מרוח אז, האוויר מיובש, רטוב קבוע, ויטראז ונצפתה תחת מיקרוסקופ. בהקשר הקליני, FNA הוא כלי אבחון חשוב המשמש כמדריך לניהול הטיפולית המתאימה. מכיוון שהוא פשוט, מהיר, פולשני מינימלית ודורש השקעה מוגבלת במעבדה ובמשאבי אנוש, הוא משמש באופן נרחב על ידי מתרגלים וטרינרי, בעיקר בבית, אבל גם בבעלי חיים חקלאיים. במחקרים באמצעות דגמי בעלי חיים, FNA יש את היתרון כי ניתן לבצע שוב ושוב באותו בעלי חיים, המאפשר מחקרים האורך דרך אוסף של תאים מגידולים ואיברים/רקמות במהלך המחלה. בנוסף למיקרוסקופיה השוטפת, ניתן להשתמש בחומר מאוחזר גם לאימונוציטוכימיה, מיקרוסקופ אלקטרונים, אנליזה ביוכימית, הזרמת הcy, ביולוגיה מולקולרית או מבחנה. FNA נעשה שימוש כדי לזהות את פרוטוזוזה טפיל טריאנוסומה בלוטות בגונדות של עכברים נגועים, פתיחת האפשרות לאבחנה עתידית בבקר.
Introduction
פיין מחט שאיפה (FNA) משמש רבות באבחון של סרטן ומחלות שאינן נאופלסטית, הן בבעלי חיים אנושיים וביתיים. הטכניקה הייתה סטנדרטית במשך השנים והיא מתוארת בספרי לימוד רבים1,2.
זה מורכב בעיקר השאיפה הפרעורית של גושים מוחשי, איברים או פליטות עם מחט דקה מצויד מזרק ריק, באמצעות הלחץ השלילי למשוך תאים או נוזל מן המסה1,3. מחטים הם בדרך כלל 22 כדי 25 G (מד המתאים לקוטר הפנימי של המחט), והשימוש במחט גדולה יותר (קוטר גדול, למשל, 21 G) מועיל כדי להגדיל את cellularity, למרות שזה יכול לייצר זיהום דם מוגזם. אורך המחט יהיה תלוי בעומק המסה אבל 1 או 11/2 אינטש משמש בדרך כלל להמונים שטחיים. מזרקים הם בדרך כלל 5 כדי 10 מ ל, עם מזרקים גדולים יותר השגת ואקום גבוה יותר, אשר בתורו מגביר את התשואה לשאוב. מיסות עמוקות שאינן מוחשי יכולות להיות גם משועבות, עם מחטים ארוכות ותחת הדרכה לתמונה (ultrasonography). לאחר מכן יכול להיות מרוח, מיובשים, רטוב קבוע, מוכתם ונצפה תחת מיקרוסקופ כדי להשיג אבחנה3 (איור 1).
זוהי טכניקה פשוטה, זולה, ללא כאבים ופולשנית בעיקר בשימוש בהגדרה preאופרטיבית כדי להשיג אבחנה על מיסות מוחשי וגם עבור איברים, כמו בלוטות הלימפה, בלוטת התריס, ערמונית או אפילו מבנים חיצוניים הרבייה גברים 1. בנוסף להיותו כלי אבחון, ניתן להשתמש בטכניקה זו לצורך איסוף תאים למטרות אחרות, כלומר ציטוגנטיקה, מיקרוסקופ אלקטרוני (איור 1d), אפיון של מעבד ציטומטק4,5 ,6,7, הקמת תרביות תאים8. דוגמה נפוצה בתחום הקליני היא אחזור זרע עבור הפריה חוץ גופית9.
השאיפה יכולה לחזור על עצמה מספר פעמים באותה מסה כדי לקבל מספר מסמירים. במקרה של נגע הטרוגנית, למשל, אזור מוצק ומרחב סיסטיק, חשוב שתאים משוטחים מכל אזור. החומר שנאסף על ידי FNA הוא באופן כללי סלולרי מאוד, אשר ברוב המקרים מאפשר אבחון של מחלות ללא צורך ביופסיה של רקמות. , כתמים מיוחדים. מאימונולובורנציה אימונוציטוכימיה (איור 1D), וטכניקות מולקולריות ניתן לבצע גם בסמארים שהתקבלו באמצעות FNA, למשל, לזיהוי של סוכנים זיהומיות כאשר לא ניתן לזהותם על ידי מורפולוגיה לבד10. סקירה קצרה של היישומים הכלליים ושל הציוד והאספקה הדרושים עבור FNA מסוכמים בטבלאות 1 ו- 2, בהתאמה.
הדו ח הראשון על השימוש בניקוב המחט למטרות אבחון מתואר בכתבי מוקדם של הרפואה הערבית, אבל זה בתחילת המאה ה -20 כי המחט המודרנית טכניקות השאיפה יושמו11. בעיקר, אולי הדו ח הראשון שמרמז על השימוש FNA לאבחון של מחלות זיהומיות היה מחקר ב 1904, שם גריג ו גריי דיווחו על שאיפות המחט של בלוטות הלימפה מפני חולים עם מחלת שינה חשף מורצפת טריאנוזומים12 . המחברים דיווחו על נוכחות של טריאנוזומים במקרים מוקדמים ומתקדמים, ובצפיפות גבוהה יותר מזו שנראתה בסמירים בדם, בהם אירועים נדירים בדרך כלל12.
האבחנה הנוכחית של טרינוסומהרציה בבקר מסתמכת על התבוננות ישירה של טפילים בדם, הלימפה או בטכניקות אבחון חיסוני13,14,15. בעבר הצגנו כי בזיהומים הניסיוניים טריאנוסומה בעכבר, טריאנוסומה ברוסייבי (T. brucei) יש הטרוריזם מדהים כדי לעשות שומן ברקמה16 וגם חלק ממבני הרבייה של גברים חיצוניים, כלומר האפידיזה17. טפילים להצטבר משתית של רקמות אלה במספרים גדולים16.
הפרוטוקול המתואר להלן מתאר הליך טכני מפורט צעד אחר צעד עבור FNA בעכברים חיים, שמטרתו השאיפה של טריאנוזומים הנמצאים במבני הרבייה החיצוניים של הזכרים (בעיות, אפידיסטיות ואפידימל שומן), ולאחריה ציטולוגיה וכתמים קונבנציונליים עבור חלבונים טפיל ספציפיים (vsg)16,17. השאיפה בוצעה 6 ימים לאחר שהליכי ההדבקה והבטיחות החלים הם אלה שהוקמו בדרך כלל לטיפול שגרתי בבעלי חיים ניסיוניים. אמצעים נוספים נדרשים עבור בעלי חיים שיש להם ליקויים חיסוניים (לבישת שמלת קיטור מעוקר, מסכה, שיער כובע, כפפות סטרילי, ולהבטיח טכניקה אספטי בכל עת) כדי להמתיק חשיפה מקרית לפתוגנים אופורטוניסטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיין מחט שאיפה (FNA) היא שיטה נפוצה לאבחן מחלות בבעלי חיים אנושיים וביתיים. הטכניקה היתה סטנדרטית במשך שנים רבות1,2, אשר עושה שימוש מחט קטנה נשא לאספירין תאים או נוזל ממסה ממשית או איבר1,3. המנושף מרוח בדרך כלל על שקופית זכוכית ומוכתם להשגחה מיקרוסקופית כדי להשיג אבחנה, אבל הטכניקה יכולה לשמש גם לאחזור תאים למטרות אחרות4,5,6, מיכל סבן , בן שמונה , . בסדר, תשע
ההליך הוא מהיר (< 5 דקות לכל העכבר, עבור חוקר מנוסה) והסיכון של סיבוכים הוא מינימלי, בדומה לסיכון שנגרמו כאשר עובר ניקוב ורידים פשוטה. מסיבה זו, עבור FNA של ההמונים ממשית, הרדמה נדרשת רק מיקומים אנטומיים רגישים או כאשר השתק טוב של בעל החיים וייצוב של האיבר או מסה להיות מורדם הוא חיוני מאוד עבור תוצאות אופטימליות. זה תדיר עבור חיות מעבדה קטנות, כמו איפוק בטוח ואפקטיבי של מכרסם קטן עם יד אחת תוך הבטחת הגישה הטובה ביותר לאזור לשאיפה עם היד האחרת, קשה להשיג ללא הרדמה. הרדמה לטווח קצר היא ברוב המקרים מספיק, בכל זאת הכרחי, עבור FNA טוב בעכבר. השתק טוב מגדיל את הסיכוי להשיג את המאכלת, כי הוא נציג של הרכיבים הסלולריים של הנגע וגם ממזער את הסיכויים להטות את קצה המחט בעוד לחץ שלילי מוחל.
למרות ההליך עצמו הוא מאוד פשוט, יישום מתואם ושחרור של ואקום הם הצעדים הקריטיים ביותר. לאחר החדרת המחט, את הבוכנה של המזרק הוא שואב כדי להשיג ואקום מבוקרת (יניקה), ואת המחט ניתן להסיר רק מן המסה לאחר שחרור הלחץ השלילי על ידי הסרת הבוכנה (איור 2); אחרת את האספירין הוא נשאב לתוך החבית של המזרק, ולאחר מכן קשה מאוד להתאושש. צעד חשוב נוסף הוא הכנת מסמיארים איכותיים. ישנן שיטות שונות לבצע הכתם, אך ללא קשר לשיטה, יש להכין את הסמירים מיד לאחר שהחומר הוצב על הזכוכית. החומר הביולוגי צריך להתפשט בעדינות כדי למנוע חפצים מלמחוץ את התאים. שימוש coverslip כמו פסק יכול לעזור למנוע את החפצים האלה. עם זאת, היישום של כוח רב מדי תוך הפיכת הכתם ישבור את הכיסויים. הכתם באיכות טובה בדרך כלל יש את רוב אוכלוסיית התא מופץ כמונאולייר כך שהם יכולים בקלות לשדר אור. חומר סלולארי לא צריך להיות. לכוד בתוך קריש הדם
המטרה של FNA היא לאסוף תאים ממסה, רקמה או איבר. השימוש במחטים גדולות יותר הוא מועיל כדי להגדיל את cellularity, אבל יכול להיות משויך לזיהום דם מופרז, בעוד דגימה עם מחטים קטנות תשואות איכות גבוהה יותר, אם כי פחות חומר שופע. במקרה שלנו, השאיפה הפרעורית של מבנים חיצוניים הרבייה הגברי של עכברים בניסויים נגועים T. brucei, בוצע עם מחטים 22 מצמידים בתוספת 5 מ”ל מזרק. העכברים היו מורדם, הקלפים התייצבו ביד אחת, נקב והשאיפה הונחה והופיעה עם היד השנייה. החזרנו טריאנוזומים רבים בתאי הנבט, הזרע, תאים אפיתל, תאים סטרומה, אשר היו מרוח ומוכתם חיסוני של הטפילים של פני השטח (VSG) (איור 4).
יש תמיד את שגיאת הדגימה הפוטנציאלית בתוך משמת תוצאות שליליות מניב, כי למרות אזורים מרובים של נגע נתון ניתן לטעום מספר פעמים, זהו שאיפה עיוור שבו אנחנו לא לדמיין את קצה המחט ואת איבר היעד או המסה. זה רלוונטי ביותר בסביבה קלינית, שבה FNA שלילית של נגע חשוד לא ברור חקירה נוספת, אבל זה לא רלוונטי כל כך במודלים של בעלי חיים של מחלות. לפיכך, מגבלות כלליות כוללות בעיקר תוצאות שליליות כוזבות, והתוצאות החיוביות פחות שקריות (למשל, מזיהום הדם), אך המגבלה החשובה ביותר בקביעת ניסויים בבעלי חיים היא חוסר מידע על רקמות אדריכלות17, כמו שיש לנו עם histopathology, למשל דפוס הפצה של טפילים, של תאים חיסוניים, ואת האינטראקציה תא תאים תכונות. למרות זאת, היתרונות הם ש-FNA היא הליך שאינו מסוף המאפשר את הדגימה החוזרת באותה חיה באותה התקופה ומאפשרת תמיד למבנה הסלולר השמור טוב יותר (איור 5). חלופות FNA לקצירת תאים מארחים, תאים חיסוניים או מיקרואורגניזמים מעכבר תמיד להסתמך על המתת החסד של העכבר כדי לאסוף את המסה או איברים של עניין.
לידיעתך, יש רק דיווחים מעטים על השימוש FNA בחיות מעבדה קטנות, אחד מ 1949 מתאים לשאיפה של מח עצם עם המחט G 22 לימוד המטפיאה18, וכל אחרים בשילוב עם cy, לנסות ל מכמת או תאים דלקתיים הקשורים לגידול או תאים אנדותל7,19,20. העבודה שלנו מראה כי ניתן להרחיב את הטכניקה הזאת לאבחון ולמחקר של דגמי מחלות זיהומיות והוא יכול לשלב ציטולוגיה עם טכניקות כגון אימונוציטוטוכימיה או אלקטרון מיקרוסקופ. שניים מהיתרונות העיקריים של השיטה בבעלי חיים ניסיוניים הם: (1) הליך זה אינו מסוף, כלומר, ניתן לבצע בעכברים חיים; ו-(2) בשל חומרת מתון היא מאפשרת שאיפות סדרתיות באותה חיה. ולכן פחות עכברים נדרשים עבור כל מחקר, ואת הקורלציה בין התקדמות של מחלה קלינית האבולוציה של התכונות הסלולר והמולקולרי של מחלה ו/או מיקרואורגניזם ניתן לבצע בקלות, ובכך מאפשר לימודי האורך.
אולי הדו ח הראשון על השימוש FNA לאבחון מחלות זיהומיות הוא מחקר של גריג וגריי ב 1904 כי דוחות שאיפות המחט של בלוטות הלימפה מחולים עם מחלת שינה, אשר חשף טריאנוזומים מורצפת12. אם הממצאים שלנו בעכברי מעבדה למצוא תרגום בקר, כלומר, כי אם טריאנוסומה ניתן לדגום בקלות על ידי FNA מן מבנים חיצוניים הרבייה הגברי, אפשר לצפות כי טכניקה זו תהיה שימושית לוטרינרים לאבחון בעלי חיים מחלת השינה בחווה, במשק החי.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן על ידי הפונדחידה הסינית הסינית (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnoלוגיה e Ensino מעולה (MCTES) דרך Fundos do Orçamento דה Estado (ref.: ID/בים/50005/2019). LMF הוא חוקר של הפונדסאו של הדיווה הטובה ביותר (IF/01050/2014) והמעבדה ממומנת על ידי ERC (FatTryp, ref. 771714). פרסום של עבודה זו ממומנת גם UID/בים בם/50005/2019 הפרויקט ממומן על ידי הדיווה העליונה Ciência e Tecnoלוגיה (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnoוגיה e Ensino מעולה (MCTES) דרך Fundos do Orçamento דה Estado. אנו מודים Andreia פינטו מהמעבדה היסטולוגיה השוואתי פתולוגיה של iMM לסיוע מומחה מיקרוסקופ אלקטרון, וסנדרה טרידייד, Tiago המורדים הנריק מצ (iMM) עבור שיתוף רקמות מפני עכברים נגועים.
Materials
| Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Anesthesia reversal |
| Cover slips (24 x 60 No.1) | VWR | 631-0664 | Smear making |
| DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemistry |
| Entellan (500 mL) | VWR | 1.07961.0500 | Mounting media |
| Envision Flex antibody diluent | Dako | 8006 | Immunocytochemistry |
| EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) | Dako | K4010 | Immunocytochemistry |
| Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemistry |
| Giemsa stain | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Smear staining |
| Glass slides (Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Smear making |
| Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemistry |
| Hydrogen Peroxidase solution | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemistry |
| Hypodermic needles Microlance 3 (23G) | Henry Schein | 902-8001 | Aspiration technique |
| Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Anesthesia |
| Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Anesthesia |
| Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Smear fixative |
| Pap pen | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemistry |
| Protein Block Serum free | Dako | X0909 | Immunocytochemistry |
| Syringes (5 mL, 10 mL) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Aspiration technique |
References
- Leopold, G., Koss, M. R. M. . Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. , (2006).
- Raskin, R. E., Meyer, D. J. . Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. , (2016).
- Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185 (3), 819-824 (1992).
- Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107 (33), 14524-14529 (2010).
- Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
- Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40 (4), 307-319 (1998).
- Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
- Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43 (6), 985-990 (1999).
- Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63 (5), 1038-1042 (1995).
- Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120 (3), 351-367 (1998).
- Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47 (2), 191-197 (2009).
- Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1 (2265), 1252 (1904).
- Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47 (6), 727-734 (1972).
- Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. , 1-15 (2009).
- Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12 (2), 186-194 (2012).
- Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19 (6), 837-848 (2016).
- Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), 1-15 (2018).
- Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (2013).
- Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13 (3), 251-258 (2010).
- Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21 (7), 648-661 (2013).
