Nachweis von extravaskulären Trypanosoma Parasiten durch Feine Nadelaspiration
Summary
Fine Needle Aspiration ist eine Technik, bei der Zellen aus einer Läsion oder einem Organ mit einer dünnen Nadel gewonnen werden. Aspiriertes Material wird verschmiert, gebeizt und unter dem Mikroskop zur Diagnose untersucht oder für molekularbiologische, Zytometrie oder In-vitro-Analyse verwendet. Es ist billig, einfach, schnell und verursacht minimale Traumata.
Abstract
Fine Needle Aspiration (FNA) ist ein routinemäßiges diagnostisches Verfahren, das sowohl für medizinische als auch für Tierarztpraxen unerlässlich ist. Es besteht aus der perkutanen Aspiration von Zellen und/oder Mikroorganismen aus fühlbaren Massen, Organen oder Ergüssen (Flüssigkeitsansammlung in einer Körperhöhle) mit einer dünnen Nadel, ähnlich der regulären Nadel, die für die venöse Punktion verwendet wird. Das von FNA gesammelte Material ist im Allgemeinen hochzellulär, und das abgerufene Aspirat wird dann verschmiert, luftgetrocknet, nassfixiert, gebeizt und unter dem Mikroskop beobachtet. Im klinischen Kontext ist FNA ein wichtiges diagnostisches Instrument, das als Leitfaden für ein geeignetes therapeutisches Management dient. Da es einfach, schnell, minimal invasiv ist und begrenzte Investitionen in Labor und Humanressourcen erfordert, wird es von Tierärzten ausgiebig genutzt, vor allem in Heimen, aber auch in Nutztieren. In Studien mit Tiermodellen hat FNA den Vorteil, dass es wiederholt bei demselben Tier durchgeführt werden kann, was Längsschnittstudien durch die Entnahme von Zellen aus Tumoren und Organen/Geweben im Verlauf der Krankheit ermöglicht. Neben der Routinemikroskopie kann das entnommene Material auch für die Immunzytochemie, Elektronenmikroskopie, biochemische Analyse, Durchflusszytometrie, Molekularbiologie oder In-vitro-Assays verwendet werden. FNA wurde verwendet, um den Protozoenparasiten Trypanosoma brucei in den Gonaden infizierter Mäuse zu identifizieren, was die Möglichkeit für eine zukünftige Diagnose bei Rindern eröffnet.
Introduction
Fine Needle Aspiration (FNA) ist weit verbreitet in der Diagnose von Krebs und nicht-neoplastischen Krankheiten, sowohl bei menschlichen als auch bei Haustieren. Die Technik wurde im Laufe der Jahre standardisiert und ist in zahlreichen Lehrbüchern1,2beschrieben.
Es besteht weitgehend aus der perkutanen Aspiration von fühlbaren Massen, Organen oder Ergüssen mit einer dünnen Nadel, die auf eine leere Spritze montiert ist, wobei der Unterdruck verwendet wird, um Zellen oder Flüssigkeit aus der Masse1,3abzuziehen. Nadeln sind in der Regel 22 bis 25 G (Spur entsprechend dem Nadelinnendurchmesser), und die Verwendung einer größeren Bohrungnadel (großer Durchmesser, z.B. 21 G) ist hilfreich, um die Zelllichkeit zu erhöhen, obwohl dies zu einer übermäßigen Blutkontamination führen kann. Die Nadellänge hängt von der Tiefe der Masse ab, aber 1 oder 1 1/2 Zoll wird häufig für oberflächliche Massen verwendet. Spritzen sind in der Regel 5 bis 10 ml, mit größeren Spritzen erreichen höhere Vakuum, was wiederum erhöht die Saugleistung. Auch nicht greifbare tiefsitzende Massen können mit längeren Nadeln und unter Bildführung (Ultraschall) angesaugt werden. Das abgerufene Aspirat kann dann verschmiert, luftgetrocknet, nassfixiert, gebeizt und unter dem Mikroskop beobachtet werden, um eine Diagnose3 zu erhalten (Abbildung 1).
Dies ist eine einfache, kostengünstige, schmerzlose und minimal-invasive Technik, die hauptsächlich in der präoperativen Einstellung verwendet wird, um eine Diagnose auf fühlbaren Massen und auch für Organe, wie Lymphknoten, Schilddrüse, Prostata oder sogar die äußeren männlichen Fortpflanzungsstrukturen zu erreichen 1. Neben einem diagnostischen Werkzeug, kann diese Technik für die Sammlung von Zellen auch für andere Zwecke verwendet werden, nämlich Zytogenetik, Elektronenmikroskopie (Abbildung 1D), Durchfluss zytometrische Charakterisierung4,5 ,6,7, Etablierung von Zellkulturen8. Ein häufiges Beispiel in der klinischen Praxis ist die Spermienabrufung für die In-vitro-Fertilisation9.
Aspiration kann mehrmals in der gleichen Masse wiederholt werden, um mehrere Abstriche zu erhalten. Bei einer heterogenen Läsion, z.B. einem festen Bereich und einem zystischen Raum, ist es wichtig, dass Zellen aus jeder Region angesaugt werden. Das von der FNA gesammelte Material ist im Allgemeinen hochzellulär, was in den meisten Fällen die Diagnose von Krankheiten ohne die Notwendigkeit einer Gewebebiopsie ermöglicht. Spezielle Flecken, Immunfluoreszenz. Immunzytochemie (Abbildung 1D), und molekulare Techniken können auch in Abstrichen durchgeführt werden, die durch FNA erhalten werden, z. B. zur Identifizierung von Infektionserregern, wenn sie allein durch die Morphologie nicht erkennbar sind10. Ein kurzer Überblick über die allgemeinen Anwendungen sowie die für die FNA benötigten Ausrüstungen und Vorräte sind in den Tabellen 1 bzw. 2zusammengefasst.
Der erste Bericht über die Verwendung der Nadelpunktion für diagnostische Zwecke wird in frühen Schriften der arabischen Medizin beschrieben, aber es ist im frühen 20. Jahrhundert, dass moderne Nadelaspirationstechniken implementiert wurden11. Bemerkenswert ist, dass der erste Bericht, der die Verwendung von FNA für die Diagnose von Infektionskrankheiten nahelegt, eine Studie im Jahr 1904 war, in der Grieg und Gray von Nadelabsaugungen von Lymphknoten von Patienten mit Schlafkrankheit berichteten, die motile Trypanosomen zeigten12 . Die Autoren berichteten das Vorhandensein von Trypanosomen in frühen und fortgeschrittenen Fällen, und mit einer höheren Dichte als bei Blutabstrichen, wo dies oft seltene Ereignissesind 12.
Die aktuelle Diagnose der Trypanosomiasis bei Rindern beruht auf der direkten Beobachtung von Parasiten im Blut, lymph oder in immundiagnostischen Techniken13,14,15. Wir haben zuvor gezeigt, dass bei experimentellen Trypanosoma-Infektionen in der Maus, Trypanosoma brucei (T. brucei) hat einen bemerkenswerten Tropismus zu Fettgewebe16 und auch zu einigen der externen männlichen Fortpflanzungsstrukturen, nämlich epididymis17. Parasiten sammeln sich in den Stroma dieser Gewebe in großen Zahlen16.
Das unten dargestellte Protokoll beschreibt ein detailliertes technisches Verfahren für FNA bei lebenden Mäusen, das auf die Aspiration von Trypanosomen in den äußeren männlichen Fortpflanzungsstrukturen (Hodidymis, Epididymis und epididymales Fett) abzielt, gefolgt von konventionelle Zytologie und Immunostainierung für spezifische Parasitenproteine (VSG)16,17. Die Aspiration wurde 6 Tage nach der Infektion durchgeführt und die Sicherheitsverfahren, die gelten, sind diejenigen, die üblicherweise für den routinemäßigen Umgang mit Versuchstieren etabliert sind. Zusätzliche Maßnahmen sind für Tiere erforderlich, die Immunschwächen haben (tragen ein dampfsterilisiertes Kleid, Maske, Haarhaube, sterile Handschuhe und die Sicherstellung einer aseptischen Technik zu jeder Zeit), um die versehentliche Exposition gegenüber opportunistischen Krankheitserregern zu mildern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fine Needle Aspiration (FNA) ist eine Methode, die weit verbreitet ist, um Krankheiten bei menschlichen und Haustieren zu diagnostizieren. Die Technik wurde über viele Jahre standardisiert1,2, die Verwendung einer Kleinbohrnadel verwendet, um Zellen oder Flüssigkeit aus einer fühlbaren Masse oder Organ1,3zu aspirieren. Das Aspirat wird dann in der Regel auf einem Glasschlitten verschmiert und für die mikroskopische Beobachtung gebeizt, um eine Diagnose zu erhalten, aber die Technik kann auch verwendet werden, um Zellen für andere Zwecke abzurufen4,5,6, 7 , 8 , 9.
Das Verfahren ist schnell (<5 min pro Maus, für einen erfahrenen Forscher) und das Risiko von Komplikationen ist minimal, ähnlich dem Risiko, das bei einer einfachen venösen Punktion anfällt. Aus diesem Grund ist bei FNA von fühlbaren Massen eine Anästhesie nur für empfindliche anatomische Stellen erforderlich oder wenn eine gute Immobilisierung des Tieres und die Stabilisierung des Organs oder der zu aspirierenden Masse für optimale Ergebnisse extrem entscheidend ist. Dies ist häufig für kleine Labortiere, da sichere und effektive Zurückhaltung eines kleinen Nagetiers mit einer Hand bei gleichzeitiger Gewährleistung des besten Zugangs zum Gebiet für Aspiration mit der anderen Hand, ist schwer ohne Anästhesie zu erreichen. Kurzzeitanästhesie ist in den meisten Fällen ausreichend, dennoch notwendig, für eine gute FNA in der Maus. Eine gute Immobilisierung maximiert die Chancen, ein Aspirat zu erhalten, das repräsentativ für die zellulären Komponenten der Läsion ist und minimiert auch die Wahrscheinlichkeit, die Spitze der Nadel zu externalisieren, während Unterdruck ausgeübt wird.
Obwohl das Verfahren selbst sehr einfach ist, sind koordinierte Anwendung und Freisetzung von Vakuum die wichtigsten Schritte. Nach dem Einsetzen der Nadel wird der Kolben der Spritze zurückeingezogen, um ein kontrolliertes Vakuum (Saugung) zu erreichen, und die Nadel kann nur nach Freigabe des Unterdrucks durch Loslassen des Kolbens aus der Masse entfernt werden (Abbildung 2); andernfalls wird das Aspirat in den Lauf der Spritze gesaugt und ist dann sehr schwer zu erholen. Ein weiterer sehr wichtiger Schritt ist die Herstellung von hochwertigen Abstrichen. Es gibt verschiedene Methoden, um einen Abstrich zu machen, aber unabhängig von der Methode sollten Abstriche sofort vorbereitet werden, nachdem das Material auf das Glas gelegt wurde. Das biologische Material sollte sanft verteilt werden, um Zellzerkleinerungsartefakte zu vermeiden. Die Verwendung eines Deckzettels als Streuer kann helfen, diese Artefakte zu verhindern. Jedoch, die Anwendung von zu viel Kraft während der Herstellung der Abstrich wird den Abdeckungsrutsch brechen. Ein guter Abstrich hat in der Regel den größten Teil der Zellpopulation als Monolayer verteilt, so dass sie leicht Licht übertragen können. Zellmaterial sollte nicht übermäßig im Blutgerinnsel gefangen sein.
Das Ziel einer FNA ist es, Zellen aus einer Masse, Gewebe oder Organ zu sammeln. Die Verwendung von größeren Bohrungsnadeln ist hilfreich, um die Zelllichkeit zu erhöhen, kann aber mit übermäßiger Blutkontamination in Verbindung gebracht werden, während Proben mit kleineren Nadeln eine höhere Qualität ergeben, wenn auch weniger reichlich Material. In unserem Fall wurde die perkutane Aspiration der äußeren männlichen Fortpflanzungsstrukturen bei Mäusen, die experimentell mit T. bruceiinfiziert waren, mit 22-Spur-Nadeln durchgeführt, die an eine 5 ml Spritze gekoppelt waren. Mäuse wurden anästhesiert, die Hoden mit einer Hand stabilisiert und Punktion und Aspiration geführt und mit der anderen Hand durchgeführt. Wir haben zahlreiche Trypanosomen mit Keimzellen, Spermatozoen, Epithelzellen und Stromalzellen gefunden, die für die Oberflächenproteine der Parasiten (VSG) verschmiert und immungefärbt wurden (Abbildung 4).
Es gibt immer den potenziellen Stichprobenfehler bei Aspiren, der negative Ergebnisse liefert, denn obwohl mehrere Bereiche einer bestimmten Läsion mehrmals beprobt werden können, ist dies eine blinde Aspiration, bei der wir die Nadelspitze und das Zielorgan oder die Masse nicht visualisieren. Dies ist äußerst relevant in einem klinischen Umfeld, in dem eine negative FNA einer verdächtigen Läsion weitere Untersuchungen nicht ausschließt, aber sie ist nicht so relevant in Tiermodellen von Krankheiten. Allgemeine Einschränkungen umfassen daher hauptsächlich falsch negative Ergebnisse und seltener falsch positive Ergebnisse (z. B. durch Blutkontamination), aber die wichtigste Einschränkung bei der Einstellung von Tierversuchen ist der Mangel an Informationen über Gewebe Architektur17, wie wir es bei der Histopathologie haben, z.B. Verteilungsmuster von Parasiten, von Immunzellen und Zell-Zell-Interaktionsmerkmalen. Dennoch ist es von Vorteil, dass FNA ein nicht-terminales Verfahren ist, das die wiederholte Probenahme im gleichen Tierüberlauf ermöglicht und immer eine besser erhaltene zelluläre Morphologie ermöglicht (Abbildung 5). Alternativen zu FNA zur Gewinnung von Wirtszellen, Immunzellen oder Mikroorganismen von einer Maus verlassen sich immer auf die Einschläferung der Maus, um die Masse oder die Voninteresse entosenden Organe zu sammeln.
Unserer Kenntnis nach gibt es nur wenige Berichte über die Verwendung von FNA bei kleinen Labortieren, einer von 1949, der der Aspiration des Knochenmarks mit 22 G Nadel für die Untersuchung der Hämatopoese18entspricht, und alle anderen in Kombination mit der Durchflusszytometrie, um quantifizieren entweder tumorassoziierte Entzündungszellen oder Endothelzellen7,19,20. Unsere Arbeit zeigt, dass diese Technik auf die Diagnose und Untersuchung von Infektionskrankheitsmodellen ausgedehnt werden kann und Zytologie mit Techniken wie Immunzytochemie oder Elektronenmikroskopie kombinieren kann. Zwei der Hauptvorteile der Methode bei Versuchstieren sind: (1) Dieses Verfahren ist nicht endlos, d. h. kann bei lebenden Mäusen durchgeführt werden; und (2) aufgrund seiner milden Schwere ermöglicht es serielle Aspirationen bei demselben Tier. Daher werden für jede Studie weniger Mäuse benötigt, und die Korrelation zwischen dem Fortschreiten der klinischen Krankheit und der Evolution der zellulären und molekularen Merkmale einer Krankheit und/oder eines Mikroorganismus kann leicht durchgeführt werden, was Längsschnittstudien ermöglicht.
Vielleicht ist der erste Bericht über die Verwendung von FNA zur Diagnose einer Infektionskrankheit eine Studie von Grieg und Gray aus dem Jahr 1904, die Nadelabsaugungen von Lymphknoten von Patienten mit Schlafkrankheit meldet, die motile Trypanosomen12offenbarten. Wenn unsere Befunde bei Labormäusen eine Übersetzung in s. Rinder finden, d.h. dass, wenn Trypanosoma leicht von FNA aus den äußeren männlichen Fortpflanzungsstrukturen beprobt werden kann, kann man erwarten, dass diese Technik für Tierärzte nützlich sein wird, um Tiere zu diagnosigen Trypanosomiasis in der Landwirtschaft, im Viehbestand.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) über Fundos do Oréamento de Estado (Ref.: ID/BIM/50005/2019) finanziert. LMF ist ein Prüfer des Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia (IF/01050/2014) und das Labor wird vom ERC (FatTryp, Ref.771714) finanziert. Die Veröffentlichung dieser Arbeit wurde auch gefördert UID/BIM/50005/2019 Projekt finanziert, das von Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) über Fundos do Oréamento de Estado finanziert wurde. Wir danken Andreia Pinto vom Histologie- und Vergleichslabor für Pathologie des iMM für die fachkundige Unterstützung der Elektronenmikroskopie und Sandra Trindade, Tiago Rebelo und Henrique Machado (iMM) für die gemeinsame Nutzung von Geweben von infizierten Mäusen.
Materials
| Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Anesthesia reversal |
| Cover slips (24 x 60 No.1) | VWR | 631-0664 | Smear making |
| DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemistry |
| Entellan (500 mL) | VWR | 1.07961.0500 | Mounting media |
| Envision Flex antibody diluent | Dako | 8006 | Immunocytochemistry |
| EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) | Dako | K4010 | Immunocytochemistry |
| Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemistry |
| Giemsa stain | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Smear staining |
| Glass slides (Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Smear making |
| Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemistry |
| Hydrogen Peroxidase solution | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemistry |
| Hypodermic needles Microlance 3 (23G) | Henry Schein | 902-8001 | Aspiration technique |
| Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Anesthesia |
| Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Anesthesia |
| Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Smear fixative |
| Pap pen | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemistry |
| Protein Block Serum free | Dako | X0909 | Immunocytochemistry |
| Syringes (5 mL, 10 mL) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Aspiration technique |
References
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