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Immunology and Infection

Détection des parasites extravasculaires de trypanosoma par l'aspiration fine d'aiguille

Published: August 07, 2019
doi:
10.3791/59798
, ,
1Comparative Pathology Unit,Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa, 2Biology of Parasitism Laboratory,Instituto de Medicina Molecular – Faculdade de Medicina de Lisboa

Summary

Fine Needle Aspiration est une technique, par laquelle les cellules sont obtenues à partir d’une lésion ou d’un organe à l’aide d’une aiguille mince. Le matériel aspiré est enduit, taché et examiné au microscope pour le diagnostic ou utilisé pour la biologie moléculaire, la cytométrie ou l’analyse in vitro. Il est bon marché, simple, rapide et provoque un traumatisme minimal.

Abstract

Fine Needle Aspiration (FNA) est une procédure diagnostique de routine essentielle aux pratiques médicales et vétérinaires. Il se compose de l’aspiration percutanée des cellules et/ou des micro-organismes provenant de masses, d’organes ou d’effusions palpables (accumulation de liquide dans une cavité corporelle) à l’aide d’une fine aiguille semblable à l’aiguille ordinaire utilisée pour la ponction veineuse. Le matériel recueilli par la FNA est en général très cellulaire, et l’aspiration récupérée est ensuite enduite, séchée à l’air, fixée sur humide, tachée et observée au microscope. Dans le contexte clinique, la FNA est un outil diagnostique important qui sert de guide à la prise en charge thérapeutique appropriée. Parce qu’il est simple, rapide, peu invasif et nécessite un investissement limité dans le laboratoire et les ressources humaines, il est largement utilisé par les vétérinaires, principalement dans les domestiques, mais aussi dans les animaux de ferme. Dans les études utilisant des modèles animaux, FNA a l’avantage qu’il peut être effectué à plusieurs reprises dans le même animal, permettant des études longitudinales grâce à la collecte de cellules à partir de tumeurs et d’organes / tissus au cours de la maladie. En plus de la microscopie de routine, le matériel récupéré peut également être utilisé pour l’immunocytochimie, la microscopie électronique, l’analyse biochimique, la cytométrie du débit, la biologie moléculaire ou des essais in vitro. FNA a été utilisé pour identifier le parasite protozoaire Trypanosoma brucei dans les gonades de souris infectées, ouvrant la possibilité d’un diagnostic futur chez les bovins.

Introduction

Fine Needle Aspiration (FNA) est largement utilisé dans le diagnostic du cancer et des maladies non néoplastiques, à la fois chez les animaux humains et domestiques. La technique a été normalisée au fil des ans et est décrite dans de nombreux manuels1,2.

Il se compose en grande partie de l’aspiration percutanée de masses palpables, organes ou effusions avec une fine aiguille installée sur une seringue vide, en utilisant la pression négative pour retirer les cellules ou le liquide de la masse1,3. Les aiguilles sont généralement de 22 à 25 G (gauge correspondant au diamètre intérieur de l’aiguille), et l’utilisation d’une aiguille de forage plus grande (grand diamètre, p. ex. 21 G) est utile pour augmenter la cellularité, bien que cela puisse produire une contamination sanguine excessive. La longueur de l’aiguille dépendra de la profondeur de la masse, mais 1 ou 1 1/2 pouce est couramment utilisé pour les masses superficielles. Les seringues mesurent généralement de 5 à 10 ml, les seringues plus grosses atteignant un vide plus élevé, ce qui augmente le rendement de l’aspiration. Les masses profondes non palpables peuvent également être aspirées, avec des aiguilles plus longues et sous le guidage d’image (ultrasonographie). L’aspiration récupérée peut ensuite être enduite, séchée à l’air, fixée sur humide, tachée et observée au microscope pour obtenir un diagnostic3 (Figure 1).

Il s’agit d’une technique simple, peu coûteuse, indolore et mini-invasive principalement utilisée dans le cadre préopératoire pour obtenir un diagnostic sur les masses palpables et aussi pour les organes, comme les ganglions lymphatiques, la thyroïde, la prostate ou même les structures reproductrices masculines externes 1. En plus d’être un outil de diagnostic, cette technique peut être utilisée pour la collecte de cellules à d’autres fins, à savoir la cytogénétique, la microscopie électronique (Figure 1D), la caractérisation cytométrique du débit4,5 ,6,7, établissement des cultures cellulaires8. Un exemple courant dans la pratique clinique est la récupération de sperme pour la fécondation in vitro9.

L’aspiration peut être répétée plusieurs fois dans la même masse pour obtenir des frottis multiples. Dans le cas d’une lésion hétérogène, par exemple, une zone solide et un espace cystique, il est important que les cellules soient aspirées de chaque région. Le matériel recueilli par FNA est en général très cellulaire, ce qui dans la plupart des cas permet le diagnostic de maladies sans avoir besoin d’une biopsie tissulaire. Taches spéciales, immunofluorescence. l’immunocytochimie (Figure 1D), et les techniques moléculaires peuvent également être effectuées dans des frottis obtenus par l’intermédiaire de FNA, par exemple, pour l’identification des agents infectieux lorsqu’ils ne sont pas reconnaissables par la morphologie seule10. Un bref aperçu des applications générales ainsi que de l’équipement et des fournitures nécessaires à la FNA est résumé aux tableaux 1 et 2, respectivement.

Le premier rapport sur l’utilisation de la ponction d’aiguille à des fins diagnostiques est décrit dans les premiers écrits de la médecine arabe, mais c’est au début du 20ème siècle que les techniques modernes d’aspiration d’aiguille ont été mises en œuvre11. Notamment, peut-être le premier rapport qui suggère l’utilisation de FNA pour le diagnostic des maladies infectieuses était une étude en 1904, où Grieg et Gray ont rapporté des aspirations d’aiguille des ganglions lymphatiques des patients présentant la maladie de sommeil a indiqué trypanosomes motile12 . Les auteurs ont rapporté la présence des trypanosomes dans les cas tôt et avancés, et à une densité plus élevée que celle vue dans des frottis sanguins, où ce sont souvent des événements rares12.

Le diagnostic actuel de Trypanosomiasis dans le bétail repose sur l’observation directe des parasites dans le sang, la lymphe ou dans les techniques d’immunodiagnostic13,14,15. Nous avons déjà montré que dans les infections expérimentales de Trypanosoma dans la souris, Trypanosoma brucei (T. brucei) a un tropisme remarquable pour adimer le tissu16 et également à certaines des structures reproductrices masculines externes, nommément épididyme17. Les parasites s’accumulent dans le stroma de ces tissus en grand nombre16.

Le protocole décrit ci-dessous une procédure technique détaillée étape par étape pour la FNA chez les souris vivantes, visant à l’aspiration des trypanosomes présents dans les structures reproductrices mâles externes (testis, épididyme, et graisse épididymale), suivie par cytologie conventionnelle et immunostaining pour des protéines parasites spécifiques (VSG)16,17. L’aspiration a été réalisée 6 jours après l’infection et les procédures de sécurité qui s’appliquent sont celles généralement établies pour la manipulation de routine des animaux expérimentaux. Des mesures supplémentaires sont nécessaires pour les animaux qui ont des déficiences immunitaires (portant une robe stérilisée à la vapeur, masque, bonnet de cheveux, gants stériles, et d’assurer la technique aseptique en tout temps) pour atténuer l’exposition accidentelle à des agents pathogènes opportunistes.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux dans ce protocole ont été réalisées conformément à la réglementation de l’UE et approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Instituto de Medicina Molecular (iMM), (AEC-2011-006-LF-TBrucei-IMM). L’installation animale de l’iMM est conforme à la loi portugaise sur l’utilisation d’animaux de laboratoire (décret-loi 113/2013) et suit les directives de la directive européenne 2010/63/UE et de la FELASA (Fédération des associations européennes de sciences animales de laboratoire) et recommandations concernant le bien-être des animaux de laboratoire. 1. Aspiration des parasites des organes reproducteurs mâles externes de la souris REMARQUE: L’aspiration fine d’aiguille (FNA) a été exécutée dans les souris mâles sauvages de C57BL/6J, 6 à 10 semaines, infectées par T. brucei par l’injection intrapéritonéale de 200 l de saline avec 2.000 parasites comme décrit précédemment16. Pour la FNA des organes reproducteurs mâles externes, placez la souris dans une hotte à flux laminaire, anesthésiez l’animal avec une injection intrapéritonéale de 200 l d’un mélange de 75 mg/kg de kétamine 1 mg/kg de médétomidine en salin. Confirmer l’anesthésie avec la méthode de pincement des orteils. Lorsque le réflexe de la rétraction de la jambe est absent, positionnez la souris dans le recumbency dorsal (Figure 2A). Palpalez soigneusement les testicules, évaluant la taille et la distance de la peau sus-jacente. Maintenez l’organe entre l’index et le majeur ou entre l’index et le pouce. Étirez la peau sus-jacente étroitement à travers la masse pour immobiliser davantage la cible. Nettoyez la surface avec des lingettes à alcool (Figure 2A). Maintenez l’aiguille assemblée de 22 G et la seringue de 5 ml et insérez la pointe de l’aiguille dans la cible, toujours avec le piston dans le reste (figure2B-C). Appliquer l’aspiration en rétractant le piston de seringue à la marque de 4 ml à 5 ml 2-3 fois. Rediriger l’aiguille à l’intérieur de l’organe soit en ligne droite ou le long de plusieurs tangentes différentes pour augmenter la probabilité d’un échantillon représentatif et de cibler des structures plus petites comme l’épididyme. Assurez-vous que cette procédure est douce, afin de minimiser les lésions tissulaires (Figure 2C-D). Relâchez l’aspiration, puis retirez l’aiguille. Ne redessinez pas l’aiguille avec le piston rétracté car cela conduira à l’aspiration de l’aspirate dans le canon de la seringue et entravera sa récupération (Figure 2E). Après le retrait de l’aiguille, contrôlez tout saignement en appliquant une pression à l’aide d’une éponge à gaze stérilisée au point de ponction. Débranchez la seringue de l’aiguille, remplissez-la d’air, reconnectez l’aiguille et éjecteriez doucement le contenu de l’aiguille sur une glissière. Placez le bout de l’aiguille très près ou même sur la glissière pour éviter les éclaboussures (Figure 2F-I). Effectuer au moins une aspiration supplémentaire par organe/animal pour assurer l’échantillonnage de la réplique. Retournez l’anesthésie avec une injection sous-cutanée de 200 l de 1 mg/kg d’Atipamezole en saline et retournez les animaux dans leur cage d’origine pour le récupérer et observer jusqu’à la récupération complète. 2. Préparation de frottis à partir du matériel aspiré REMARQUE: Utilisez des gants tout au long de la procédure et assurez-vous d’éliminer en toute sécurité les aiguilles et les seringues. Méthode de traction de deux étapes Ramassez la diapositive qui a la goutte de l’aspiration à l’aide de la main non dominante, et pincez l’extrémité givrée entre le pouce et l’index (Figure 3A). Ramassez une deuxième diapositive propre, la glissière d’épandeur, avec la main dominante et apportez-la à travers la première diapositive avec la baisse de l’aspiration. Placez le bord lisse et propre de la glissière sur la glissière du spécimen juste sur le dessus de la chute à un angle d’environ 30 degrés (Figure 3B). Faites glisser la glissière vers l’avant avec un mouvement léger, continu et régulier pour obtenir un film mince (Figure 3C). Reposez la glissière et permettre le séchage à l’air complet et rapide du matériau (Figure 3D). Ne pas fixer la chaleur. Étiqueter le bord givré de la glissière à l” avance à l’un ou l’autre.REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause à cette étape et les frottis peuvent être stockés indéfiniment jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être tachés. 3. La coloration des frottis REMARQUE: Utilisez des gants tout au long de la procédure et assurez-vous que les étapes 3.1.4 et 3.2.9 sont effectuées à l’intérieur d’une hotte de fumée. Protocole de coloration giemsa Fixer les frottis séchés à l’air en plongeant les lames dans un bocal Coplin contenant 100 % de méthanol pendant 5 min (figure 3E). Transférer la diapositive dans un bocal Coplin contenant 20% de solution Giemsa (diluée à 1/5 dans de l’eau distillée) pendant 30 min, ou 10% de Giemsa pendant 10 min (figure 3F). Rincer à l’eau du robinet et sécher soigneusement à l’aide de papier de soie pour tamponner. Maintenez la glissière horizontalement et appliquez une goutte du milieu de montage non aqueous sur le frottis. Placez le bord d’un couvercle-verre sur la glissière, abaissez-la et appuyez doucement pour enlever les bulles d’air. Immunocytochimie dans les frottis FNA Fixer les frottis séchés à l’air dans 100 % de méthanol à température ambiante pendant 10 min. Laver la diapositive pendant 5 min dans un pot De Coplin avec 1x tampon de phosphate (PBS), répétant cette étape 3 fois en utilisant frais 1x PBS à chaque fois. Retirez la diapositive du pot De Coplin, essuyez l’excès de tampon sans toucher le frottis et dessinez un cercle autour du frottis avec un stylo répulsif à l’eau (Table des matériaux). Maintenez la glissière horizontalement et appliquez 150 l de solution d’anticorps primaire diluée à chaque frottis et incubez pendant 1 h à température ambiante.REMARQUE: L’anticorps primaire utilisé ici est un antigène non purifié de sérum de lapin anti-T. brucei VSG13 (cross-réactif avec beaucoup de VsG de T. brucei, produit en interne), dilué dans 1x PBS à 1:50,000. Effectuer des contrôles négatifs en remplaçant l’anticorps primaire approprié par du sérum pré-immun (tableaudes matériaux)pour permettre l’évaluation de la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire. Laver la diapositive pendant 5 min dans un pot Coplin avec 1x PBS, en répétant cette étape 3 fois en utilisant frais 1x PBS à chaque fois. Maintenez la glissière horizontalement et appliquez 150 l de peroxidase de raifort/DAB disponibles dans le commerce à chaque frottis. Incuber pendant 30 min à température ambiante (Table des Matériaux). Laver pendant 3x pendant 5 min en 1x PBS. Contre-tache en immergeant les diapositives dans un bocal Coplin contenant de l’hématoxylin Harris. Rincer à l’eau du robinet et sécher soigneusement à l’aide de papier pour tamponner. Maintenez la glissière horizontalement et appliquez une goutte du milieu de montage non aqueous sur le frottis. Placez le bord d’un couvercle-verre sur la glissière, abaissez-la et appuyez doucement pour enlever les bulles d’air.

Representative Results

La FNA a été réalisée dans les organes reproducteurs mâles externes de souris infectées par T. brucei à l’aide d’une aiguille de 22 G couplée à une seringue de 5 ml, et des lames de verre pour la préparation du frottis (Figure 1A-C). La méthode est simple mais les résultats optimaux reposent sur des étapes critiques : immobilisation parfaite de la souris obtenue par anesthésie générale, et stabilisation des organes tout au long de la procédure (Figure 2A-B). La succion a été appliquée 2-3 fois et l’aiguille a été redirigée 1-2 fois pour permettre l’échantillonnage représentatif des plus petits organes et tissus : épididyme et graisse épididymale. La pression négative a été libérée avant d’externaliser l’aiguille. L’aspiration contenue dans le lumen et le moyeu de l’aiguille (environ 20 l), a été utilisée pour produire 2 frottis (Figure 3A-C). Dans les cas où l’aiguille a été retirée sans la libération de l’aspiration, le matériau a été aspiré dans la seringue et n’était pas récupérable. Le processus a été répété avec succès deux fois, un pour chaque organe apparié. Après le séchage, des frottis ont été humides-fixes et l’immunocytochemistry pour les protéines de surface trypanosome a été exécutée. Un frottis de bonne qualité (Figure 4A-C) a été caractérisé par une monocouche de cellules avec une bonne densité cellulaire, dans laquelle les cellules hôtes montrent des caractéristiques morphologiques préservées, permettant l’identification de leurs tissus d’origine et de leurs proportion entre les uns et les autres. Les parasites étaient efficacement immunotachés, identifiables et dénombrent (figure 4B). Un cas d’une FNA d’une effusion péritonéale chez une souris infectée, tachée de Giemsa pour observation directe et diagnostic, est également montré (Figure 3D-F et Figure 4C). Un résultat FNA médiocre ou négatif peut être dû à des raisons différentes : (1) trop peu de matériel FNA est exprimé sur la diapositive et est sous-représentant de l’échantillon; (2) trop de matériel de FNA est exprimé sur une seule diapositive, faisant des frottis trop épais et altérant l’évaluation cytologique ; (3) trop de force est appliquée lors de la fabrication du frottis, et les cellules sont perturbées, résultant en beaucoup de noyaux nus et des stries d’ADN (artipfact écrasement); ou (4) pas assez de force est appliquée lors de la fabrication du frottis et les cellules ne se désagrégent pas, résultant en une couche stratifiée qui empêche l’évaluation des caractéristiques morphologiques des cellules (Figure 5). Lorsque nous comparons la cytopathologie de la FNA avec l’histopathologie, c’est-à-dire l’analyse des cellules par rapport aux tissus, le poing a l’avantage que la morphologie cellulaire est mieux préservée et que les proportions relatives et le comptage des cellules peuvent être mieux évalués (figure 6). En outre, l’immunocytochimie est plus simple, plus rapide et plus facile à optimiser que l’immunohistochimie, qui est généralement effectuée dans les tissus corrigés de formaline et de paraffine. cible Applications Avantages Limitations Masse palpable Microscopie de routine, diagnostic Simple, rapide Pas d’architecture tissulaire organe Immunohistochemistry Faible coût Aspiration aveugle (l’aiguille peut manquer la cible tangentiellement; l’aspiration peut cibler les zones nécrotiques, cystiques ou hémorragiques) Effusions Cytométrie de flux Échantillonnage à partir de plusieurs sites Cytogénétique Morphologie cellulaire bien préservée Microscopie électronique Sans complications PCR, autres techniques moléculaires Haute précision diagnostique Analyse biochimique Anesthésie (pour l’immobilisation) Essais in vitro, culture cellulaire Procédure non terminale Tableau 1 : Cible, applications générales, avantages et limitation de l’aspiration fine à l’aiguille. Kit FNA Archétype d’une aiguille et d’une seringue d’aspiration aspiration: Pièces d’aiguille : 1. Seringues en plastique jetables (5 ou 10 ml) (Figure 1B) Bevel, c’est moi. L’extrémité de l’arbre d’aiguille est inclinée pour former un point, l’inclinaison étant le bevel. Seules les aiguilles vétusées conviennent aux aspirations percutanées. 3. Aiguilles de calibre 22 à 25 (diamètre); 0,75, 1,0, 1,5 pouces de long, avec bord standard de pointe d’aiguille bevée (Figure 1A) C’est Shaft. Partie tubulaire creuse de l’aiguille dont la longueur peut être ajustée en fonction de la profondeur de la masse. La jauge de l’aiguille correspond au diamètre de son forage, qui est le diamètre de l’intérieur de l’arbre (les petites aiguilles ont une jauge plus élevée). L’utilisation de plus grandes aiguilles de forage (moins de 22 G) est utile pour augmenter la cellularité, bien que cela puisse produire la contamination sanguine iatrogénique excessive. 1. Anesthésie (si nécessaire). La douleur associée à la FNA est semblable à celle d’une ponction veineuse, cependant, une bonne aspiration nécessite une bonne immobilisation du sujet, particulièrement important chez les petits animaux et / ou pour les petites lésions fluctuantes et les organes. Les rats et les souris soumis à la FNA doivent être correctement retenus passivement, ou, si nécessaire, sous sédatifs ou être sous anesthésie générale légère. Le hub. Partie en plastique de l’aiguille qui est attachée à la seringue; doit être transparent pour permettre la visualisation du matériau aspiré. Le matériau d’aspiration obtenu au cours de la FNA doit être recueilli dans l’arbre de l’aiguille et l’aspiration arrêtée lorsque le matériau est vu entrer dans le moyeu. FnA smear making and interpretation: FNA smear making and interpretation: FNA smear making and interpretation: FNA Pièces de seringue : 1. Diapositives de microscope en verre d’extrémité givrée (figure 1C) Baril/cylindre. Partie creuse de la seringue. À moins que le traitement des lésions ou des effusions cystiques, le matériel qui est aspiré au baril généralement ne peut pas être récupéré. Le volume idéal d’aspiration pour la cytologie de la FNA est d’environ 5 L, ce qui correspond au volume moyen d’aspiration qui occupe l’arbre et le moyeu de l’aiguille. 2. Taches de type Romanowsky (p. ex. Diff-Quik, Giemsa) Astuce. Fin du canon auquel le moyeu d’aiguille est attaché. 3. Microscope (champ lumineux) Le Piston. Partie mobile de la seringue qui a un disque plat ou une lèvre à une extrémité et un joint en caoutchouc à l’autre extrémité. S’adapte dans le canon et fournit la pression pour attirer les cellules, fluide dans l’aiguille. Un piston parfaitement scellé qui crée une bonne pression négative est obligatoire pour obtenir un bon rendement d’aspiration. Tableau 2 : Équipement et fournitures nécessaires à l’aspiration fine à l’aiguille. Figure 1 : Outils et résultats pour l’aspiration fine d’aiguille. (A) Diamètre idéal de l’aiguille pour FNA est de 22 à 25 G. (B) Le volume idéal de seringue pour obtenir un bon rendement d’aspiration est de 5 à 10 ml. (C) Propre, sec, exempt de lamede de verre de graisse avec zone de marquage givrée pour l’écriture avec le crayon et pré-enduit (si pour l’immunohistochimie). (D) Exemple de trypanosomes observés avec la coloration de Giemsa (tête de flèche noire), immunostained pour les protéines de surface de VSG (tête de flèche blanche) et sous la microscopie électronique de transmission (flèche de bloc). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Schématiques montrant l’aspiration fine d’aiguille (FNA) des organes reproducteurs masculins externes (testis, épididyme, et graisse épididymale) chez lessouris. (A) Une fois l’animal fixé, l’instrument d’aspiration précédemment assemblé est ramassé. (B-C) Insérez la pointe de l’aiguille dans l’organe cible. (D) Appliquer l’aspiration en rétractant le piston de seringue à la marque de 1 ml à 2 ml, à plusieurs reprises 3-4 fois. La pointe de l’aiguille peut également être déplacée d’avant en arrière à l’intérieur de la cible tout en appliquant l’aspiration, pour recueillir suffisamment de matériel. (E) Relâchez l’aspiration et retirez ensuite l’aiguille. (F) Retirez l’aiguille de la seringue et (G) Tirez le piston vers l’arrière. (H) Rattacher l’aiguille. (I) Expulser le matériau sur une lame de verre en poussant le piston rapidement à travers la seringue. Afin d’éviter les éclaboussures, assurez-vous que la pointe de l’aiguille repose très près ou même sur la glissière. La goutte d’aspiration est placée à environ 1 cm du bord de la zone de marquage givrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Préparation de frottis et coloration. (A) Tenez une extrémité de la glissière (zone givrée) entre le pouce et l’index. (B) Placez le bord lisse et propre d’une deuxième glissière (spreader) sur la glissière du spécimen juste en face de la goutte de matériau. (C) Faites glisser la propagation vers l’avant une fois à une vitesse modérée pour obtenir un film mince. (D) Laisser sécher la glissière à l’air et étiqueter le bord givré de la glissière à l’intérieur d’un crayon. (E) Après un séchage complet avec du méthanol pendant 5 min. (F) Tache avec 20% de solution Giemsa pendant 30 min (ou 10% Giemsa pour 10 min). Rincer légèrement à l’eau, sécher complètement, tremper dans le xylène et monté à l’eau d’un agent de montage insoluble. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Microphotographies de frottis obtenus à partir de la FNA de structures reproductrices mâles externes chez des souris infectées par T. brucei. (A) Apparence brute d’un frottis direct de bonne qualité : le matériau s’est exprimé sur la glissière à environ 1 cm du bord givré (point noir), barbouillé et arrêté 0,5 cm avant le bord de la glissière (lignes parallèles). (B) L’immunocytochimie pour les protéines de surface du parasite (VSG) a été effectuée pour les frottis obtenus à partir de FNA des organes reproducteurs mâles externes le jour 6 de l’infection. De nombreux parasites (pointe de flèche) ont été détectés mélangés avec des cellules germinales de souris (flèche). DAB contre-taché avec de l’hématoxylin Harris. Grossissement d’origine : 40x (barre d’échelle de 50 m). (C) Giemsa-staining du frottis obtenu après FNA d’une effusion péritonéale le jour 21 de l’infection, a montré de nombreux parasites (tête de flèche) mélangés avec des cellules d’hôte (souris), dans ce cas cellules inflammatoires, macrophages (flèche) et lymphocytes. Grossissement d’origine : 40x (barre d’échelle de 50 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Frottis FNA de mauvaise qualité. (A) Mal fisottis cellulaire, sous-représentant de la masse ou de l’organe. (B) Frottis très épais. (C) Artefact écrasé, avec des cellules perturbées, des noyaux nus et des stries d’ADN. (D) Agrégats et couches stratifiées de cellules. DAB contre-taché avec de l’hématoxylin Harris. Grossissement d’origine : 20x (barre d’échelle de 100 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 6 : Comparaison de la cytologie épididymale et de l’histologie chez les souris infectées par T. brucei. (A) Microphotographies correspondant à un frottis de LAFN et (B) une section de paraffine de 4 m, au même grossissement (20x grossissement original, barre d’échelle de 100 m), les deux immunostained pour les protéines de surface du parasite (VSG). Le frottis a montré un grand nombre de parasites (tête de flèche) avec une morphologie cellulaire bien préservée, mélangéavec un nombre modéré de cellules germinales et peu de spermatozoïdes (flèche). La section histologique a montré une architecture de tissu bien préservée, composée des conduits épididymal avec le spermatozoïde intra-luminal (flèche), et la présence d’un grand nombre de parasites augmentant le stroma épididymal (tête de flèche). DAB contre-taché avec de l’hématoxylin Harris. Grossissement d’origine : 20x (barre d’échelle de 100 m). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Fine Needle Aspiration (FNA) est une méthode largement utilisée pour diagnostiquer la maladie chez les animaux humains et domestiques. La technique a été normalisée sur de nombreuses années1,2, qui fait usage d’une aiguille de petit-bore pour aspirer les cellules ou le liquide d’une masse palpable ou organe1,3. L’aspiration est alors généralement barbouillée sur un toboggan en verre et tachée pour l’observation microscopique pour réaliser un diagnostic, mais la technique peut également être employée pour récupérer des cellules pour d’autres buts4,5,6, 7 Annonces , 8 Annonces , 9.

La procédure est rapide (5 min par souris, pour un chercheur expérimenté) et le risque de complications est minime, semblable au risque encouru lors de la simple ponction veineuse. Pour cette raison, pour la FNA de masses palpables, l’anesthésie n’est nécessaire que pour les endroits anatomiques sensibles ou lorsqu’une bonne immobilisation de l’animal et la stabilisation de l’organe ou de la masse à aspirer est extrêmement cruciale pour des résultats optimaux. Ceci est fréquent pour les petits animaux de laboratoire, car la retenue sûre et efficace d’un petit rongeur d’une main tout en assurant le meilleur accès à la zone pour l’aspiration avec l’autre main, est difficile à réaliser sans anesthésie. L’anesthésie à court terme est dans la plupart des cas suffisante, néanmoins nécessaire, pour une bonne FNA dans la souris. Une bonne immobilisation maximise les chances d’obtenir un aspirate représentatif des composants cellulaires de la lésion et minimise également les chances d’extérioriser la pointe de l’aiguille pendant que la pression négative est appliquée.

Bien que la procédure elle-même soit très simple, l’application coordonnée et la libération du vide sont les étapes les plus critiques. Après l’insertion de l’aiguille, le piston de la seringue est rétracté pour obtenir un vide contrôlé (aspiration), et l’aiguille ne peut être retirée de la masse qu’après avoir relâché la pression négative en lâchant le piston (figure2); sinon l’aspiration est aspirée dans le canon de la seringue et est alors très difficile à récupérer. Une autre étape très importante est la préparation de frottis de haute qualité. Il existe différentes méthodes pour faire un frottis, mais quelle que soit la méthode, les frottis doivent être préparés immédiatement après que le matériau a été placé sur le verre. Le matériel biologique doit être étalé doucement pour éviter les artefacts de cellules-écrasement. L’utilisation d’un bordereau comme épandeur peut aider à prévenir ces artefacts. Cependant, l’application d’une trop grande force tout en faisant le frottis brisera le coverslip. Un frottis de bonne qualité a généralement la plupart de la population cellulaire distribuée comme monocouche afin qu’ils puissent facilement transmettre la lumière. Le matériel cellulaire ne doit pas être excessivement emprisonné dans le caillot de sang.

Le but d’un FNA est de recueillir des cellules d’une masse, d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation de plus grandes aiguilles de forage est utile pour augmenter la cellularité, mais peut être associée à une contamination excessive du sang, tandis que l’échantillonnage avec des aiguilles plus petites donne une meilleure qualité, mais moins abondante matériau. Dans notre cas, l’aspiration percutanée des structures reproductrices mâles externes chez les souris expérimentalement infectées par T. brucei,a été exécutée avec des aiguilles de 22 calibres couplées à une seringue de 5 ml. Les souris ont été anesthésiés, les testicules ont été stabilisés d’une main et la perforation et l’aspiration guidées et exécutées avec l’autre main. Nous avons récupéré de nombreux trypanosomes mélangés avec des cellules germinales, des spermatozoïdes, des cellules épithéliales et des cellules stromales, qui ont été enduits et immunostained pour les protéines de surface des parasites (VSG) (Figure 4).

Il y a toujours l’erreur d’échantillonnage potentielle dans les aspirates donnant des résultats négatifs parce que bien que plusieurs secteurs d’une lésion donnée puissent être échantillonnés plusieurs fois, c’est une aspiration aveugle où nous ne visualisons pas la pointe d’aiguille et l’organe ou la masse cible. Ceci est extrêmement pertinent dans un cadre clinique, où un FNA négatif d’une lésion suspecte n’empêche pas d’autres investigations, mais il n’est pas si pertinent dans les modèles animaux de la maladie. Ainsi, les limitations générales comprennent principalement les résultats négatifs faux, et moins fréquemment les résultats positifs faux (par exemple, de la contamination du sang), mais la limitation la plus importante dans le cadre de l’expérimentation animale est le manque d’information sur les tissus architecture17, comme nous l’avons avec l’histopathologie, par exemple le modèle de distribution des parasites, des cellules immunitaires, et des dispositifs d’interaction de cellules-cellules. Néanmoins, les avantages sont que la FNA est une procédure non terminale permettant l’échantillonnage répété chez le même animal en temps réel et permet toujours une morphologie cellulaire mieux préservée (figure 5). Les alternatives à la FNA pour la récolte des cellules hôtes, des cellules immunitaires ou des micro-organismes d’une souris comptent toujours sur l’euthanasie de la souris pour recueillir la masse ou les organes d’intérêt.

À notre connaissance, il n’y a que quelques rapports sur l’utilisation de FNA dans de petits animaux de laboratoire, un de 1949 correspondant à l’aspiration de la moelle avec l’aiguille de 22 G pour étudier l’hématopoiesis18,et tous les autres en combination avec la cytométrie de flux à quantifier les cellules inflammatoires associées à la tumeur ou les cellules endothéliales7,19,20. Nos travaux montrent que cette technique peut être étendue au diagnostic et à l’étude des modèles de maladies infectieuses et peut combiner la cytologie avec des techniques comme l’immunocytochimie ou la microscopie électronique. Deux des principaux avantages de la méthode chez les animaux expérimentaux sont les : (1) cette procédure n’est pas terminale, c’est-à-dire qu’elle peut être pratiquée chez des souris vivantes; et (2) en raison de sa sévérité légère, il permet des aspirations sérielles chez le même animal. Par conséquent, moins de souris sont nécessaires pour chaque étude, et la corrélation entre la progression de la maladie clinique et l’évolution des caractéristiques cellulaires et moléculaires d’une maladie et / ou micro-organisme peut être facilement réalisée, permettant ainsi des études longitudinales.

Peut-être le premier rapport sur l’utilisation de fnA pour diagnostiquer une maladie infectieuse est une étude par Grieg et Gray en 1904 qui rapporte des aspirations d’aiguille des ganglions lymphatiques des patients atteints de la maladie du sommeil, qui a révélé trypanosomes motile12. Si nos résultats chez les souris de laboratoire trouvent une traduction aux bovins, c’est-à-dire que si Trypanosoma peut être facilement échantillonné par la FNA à partir des structures reproductrices mâles externes, on peut s’attendre à ce que cette technique soit utile aux vétérinaires pour diagnostiquer les animaux trypanosomiase à la ferme, dans le bétail.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce projet a été financé par Fundaço para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) par Fundos do Orçamento de Estado (réf.: ID/BIM/50005/2019). LMF est un chercheur de la Fundaçao para a Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014) et le laboratoire est financé par l’ERC (FatTryp, ref.771714). La publication de ces travaux a également été financée par le projet UID/BIM/50005/2019 financé par Fundaçao para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) par fundos do Orçamento de Estado. Nous remercions Andreia Pinto du Laboratoire d’histologie et de pathologie comparée de l’iMM pour son aide experte en microscopie électronique, et Sandra Trindade, Tiago Rebelo et Henrique Machado (iMM) pour le partage de tissus provenant de souris infectées.

Materials

Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) Bio 2 7418046 Anesthesia reversal
Cover slips (24 x 60 No.1) VWR 631-0664 Smear making
DAB Dako K3468 Immunocytochemistry
Entellan (500 mL) VWR 1.07961.0500 Mounting media
Envision Flex antibody diluent Dako 8006 Immunocytochemistry
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) Dako K4010 Immunocytochemistry
Envision Flex Wash Buffer Dako K8007 Immunocytochemistry
Giemsa stain Atom Scientific Ltd RRSPSS-A Smear staining
Glass slides (Superfrost Plus) VWR 631-9483 Smear making
Harris Haematoxylin Bio-optica 05-06004E Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxidase solution Sigma H1009-500ML Immunocytochemistry
Hypodermic needles Microlance 3 (23G) Henry Schein 902-8001 Aspiration technique
Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) Bio 2 7410928 Anesthesia
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 2 7418335 Anesthesia
Methanol Merck 1.06009.2511 Smear fixative
Pap pen Merck Z377821-1EA Immunocytochemistry
Protein Block Serum free Dako X0909 Immunocytochemistry
Syringes (5 mL, 10 mL) Henry Schein 900-3311, 900-3304 Aspiration technique
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References

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Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).
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