Detectie van Extravasculaire Trypanosoma -parasieten door fijne naald aspiratie
Summary
Fijne naald aspiratie is een techniek, waarbij cellen worden verkregen uit een laesie of orgaan met behulp van een dunne naald. Aspirated materiaal is besmeurd, gekleurd en onderzocht onder een Microscoop voor diagnose of gebruikt voor moleculaire biologie, cytometrie of in vitro analyse. Het is goedkope, eenvoudig, snel en veroorzaakt een minimaal trauma.
Abstract
Fine Needle aspiratie (FNA) is een routinematige diagnostische procedure die essentieel is voor zowel medische als veterinaire praktijken. Het bestaat uit de percutane aspiratie van cellen en/of micro-organismen uit palpabele massa’s, organen of effusies (vochtophoping in een lichaamsholte) met behulp van een dunne naald vergelijkbaar met de reguliere naald gebruikt voor de veneuze punctie. Het materiaal verzameld door Fna is in het algemeen zeer cellulaire, en de opgehaalde aspiraat wordt vervolgens besmeurd, lucht gedroogd, NAT-vaste, gekleurd en waargenomen onder een microscoop. In de klinische context, FNA is een belangrijk diagnostisch instrument dat dient als een leidraad voor de juiste therapeutische behandeling. Omdat het eenvoudig, snel, minimaal invasief is en beperkte investeringen in het laboratorium en human resources vereist, wordt het op grote schaal gebruikt door veterinaire artsen, meestal in het binnenland, maar ook bij landbouwhuisdieren. In studies met behulp van dierlijke modellen, FNA heeft het voordeel dat het herhaaldelijk kan worden uitgevoerd in hetzelfde dier, waardoor longitudinale studies door de verzameling van cellen van tumoren en organen/weefsels in het verloop van de ziekte. Naast routinematige microscopie, kan teruggevonden materiaal ook worden gebruikt voor immunocytochemie, elektronenmicroscopie, biochemische analyse, Flowcytometrie, moleculaire biologie of in vitro testen. Fna is gebruikt voor het identificeren van de protozoa parasiet Trypanosoma brucei in de geslachtsklieren van geïnfecteerde muizen, het openen van de mogelijkheid voor een toekomstige diagnose bij runderen.
Introduction
Fijne naald aspiratie (FNA) wordt veel gebruikt bij de diagnose van kanker en niet-neoplastische ziekten, zowel bij mens als huisdieren. De techniek is gestandaardiseerd door de jaren heen en wordt beschreven in tal van studieboeken1,2.
Het bestaat grotendeels uit de percutane aspiratie van voelbare massa’s, organen of effusies met een dunne naald aangebracht op een lege spuit, met behulp van de negatieve druk om cellen of vocht uit de massa te trekken1,3. Naalden zijn meestal 22 tot 25 G (gauge overeenkomend met de binnendiameter van de naald), en het gebruik van een grotere boring naald (grote diameter, bijvoorbeeld, 21 G) is nuttig om de cellulariteit te verhogen, hoewel dit overmatige bloed verontreiniging kan produceren. Naald lengte zal afhangen van de diepte van de massa, maar 1 of 11/2 inch wordt vaak gebruikt voor oppervlakkige massa’s. Spuiten zijn meestal 5 tot 10 ml, met grotere spuiten het bereiken van hogere vacuüm, die op zijn beurt verhoogt aspiraat rendement. Niet-palpabele diepliggende massa’s kunnen ook worden aanzuigen, met langere naalden en onder beeld begeleiding (echografie). Het opgehaalde aspiraat kan vervolgens worden besmeurd, lucht gedroogd, NAT-vast, gekleurd en waargenomen onder een microscoop om een diagnose3 (Figuur 1) te bereiken.
Dit is een eenvoudige, goedkope, pijnloze en minimaal invasieve techniek die voornamelijk wordt gebruikt in de preoperatieve setting om een diagnose te stellen op voelbare massa’s en ook voor organen, zoals lymfeklieren, schildklier, prostaat of zelfs de uitwendige mannelijke voortplantings structuren 1. naast het feit dat het een diagnostisch hulpmiddel is, kan deze techniek ook worden gebruikt voor het verzamelen van cellen voor andere doeleinden, namelijk cytogenetica, elektronenmicroscopie (figuur 1d), flowcytometrische karakterisering4,5 ,6,7, oprichting van celculturen8. Een veelvoorkomend voorbeeld in de klinische praktijk is het ophalen van sperma voor in vitro fertilisatie9.
Aspiratie kan meerdere malen in dezelfde massa worden herhaald om meerdere uitstrijkjes te verkrijgen. In het geval van een heterogene laesie, bijvoorbeeld een vast gebied en een cystische ruimte, is het belangrijk dat cellen uit elke regio worden aangezuigen. Het materiaal verzameld door FNA is in het algemeen zeer cellulaire, die in de meeste gevallen maakt het mogelijk voor de diagnose van ziekten zonder de noodzaak voor een weefsel biopsie. Speciale vlekken, immunofluorescentie. immunocytochemie (figuur 1d) en moleculaire technieken kunnen ook worden uitgevoerd in uitstrijkjes verkregen door middel van Fna, bijvoorbeeld voor de identificatie van infectieuze agentia wanneer ze niet herkenbaar zijn door morfologie alleen10. Een beknopt overzicht van de algemene toepassingen en van de benodigde apparatuur en benodigdheden voor FNA zijn samengevat in respectievelijk tabel 1 en 2.
Het eerste rapport over het gebruik van de naald punctie voor diagnostische doeleinden wordt beschreven in vroege geschriften van de Arabische geneeskunde, maar het is in het begin van de 20e eeuw dat moderne naald aspiratie technieken werden geïmplementeerd11. Met name, misschien is het eerste rapport dat het gebruik van Fna suggereert voor de diagnose van besmettelijke ziekten een studie in 1904, waar Grieg en Gray rapporteerden naald aspiraties van lymfeklieren van patiënten met slapende ziekte onthulde motiel trypanosomen12 . De auteurs rapporteerden de aanwezigheid van trypanosomen in zowel vroege als gevorderde gevallen, en bij een hogere dichtheid dan die gezien in bloeduitstrijkjes, waar dit vaak zeldzame gebeurtenissen12zijn.
De huidige diagnose van trypanosomiasis bij rundvee berust op de directe observatie van parasieten in het bloed, lymfe of in immunodiagnostische technieken13,14,15. We hebben eerder aangetoond dat in experimentele Trypanosoma -infecties in de muis Trypanosoma brucei (T. brucei) een opmerkelijk tropisme heeft voor vetweefsel16 en ook voor enkele van de uitwendige mannelijke voortplantings structuren, namelijk epididymis17. Parasieten accumuleren in de stroma van deze weefsels in grote aantallen16.
Onderstaand protocol beschrijft een gedetailleerde stapsgewijze technische procedure voor Fna in levende muizen, gericht op de aspiratie van trypanosomen die aanwezig zijn in de uitwendige mannelijke voortplantings structuren (testis, epididymis en epididymale vet), gevolgd door conventionele cytologie en immunokleuring voor specifieke parasiet eiwitten (VSG)16,17. Aspiratie werd uitgevoerd 6 dagen na de infectie en de veiligheidsprocedures die van toepassing zijn die vaak worden vastgesteld voor routine behandeling van proefdieren. Er zijn extra maatregelen nodig voor dieren met Immuundeficiënties (het dragen van een met stoom gesteriliseerde Gown, masker, haar motorkap, steriele handschoenen, en het garanderen van een aseptische techniek te allen tijde) om onbedoelde blootstelling aan opportunistische pathogenen te beperken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fijne naald aspiratie (FNA) is een methode die op grote schaal wordt gebruikt voor de diagnose van ziekten bij mens en huisdieren. De techniek is gestandaardiseerd over vele jaren1,2, diegebruik maakt van een kleine boring naald te aspireren cellen of vloeistof uit een palpabele massa of orgaan1,3. Het aspiraat wordt dan meestal besmeurd op een glazen glijbaan en gekleurd voor microscopische observatie om een diagnose te stellen, maar de techniek kan ook worden gebruikt om cellen op te halen voor andere doeleinden4,5,6, 7 , 8 , 9.
De procedure is snel (< 5 min per muis, voor een ervaren onderzoeker) en het risico op complicaties is minimaal, vergelijkbaar met het risico dat ontstaat bij het ondergaan van een eenvoudige veneuze punctie. Om deze reden, voor FNA van palpabele massa's, anesthesie is alleen nodig voor gevoelige anatomische locaties of wanneer een goede immobilisatie van het dier en stabilisatie van het orgel of de massa te zuigen is uiterst belangrijk voor optimale resultaten. Dit is vaak voor kleine laboratoriumdieren, als veilige en effectieve terughoudendheid van een kleine knaagdier met één hand, terwijl het waarborgen van de beste toegang tot het gebied voor aspiratie met de andere hand, is moeilijk te bereiken zonder verdoving. Kortdurende anesthesie is in de meeste gevallen voldoende, niettemin noodzakelijk, voor een goede FNA in de muis. Een goede immobilisatie maximaliseert de kans op het verkrijgen van een aspiraat dat representatief is voor de cellulaire componenten van de laesie en minimaliseert ook de kans op het externaliseren van de punt van de naald terwijl negatieve druk wordt uitgeoefend.
Hoewel de procedure zelf zeer eenvoudig is, zijn de gecoördineerde toepassing en het vrijkomen van vacuüm de meest kritieke stappen. Na het inbrengen van de naald wordt de zuiger van de spuit teruggetrokken om een gecontroleerd vacuüm (zuigkracht) te bereiken en kan de naald alleen uit de massa worden verwijderd na het vrijgeven van de negatieve druk door de zuiger los te laten (Figuur 2); anders wordt de aspiraat in de loop van de spuit gezogen en is het dan zeer moeilijk om te herstellen. Een andere zeer belangrijke stap is de voorbereiding van kwalitatief hoogstaande smears. Er zijn verschillende methoden om een uitstrijkje te maken, maar ongeacht de methode moeten uitstrijkjes onmiddellijk worden bereid nadat het materiaal op het glas is geplaatst. Het biologisch materiaal moet voorzichtig worden uitgespreid om celcrush-artefacten te voorkomen. Gebruik van een dekslip als strooier kan helpen voorkomen dat deze artefacten. Echter, de toepassing van te veel kracht tijdens het maken van het uitstrijkje zal breken de dekslip. Een uitstrijkje van goede kwaliteit heeft meestal de meeste celpopulatie verdeeld als monolaag zodat ze gemakkelijk licht kunnen verzenden. Cellulair materiaal mag niet overmatig worden gevangen in het bloedstolsel.
Het doel van een FNA is om cellen te verzamelen van een massa, weefsel of orgaan. Het gebruik van grotere boring naalden is nuttig om de cellulariteit te verhogen, maar kan worden geassocieerd met overmatige bloed verontreiniging, terwijl de bemonstering met kleinere naalden hogere kwaliteit oplevert, hoewel minder overvloedig materiaal. In ons geval, percutane aspiratie van de uitwendige mannelijke voortplantings structuren bij muizen experimenteel geïnfecteerd met T. brucei, werd uitgevoerd met 22-gauge naalden gekoppeld aan een 5 ml spuit. Muizen werden verdomiliseerd, de testis werd gestabiliseerd met één hand en punctie en aspiratie geleid en uitgevoerd met de andere hand. We hebben talrijke trypanosomen vermengd met geslachtscellen, spermatozoa, epitheliale cellen en stromale cellen, die werden besmeurd en immunogekleurd voor de oppervlakte-eiwitten van de parasieten (VSG) (Figuur 4).
Er is altijd de potentiële bemonsterings fout bij aspiraties die negatieve resultaten opleveren, omdat hoewel meerdere gebieden van een bepaalde laesie meerdere keren kunnen worden bemonsterd, dit een blinde aspiratie is waarbij we de naaldpunt en het doelorgaan of de massa niet visualiseren. Dit is zeer relevant in een klinische setting, waarbij een negatief FNA-punt van een verdachte laesie geen verdere onderzoeken overbodig maakt, maar het is niet zo relevant in diermodellen van de ziekte. Algemene beperkingen omvatten dus voornamelijk vals negatieve resultaten en minder vaak vals-positieve resultaten (bijvoorbeeld van bloed verontreiniging), maar de belangrijkste beperking bij het vaststellen van dier experimenten is het gebrek aan informatie over weefsel architectuur17, zoals we hebben met Histopathologie, bijvoorbeeld distributie patroon van parasieten, van immune cellen, en cel-cel interactie functies. Niettemin, voordelen zijn dat FNA is een niet-terminale procedure waardoor de herhaalde bemonstering in hetzelfde dier over-tijd en altijd zorgt voor een beter bewaarde cellulaire morfologie (Figuur 5). Alternatieven voor FNA voor het oogsten van gastheer cellen, immuuncellen of micro-organismen van een muis vertrouw altijd op euthanatatie van de muis om de massa of de organen van belang te verzamelen.
Naar onze kennis, er zijn slechts een paar rapporten over het gebruik van FNA in kleine laboratoriumdieren, een van 1949 overeenkomend met de aspiratie van beenmerg met 22 G naald voor het bestuderen van Hematopoiesis18, en alle andere in combinatie met Flowcytometrie te Kwantificeer ofwel tumor-geassocieerde ontstekingscellen of endotheel cellen7,19,20. Ons werk toont aan dat deze techniek kan worden uitgebreid tot de diagnose en studie van infectieuze ziekte modellen en cytologie kan combineren met technieken zoals immunocytochemie of elektronenmicroscopie. Twee van de belangrijkste voordelen van de methode bij proefdieren zijn: (1) deze procedure is geen Terminal, d.w.z. kan worden uitgevoerd in levende muizen; en (2) vanwege de milde ernst maakt het mogelijk voor seriële aspiraties in hetzelfde dier. Er zijn dus minder muizen nodig voor elke studie, en de correlatie tussen progressie van klinische ziekte en evolutie van de cellulaire en moleculaire kenmerken van een ziekte en/of micro-organisme kan gemakkelijk worden uitgevoerd, waardoor longitudinale studies mogelijk zijn.
Misschien is het eerste verslag over het gebruik van Fna voor de diagnose van een besmettelijke ziekte een studie van Grieg en grijs in 1904, die de naald aspiraties van lymfeklieren rapporteert van patiënten met slaapziekte, die motiel trypanosomen12onthulde. Als onze bevindingen in laboratorium muizen vertaling naar runderen vinden, d.w.z. dat als Trypanosoma gemakkelijk door Fna kan worden bemonsterd vanuit de uitwendige mannelijke voortplantings structuren, men kan verwachten dat deze techniek nuttig zal zijn voor dierenartsen voor de diagnose van dier immunrespons in-boerderij, in vee.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door Fundação para a Ciência e a tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) via Fundos do Orçamento de Estado (Ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF is onderzoeker van de Fundação para a Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014) en het laboratorium wordt gefinancierd door ERC (FatTryp, Ref. 771714). Publicatie van dit werk werd ook gefinancierd UID/BIM/50005/2019 project gefinancierd door Fundação para a Ciência e a tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) via Fundos do Orçamento de Estado. We danken Andreia Pinto uit het laboratorium voor histologie en vergelijkende pathologie van de iMM voor deskundige elektronenmicroscopie assistentie, en Sandra Trindade, Tiago Rebelo en Henrique Machado (iMM) voor het delen van weefsels van geïnfecteerde muizen.
Materials
| Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Anesthesia reversal |
| Cover slips (24 x 60 No.1) | VWR | 631-0664 | Smear making |
| DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemistry |
| Entellan (500 mL) | VWR | 1.07961.0500 | Mounting media |
| Envision Flex antibody diluent | Dako | 8006 | Immunocytochemistry |
| EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) | Dako | K4010 | Immunocytochemistry |
| Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemistry |
| Giemsa stain | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Smear staining |
| Glass slides (Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Smear making |
| Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemistry |
| Hydrogen Peroxidase solution | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemistry |
| Hypodermic needles Microlance 3 (23G) | Henry Schein | 902-8001 | Aspiration technique |
| Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Anesthesia |
| Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Anesthesia |
| Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Smear fixative |
| Pap pen | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemistry |
| Protein Block Serum free | Dako | X0909 | Immunocytochemistry |
| Syringes (5 mL, 10 mL) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Aspiration technique |
References
- Leopold, G., Koss, M. R. M. . Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. , (2006).
- Raskin, R. E., Meyer, D. J. . Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. , (2016).
- Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185 (3), 819-824 (1992).
- Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107 (33), 14524-14529 (2010).
- Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
- Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40 (4), 307-319 (1998).
- Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
- Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43 (6), 985-990 (1999).
- Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63 (5), 1038-1042 (1995).
- Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120 (3), 351-367 (1998).
- Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47 (2), 191-197 (2009).
- Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1 (2265), 1252 (1904).
- Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47 (6), 727-734 (1972).
- Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. , 1-15 (2009).
- Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12 (2), 186-194 (2012).
- Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19 (6), 837-848 (2016).
- Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), 1-15 (2018).
- Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (2013).
- Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13 (3), 251-258 (2010).
- Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21 (7), 648-661 (2013).
