الكشف عن طفيليات التربانوسوما خارج الأوعية الدموية عن طريق الشفط الإبرة الدقيقة
Summary
غرامة إبرة الطموح هو تقنية، حيث يتم الحصول على الخلايا من آفة أو عضو باستخدام إبرة رقيقة. يتم تشويه المواد المستنشقة، ملطخة وفحصها تحت المجهر للتشخيص أو استخدامها للبيولوجيا الجزيئية، قياس الخلايا أو التحليل في المختبر. انها رخيصة وبسيطة وسريعة ويسبب الحد الأدنى من الصدمة.
Abstract
الشفط بالإبرة الجميلة (FNA) هو إجراء تشخيصي روتيني ضروري لكل من الممارسات الطبية والبيطرية. وهو يتألف من الطموح عن طريق الجلد من الخلايا و / أو الكائنات الحية الدقيقة من الجماهير واضح، والأعضاء أو الانصباب (تراكم السوائل في تجويف الجسم) باستخدام إبرة رقيقة مماثلة للإبرة العادية المستخدمة للثقب الوريدي. المواد التي تم جمعها من قبل FNA بشكل عام الخلوية للغاية، ويتم تشويه النستناس المستردة ثم، والهواء المجفف، الرطب الثابتة، ملطخة ولاحظ تحت المجهر. في السياق السريري، FNA هو أداة تشخيصية هامة التي تعمل كدليل للإدارة العلاجية المناسبة. ولأنها بسيطة وسريعة وطفيفة التوغل وتتطلب استثمارات محدودة في المختبر والموارد البشرية، فإنها تستخدم على نطاق واسع من قبل الممارسين البيطريين، ومعظمهم في المنازل، ولكن أيضا في الحيوانات الزراعية. في الدراسات التي تستخدم النماذج الحيوانية، FNA لديه ميزة أنه يمكن القيام به مرارا وتكرارا في نفس الحيوان، مما يتيح الدراسات الطولية من خلال جمع الخلايا من الأورام والأعضاء / الأنسجة على مدى المرض. بالإضافة إلى الفحص المجهري الروتيني، يمكن أيضا استخدام المواد المستردة لالكيمياء المناعية، المجهر الإلكتروني، التحليل البيوكيميائي، قياس التدفق الخلوي، البيولوجيا الجزيئية أو الاختبارات المختبرية. وقد استخدمت FNA لتحديد الطفيلي البروتوزوان تريبانوسوما بروسي في الغدد التناسلية للفئران المصابة، وفتح إمكانية لتشخيص في المستقبل في الماشية.
Introduction
يستخدم على نطاق واسع الشفط إبرة غرامة (FNA) في تشخيص السرطان والأمراض غير الأورام، سواء في الحيوانات البشرية والمنزلية. وقد تم توحيد هذه التقنية على مرالسنين، ويرد وصفها في العديد من الكتب المدرسية 1،2.
وهو يتكون إلى حد كبير من الطموح عن طريق الجلد من الجماهير واضح، والأعضاء أو الانصباب مع إبرة رقيقة تركيبها على حقنة فارغة، وذلك باستخدام الضغط السلبي لسحب الخلايا أو السوائل من كتلة1،3. الإبر هي عادة 22 إلى 25 G (قياس المقابلة للقطر الداخلي إبرة)، واستخدام إبرة تتحمل أكبر (قطر كبير، على سبيل المثال، 21 G) مفيد لزيادة الخلوية، على الرغم من أن هذا يمكن أن تنتج تلوث الدم المفرط. طول إبرة سوف تعتمد على عمق الكتلة ولكن 1 أو 1 1 × بوصة يستخدم عادة للجماهير السطحية. المحاقن عادة ما تكون 5 إلى 10 مل، مع محاقن أكبر تحقيق فراغ أعلى، مما يزيد بدوره من العائد يستنشق. كما يمكن أيضًا استنشاق الكتل العميقة الجذور غير الملموسة، مع الإبر الأطول وتحت توجيه الصورة (التصوير بالموجات فوق الصوتية). ويمكن بعد ذلك تشويه النقاق المستردة، والهواء المجفف، الرطب الثابتة، وملطخة ولاحظ تحت المجهر لتحقيق التشخيص3 (الشكل1).
هذا هو أسلوب بسيط، غير مكلفة، غير مؤلم ة طفيفة التوغل تستخدم أساسا في إعداد ما قبل الجراحة لتحقيق التشخيص على الجماهير واضح وأيضا للأعضاء، مثل الغدد الليمفاوية، الغدة الدرقية، البروستاتا أو حتى الهياكل التناسلية الذكور الخارجية 1.بالإضافة إلى كونها أداة تشخيصية، يمكن استخدام هذه التقنية لجمع الخلايا لأغراض أخرى أيضا، وهي علم الوراثة الخلوية، المجهر الإلكتروني (الشكل1D)،تدفق التوصيف الخلوي4،5 ،6،7، إنشاء الثقافات الخلية8. ومن الأمثلة الشائعة في الممارسة السريرية استرجاع الحيوانات المنوية للإخصاب في المختبر9.
يمكن تكرار الطموح عدة مرات في نفس الكتلة للحصول على مسحات متعددة. في حالة وجود آفة غير متجانسة ، على سبيل المثال ، منطقة صلبة ومساحة كيسية ، من المهم أن يتم استنشاق الخلايا من كل منطقة. المواد التي تجمعها FNA بشكل عام الخلوية للغاية، والذي يسمح في معظم الحالات لتشخيص الأمراض دون الحاجة إلى خزعة الأنسجة. بقع خاصة، الفلورة المناعية. الكيمياء المناعية (الشكل1D)،ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ التقنيات الجزيئية في مسحات التي تم الحصول عليها من خلال FNA، على سبيل المثال، لتحديد العوامل المعدية عندما لا يمكن التعرف عليها من قبل مورفولوجيا وحدها10. ويرد في الجدولين 1 و2، على التوالي، موجز لمحة عامة عن التطبيقات العامة والمعدات واللوازم اللازمة لـ FNA.
ويرد وصف التقرير الأول عن استخدام ثقب الإبرة لأغراض التشخيص في الكتابات المبكرة للطب العربي، ولكن في أوائل القرن العشرين تم تنفيذ تقنيات التطلع بالإبرة الحديثة11. وتجدر الإشارة إلى أن التقرير الأول الذي يشير إلى استخدام FNA لتشخيص الأمراض المعدية كان دراسة في عام 1904، حيث أبلغ جريج وغراي عن تطلعات إبرة العقد الليمفاوية من المرضى الذين يعانون من مرض النوم كشفت موتيلي تريبانوسومس12 . وأفاد المؤلفون بوجود التربانوسوم في كل من الحالات المبكرة والمتقدمة، وفي كثافة أعلى من تلك التي شوهدت في مسحات الدم، حيث تكون هذه في كثير من الأحيان أحداث نادرة12.
التشخيص الحالي لداء المثقبيات في الماشية يعتمد على المراقبة المباشرة للطفيليات في الدم أو الليمفاوية أو في تقنيات التشخيص المناعي13،14،15. لقد أظهرنا سابقا أنه في العدوى التربانوموسوما التجريبية في الماوس، تريبانوسوما بروسي (T.بروسي)لديه تروبيسم ملحوظا لالدهنية الأنسجة16 وأيضا لبعض الهياكل التناسلية الذكور الخارجية، وهي البربخ17. تتراكم الطفيليات في ستروما من هذه الأنسجة بأعداد كبيرة16.
يصف البروتوكول الموضح أدناه إجراءً تقنياً مفصلاً خطوة بخطوة لـ FNA في الفئران الحية، يهدف إلى طموح التربانوسوم الموجود ة في الهياكل التناسلية الخارجية للذكور (الخصية، والبربخ، والدهون الميبيدية)، تليها علم الخلايا التقليدي وتلطيخ المناعة لبروتينات طفيلية محددة (VSG)16،17. تم إجراء الطموح بعد 6 أيام من العدوى وإجراءات السلامة التي تنطبق هي تلك التي أنشئت عادة للتعامل الروتيني مع الحيوانات التجريبية. يلزم اتخاذ تدابير إضافية للالحيوانات التي تعاني من نقص المناعة (ارتداء ثوب معقم بالبخار، قناع، غطاء محرك السيارة الشعر، قفازات معقمة، وضمان تقنية العقيم في جميع الأوقات) للتخفيف من التعرض العرضي للأمراض الانتهازية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الشفط بالإبرة الجميلة (FNA) هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لتشخيص المرض في الحيوانات البشرية والمنزلية. وقد تم توحيد هذه التقنية على مدى سنوات عديدة1،2، مما يجعل استخدام إبرة صغيرة تتحمل لاستنشاق الخلايا أو السوائل من كتلة واضحة أو الجهاز1،3. ثم يتم تشويه النقاق عادة على شريحة زجاجية وملطخة للمراقبة المجهرية لتحقيق التشخيص،ولكن يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لاسترداد الخلايا لأغراض أخرى 4،5،6، 7 , 8 , 9.
الإجراء سريع (<5 دقيقة لكل فأر، بالنسبة للباحث من ذوي الخبرة) وخطر المضاعفات هو الحد الأدنى، على غرار المخاطر التي تحدث عند التعرض لثقب وريدي بسيط. لهذا السبب، لFNA من الجماهير واضح، مطلوب التخدير فقط للمواقع التشريحية الحساسة أو عندما تجميد جيد للحيواني وتثبيت الجهاز أو الكتلة التي سيتم استنشاقها أمر بالغ الأهمية للحصول على النتائج المثلى. هذا هو متكررة لالحيوانات مختبر صغير، وضبط النفس آمنة وفعالة من القوارض الصغيرة بيد واحدة مع ضمان أفضل الوصول إلى المنطقة للتطلعات من ناحية أخرى، من الصعب تحقيق دون تخدير. التخدير على المدى القصير هو في معظم الحالات كافية، ومع ذلك من الضروري، لFNA جيدة في الماوس. تجميد جيد يزيد من فرص الحصول على النقاس الذي يمثل المكونات الخلوية للآفة، ويقلل أيضا من فرص خارج طرف الإبرة في حين يتم تطبيق الضغط السلبي.
على الرغم من أن الإجراء نفسه بسيط جدا، وتطبيق منسق وإطلاق الفراغ هي الخطوات الأكثر أهمية. بعد إدخال الإبرة ، يتم سحب الغطاس من المحاقن لتحقيق فراغ تسيطر عليها (شفط) ، ويمكن إزالة الإبرة فقط من الكتلة بعد الإفراج عن الضغط السلبي عن طريق التخلي عن الغطاس (الشكل 2) ؛ وإلا يتم امتصاص النستنس في برميل من الحقنة ومن ثم من الصعب جدا لاسترداد. وثمة خطوة أخرى هامة جدا هي إعداد مسحات عالية الجودة. هناك طرق مختلفة لجعل تشويه ولكن بغض النظر عن الطريقة، يجب إعداد مسحات مباشرة بعد أن وضعت المواد على الزجاج. يجب أن تنتشر المواد البيولوجية بلطف لتجنب القطع الأثرية سحق الخلية. استخدام غطاء كما المنشر يمكن أن تساعد على منع هذه القطع الأثرية. ومع ذلك، فإن تطبيق الكثير من القوة في حين جعل تشويه كسر غطاء. مسحة ذات نوعية جيدة وعادة ما يكون معظم السكان الخلية موزعة على أنها أحادية الطبقة بحيث يمكن بسهولة نقل الضوء. يجب ألا تكون المواد الخلوية عالقة بشكل مفرط في جلطة الدم.
الهدف من FNA هو جمع الخلايا من كتلة أو أنسجة أو عضو. استخدام إبر تتحمل أكبر مفيد لزيادة الخلوية، ولكن يمكن أن تكون مرتبطة بالتلوث المفرط في الدم، في حين أن أخذ العينات مع الإبر الصغيرة تسفر عن جودة أعلى، على الرغم من مواد أقل وفرة. في حالتنا، تم تنفيذ الطموح عن طريق الجلد من الهياكل التناسلية الذكور الخارجية في الفئران المصابة تجريبيا مع T. بروسي، مع الإبر قياس 22 إلى جانب حقنة 5 مل. تم التخدير الفئران، واستقرت الخصية بيد واحدة وثقب والطموح الموجهة وتنفيذها من ناحية أخرى. لقد استرجعنا العديد من التربانوسوم اتاصالها مع الخلايا الجرثومية والحيوانات المنوية والخلايا الظهارية والخلايا السترومة، التيتم تشويهها وملطخة بالمناعة للبروتينات السطحية للطفيليات (VSG) (الشكل 4).
هناك دائما خطأ أخذ العينات المحتملة في يستنشق تسفر عن نتائج سلبية لأنه على الرغم من أن مناطق متعددة من آفة معينة يمكن أخذ عينات عدة مرات، وهذا هو طموح أعمى حيث أننا لا تصور طرف إبرة والجهاز المستهدف أو كتلة. هذا هو ذات الصلة للغاية في بيئة سريرية، حيث FNA السلبية من آفة مشبوهة لا يتفادى المزيد من التحقيقات، لكنها ليست ذات الصلة حتى في النماذج الحيوانية للمرض. وهكذا، تشمل القيود العامة النتائج السلبية الكاذبة بشكل رئيسي، ونتائج إيجابية كاذبة أقل تواترا (على سبيل المثال، من تلوث الدم)، ولكن أهم قيد في وضع التجارب الحيوانية هو عدم وجود معلومات عن الأنسجة الهندسة المعمارية17، كما هو الحال مع علم أمراض الأنسجة ، على سبيل المثال نمط توزيع الطفيليات ، من الخلايا المناعية ، وملامح التفاعل الخلية الخلية. ومع ذلك، فإن المزايا هي أن FNA هو إجراء غير المحطة الطرفية يسمح لأخذ العينات المتكررة في نفسالحيوان على مر الزمن ويسمح دائما لمورفولوجيا الخلوية الحفاظ عليها بشكل أفضل (الشكل 5). بدائل FNA لحصاد الخلايا المضيفة، والخلايا المناعية أو الكائنات الحية الدقيقة من الماوس تعتمد دائما على القتل الرحيم الماوس لجمع الكتلة أو الأجهزة ذات الأهمية.
على حد علمنا، هناك فقط عدد قليل من التقارير عن استخدام FNA في الحيوانات مختبر صغير، واحد من عام 1949 المقابلة لطموح نخاع العظام مع إبرة 22 G لدراسة الهيماتوبويز18،وجميع أخرى في تركيبة مع تدفق قياس السيتومترية إلى تحديد كمية إما الخلايا الالتهابية المرتبطة بالورم أو الخلايا البطانية7،19،20. ويبين عملنا أن هذه التقنية يمكن أن تمتد إلى تشخيص ودراسة نماذج الأمراض المعدية ويمكن الجمع بين علم الخلايا مع تقنيات مثل الكيمياء المناعية أو المجهر الإلكتروني. وتتمثل ميزتان رئيسيتان للطريقة في الحيوانات التجريبية فيما يلي: (1) أن هذا الإجراء ليس نهائيا، أي يمكن أن يتم في الفئران الحية؛ (2) هذا الإجراء ليس نهائيا. و(2) نظرا لشدته خفيفة فإنه يسمح للتطلعات التسلسلية في نفس الحيوان. وبالتالي هناك حاجة إلى عدد أقل من الفئران لكل دراسة، ويمكن بسهولة إجراء العلاقة بين تطور المرض السريري وتطور السمات الخلوية والجزيئية للمرض و/أو الكائنات الدقيقة، مما يتيح إجراء دراسات طولية.
ولعل التقرير الأول عن استخدام FNA لتشخيص الأمراض المعدية هو دراسة من قبل Grieg وغراي في عام 1904 أن تقارير تطلعات إبرة من الغدد الليمفاوية من المرضى الذين يعانون من مرض النوم، والتي كشفت مجانب trypanosomes12. إذا وجدت النتائج التي توصلنا إليها في الفئران المختبرية ترجمة إلى الماشية، أي أنه إذا كان يمكن بسهولة أخذ عينات من التريبانوسوما من قبل FNA من الهياكل التناسلية الخارجية للذكور، يمكن للمرء أن يتوقع أن هذه التقنية ستكون مفيدة للأطباء البيطريين لتشخيص الحيوان التريبنوموسوميافية في المزرعة، في الثروة الحيوانية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا المشروع من قبل مؤسسة المأكولات الخاصة بالتكنولوجا/وزارة المأكولات المركزية، وشركة Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) من خلال Fundos do Orçamento de Estado (المرجع: ID/BIM/50005/2019). ومختبر اللوازم المالية هو محقق في مؤسسة العلوم والتكنولوجيا (IF/01050/2014) ويمول المختبر من قبل المركز (FatTryp, ref.771714). كما تم تمويل نشر هذا العمل من خلال صندوق الأمم المتحدة للمشاريع التي تمولها مؤسسة المأكولات الخاصة/وزارة الضمانات، وشركة Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) من خلال صندوق خدمات المنظمات غير الحكومية. نشكر أندريا بينتو من مختبر علم الأنسجة وعلم الأمراض المقارنة في iMM للمساعدة في الفحص المجهري الإلكترون الخبراء، وساندرا ترينداد، تياغو ريبيلو وهنريك ماتشادو (iMM) لتقاسم الأنسجة من الفئران المصابة.
Materials
| Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Anesthesia reversal |
| Cover slips (24 x 60 No.1) | VWR | 631-0664 | Smear making |
| DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemistry |
| Entellan (500 mL) | VWR | 1.07961.0500 | Mounting media |
| Envision Flex antibody diluent | Dako | 8006 | Immunocytochemistry |
| EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) | Dako | K4010 | Immunocytochemistry |
| Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemistry |
| Giemsa stain | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Smear staining |
| Glass slides (Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Smear making |
| Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemistry |
| Hydrogen Peroxidase solution | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemistry |
| Hypodermic needles Microlance 3 (23G) | Henry Schein | 902-8001 | Aspiration technique |
| Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Anesthesia |
| Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Anesthesia |
| Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Smear fixative |
| Pap pen | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemistry |
| Protein Block Serum free | Dako | X0909 | Immunocytochemistry |
| Syringes (5 mL, 10 mL) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Aspiration technique |
References
- Leopold, G., Koss, M. R. M. . Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. , (2006).
- Raskin, R. E., Meyer, D. J. . Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. , (2016).
- Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185 (3), 819-824 (1992).
- Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107 (33), 14524-14529 (2010).
- Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
- Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40 (4), 307-319 (1998).
- Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
- Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43 (6), 985-990 (1999).
- Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63 (5), 1038-1042 (1995).
- Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120 (3), 351-367 (1998).
- Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47 (2), 191-197 (2009).
- Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1 (2265), 1252 (1904).
- Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47 (6), 727-734 (1972).
- Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. , 1-15 (2009).
- Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12 (2), 186-194 (2012).
- Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19 (6), 837-848 (2016).
- Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (8), 1-15 (2018).
- Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4 (5), 557-561 (2013).
- Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13 (3), 251-258 (2010).
- Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21 (7), 648-661 (2013).
