Мы клонируем и анализируем гены репортеров, генерирующие круговые РНК. Эти гены репортеров больше, чем конструкции для анализа линейного сращивания и содержат элементы Alu. Для исследования циркулярных РНК конструкции трансфицируются в клетки и в результате РНК анализируется с помощью РТ-ПЦР после удаления линейной РНК.
В дополнение к линейным мРНК, многие эукариотические гены генерируют круглые РНК. Большинство круглых РНК генерируются путем присоединения 5′ сращивания сайта с вверх по течению 3 ‘ сращивания сайта в рамках предварительной мРНК, процесс, называемый обратно-сплайсинг. Эта круговая речь, вероятно, способствует вторичных структур в предварительном MRNA, которые приносят сращивания сайтов в непосредственной близости. В человеческих генах, Элементы Alu, как полагают, способствуют эти вторичные структуры РНК, как Алу элементы в изобилии и экспонат базы взаимодополняемости друг с другом, когда присутствуют в противоположных направлениях в предварительном mRNA. Здесь мы описываем генерацию и анализ большого элемента Алу, содержащего репортёрские гены, образующие круглые РНК. Благодаря оптимизации протоколов клонирования могут образоваться гены репортеров длиной до 20 кб. Их анализ в экспериментах по сотрансфокации позволяет выявить регуляторные факторы. Таким образом, этот метод может определить последовательности РНК и клеточных компонентов, участвующих в круговой рнкобразования.
Круговые РНК
Круговые РНК (циркрнки) являются ковалентно закрытыми одноцепочечными РНК, которые выражаются в большинстве организмов. Они генерируются путем присоединения вниз по течению 5 ‘ сращивания сайт вверх по течению 3 ‘ сращивания сайта, процесс называется обратно-сращивания (Рисунок 1А)1. Последовательности в pre-mRNA, которые демонстрируют базу, дополняемую как короткие, как 30-40 nt принести обратно-сращивания сайтов в надлежащее выравнивание для формирования циркрнки2. У людей, Alu элементы1, представляющие около 11% генома3, образуют обширные двойные структуры РНК в предварительном mRNA из-за их самокомплементи4,5 и тем самым способствовать образованиюциркрнки 1.
В настоящее время описаны три основные функции циркрнки. Некоторые циркрнки связывают микроРНК (миРНК) и через секвестр действуют как губки miRNA6. CircRNAs были вовлечены в транскрипционной и после транскрипции регулирования, через конкуренцию с линейным сращивания7 или модуляции транскрипции фактор деятельности8. Наконец, циркорные системы содержат короткие открытые рамки для чтения, и доказательства принципиальных исследований показывают, что их можно перевести9,10. Тем не менее, функция большинства циркрнок остается загадочной. Большинство круглых РНК были обнаружены с использованием методов секвенирования следующего поколения11. Детальный анализ отдельных генов с использованием целевых подходов RT-PCR показывает, что большое количество круговых РНК еще предстоит обнаружить12.
Использование генов репортеров для анализа обработки предварительной мРНК
Анализ мРНК, полученных из ДНК-репортер агонстративных транссексуалов в клетки является устоявшимся методом для изучения альтернативных пре-мРНК сращивания, которые могут быть применены к круговой РНК. В общем, альтернативный экзон, окружающие его интроны и составные экзоны усиливаются и клонируются в вектор эукариотического выражения. Часто интроны сокращаются. Конструкции трансфицируются в эукариотические клетки и обычно анализируются RT-PCR13,14. Этот подход широко используется для картирования нормативных сращивания сайтов и транс-действующих факторов в экспериментах по со-трансфекции13,15,16,17,18. Кроме того, генерация белково-выражающих минигенов допускается скрининг веществ, которые меняют альтернативное сращивание19,20.
Метод применяется к циркулярным РНК. В настоящее время, по крайней мере 12 минигенных позвоночников были описаны в литературе и кратко изложены в таблице 1. За исключением системы экспрессии на основе tRNA21,22, все они зависят от промоутеров полимераза II. Здесь мы описываем метод генерации минигенов репортера для определения циси и транс-действующих факторов, участвующих в генерации круговых РНК. Обзор метода с использованием последовательностей опубликованного гена репортера23 показан на рисунке 1.
В целом, круговые РНК являются низкими обильными1,что усложняет изучение их функции и формирования. Подобно линейным РНК13,использование репортера minigenes позволяет определить cis и транс-действующих факторов, которые регулируют формирование круговых РНК. Таким о…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Министерством обороны Министерства обороны грант a180075. Stefan Stamm благодарит фонд Jacqueline Noonan. Анна Павлючина была поддержана DAAD, немецкая программа академического обмена, Джастин Р. Уэлден был получателем Университета Кентукки Макс Стеклер премии.
(PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
Builder tool | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
Enzymatic DNA assembly kit | NEB | E2621S | |
Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9282 | |
Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
pcDNA3.1 cloning site | Polycloning site | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polymerase |
Polymerase 2 | Biorad | 1725310 | Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad) |
Polymerase 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen long range polymerase kit |
Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18080044 | |
RNA isolation kit | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
Stable competent cells | NEB | C3040H | NEB stable cells |
Standard cloning bacteria | NEB | C2988J | NEB5-alpha competent |
Web tool to design primers | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
Web-based temperature calculations | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |